曲朝陽，賈曉昀，馬啟峰，王寒濤，魏恒玲，范術(shù)麗*

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所/棉花生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 安陽455000；2.河北省農(nóng)林科學(xué)院糧油作物研究所，石家莊050035）

鈴重是構(gòu)成棉花產(chǎn)量的基本因子之一[1]。在穩(wěn)定衣分和單位面積總鈴數(shù)的基礎(chǔ)上，若能穩(wěn)步提高鈴重，可進(jìn)一步提高棉花產(chǎn)量[2]。

鈴重既受品種遺傳控制，也受栽培技術(shù)、環(huán)境條件等因素的影響。僅依靠傳統(tǒng)育種定向提高鈴重，不但具有一定的盲目性而且育種周期較長(zhǎng)[3]，嚴(yán)重制約選育高鈴重材料的進(jìn)程。近年來，隨著生物技術(shù)的快速發(fā)展，分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)在作物育種上的應(yīng)用研究也日益深入[4-6]。開發(fā)與鈴重相關(guān)的分子標(biāo)記需要尋找有效的數(shù)量性狀位點(diǎn)（Quantitative trait loci，QTL）。李成奇等[7]利用F2:3群體定位到2個(gè)鈴重QTL，分布于A10和A12染色體，解釋的表型變異率為6.1%～7%。王婷[8]利用F2群體和F2:3群體分別定位到4個(gè)和1個(gè)鈴重QTL，解釋的表型變異率為2.7%～10.6%；Wu等[9]利用重組自交系（Recombinant inbred lines，RILs）群體定位到3個(gè)鈴重QTL，解釋的表型變異率為7.3%～11.7%；Wang等[10]利用180個(gè)家系組成的RILS群體定位到5個(gè)鈴重QTL，解釋的表型變異率為4.83%～9.66%；Zhang等[11]利用115個(gè)家系組成的BC3F2回交群體，在4個(gè)環(huán)境下共定位到51個(gè)鈴重QTL，解釋的表型變異率為1.02%～13.23%；Fan等[12]利用143個(gè)家系組成的RILS群體，在3個(gè)環(huán)境下共定位到10個(gè)鈴重QTL，解釋的表型變異率為0.97%～19.77%；Yu等[13]利用146個(gè)家系組成的BC2F4回交群體，在4個(gè)環(huán)境下共定位到10個(gè)鈴重QTL，解釋的表型變異率為8.48%～25.27%；Zhang等[14]利用196個(gè)家系組成的RILS群體，在11個(gè)環(huán)境下共定位到146個(gè)鈴重QTL，分布于25條染色體，最高可解釋的表型變異率為16.70%。這些QTL為分析鈴重遺傳機(jī)理提供了依據(jù)。同時(shí)，利用與鈴重QTL緊密連鎖的遺傳標(biāo)記，并結(jié)合田間表型數(shù)據(jù)進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇育種，能有效減少連鎖累贅，提高對(duì)鈴重選擇的準(zhǔn)確性，這對(duì)提高棉花產(chǎn)量育種的效率意義重大。

本研究以分辨率高、重復(fù)性好的RILs為作圖群體，構(gòu)建以SNP（Single nucleotide polymorphisms）為主要標(biāo)記的遺傳連鎖圖譜，結(jié)合田間多年的鈴重?cái)?shù)據(jù)，檢測(cè)與鈴重相關(guān)的主效QTL，以期為棉花高產(chǎn)育種提供一定的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 親本及作圖群體

本研究以陸地棉品種中棉所36為母本、海島棉染色體片段漸滲系材料G2005為父本配制雜交組合，2006年于河南安陽（AY）經(jīng)去雄、授粉，收獲F1種子，當(dāng)年冬天于海南加代、自交；2007年于安陽種植F2，通過連續(xù)多代自交，于2010年構(gòu)建成包含137個(gè)株系的F2:9RILs群體[15]。2011―2015年連續(xù)5年在安陽種植，采用完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，設(shè)3次重復(fù)，單行區(qū)，行長(zhǎng)4 m，行距0.8 m，株距20 cm，田間種植均按照農(nóng)場(chǎng)標(biāo)準(zhǔn)化管理。

1.2 遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建

采集雙親及137個(gè)株系幼嫩葉片，采用CTAB（Hexadecyl trimethyl ammonium bromide）法[16]提取DNA，送至深圳華大基因，采用RAD-seq（Restriction-site associated DNA sequencing）測(cè)序技術(shù)對(duì)親本及群體進(jìn)行100 bp的雙末端測(cè)序[17-18]；篩選親本間的SNP，結(jié)合楊繼龍[15]篩選的SSR標(biāo)記，采用HighMap策略進(jìn)行遺傳圖譜構(gòu)建[19]。

1.3 數(shù)據(jù)分析及QTL定位

吐絮盛期，在取樣行采摘50個(gè)正常吐絮的中上部棉鈴，曬干稱重，3個(gè)重復(fù)的平均值為當(dāng)年鈴重?cái)?shù)據(jù)。用Excel 2007對(duì)群體的鈴重進(jìn)行基本統(tǒng)計(jì)分析，包括均值、最大值、最小值、方差、變異系數(shù)、峰度、偏度等。利用WinQTLCart 2.5軟件和復(fù)合區(qū)間作圖法[20]進(jìn)行QTL定位及多環(huán)境均值聯(lián)合分析，窗口大小為5 cM，步長(zhǎng)為1 cM，背景標(biāo)記為10個(gè)，LOD值為2.5。以下模式為QTL命名的標(biāo)準(zhǔn)[21]：q＋性狀名稱英文縮寫＋染色體序號(hào)＋QTL編號(hào)。如qBW-A3-1表示位于A3染色體的第1個(gè)控制鈴重的QTL。

2 結(jié)果與分析

2.1 親本及群體性狀的表型分析

5個(gè)環(huán)境下分別選取親本及RILs群體株系的優(yōu)質(zhì)棉鈴，稱重并統(tǒng)計(jì)。結(jié)果表明5個(gè)環(huán)境下兩親本的鈴重差異均顯著或極顯著（表1），為鈴重QTL的分子標(biāo)記篩選提供較好的遺傳基礎(chǔ)。不同年份群體平均值表現(xiàn)不同的分離模式，高于或低于低值親本。5個(gè)環(huán)境下，137個(gè)株系中所獲得的鈴重?cái)?shù)據(jù)有較大波動(dòng)，除2014年安陽鈴重的峰度外，偏度及峰度的絕對(duì)值都小于1，基本符合正態(tài)分布（圖1），這表明鈴重受微效多基因控制，符合數(shù)量性狀遺傳模型，可以用來進(jìn)行QTL定位研究。在RILs群體中，鈴重表現(xiàn)明顯的雙向超親分離現(xiàn)象，最大值均高于高值親本，說明分離群體中含有高鈴重材料，可以通過聚合育種或分子標(biāo)記輔助選擇育種選育高鈴重品種。

表1 5個(gè)環(huán)境下重組自交系群體及親本的鈴重表現(xiàn)Table 1 Boll weight of RILs population and their parents in five environments

圖1 2011―2015年RILs群體鈴重分布圖Fig.1 Distribution of boll weight of RILs population in five environments

2.2 遺傳圖譜構(gòu)建

親本中棉所36和G2005測(cè)序深度分別為6.43×和10.57×，Q30值分別達(dá)到89.75%和90.95%；重組自交系群體平均每個(gè)株系測(cè)序深度約4.59×，Q30值為86.38%。通過與陸地棉參考基因組比對(duì)[22]，共得到369 223個(gè)SNP，其中親本間的多態(tài)性SNP有78 127個(gè)，多態(tài)性比例達(dá)到21.16%[23-24]。結(jié)合多態(tài)性SSR（Simple sequence repeat）標(biāo)記[15]，構(gòu)建1張包含6 434個(gè)位點(diǎn)的高密度遺傳圖譜（表2），圖譜中包含6 295個(gè)SNP標(biāo)記和139個(gè)SSR標(biāo)記，總遺傳圖距為4 071.98 cM，標(biāo)記間平均距離為0.63 cM，標(biāo)記間最大距離為18.24 cM，是目前陸地棉種內(nèi)標(biāo)記密度最大的圖譜之一[25-26]。

2.3 鈴重性狀的QTL定位

5個(gè)環(huán)境共檢測(cè)到32鈴重QTL（表3，圖2）。其中，能在不同年份被檢測(cè)到的有5個(gè)，分別為qBW-A4-1、qBW-A4-2、qBW-A5-2、qBW-D9-1和qBW-D9-2。qBW-A4-1在2013年和2015年均被檢測(cè)到，加性效應(yīng)值為－0.14～－0.15，解釋的表型變異率為5.07%～9.79%。qBW-A5-2在2011年和2012年均被檢測(cè)到，加性效應(yīng)值為－0.12～－0.15，解釋的表型變異率為6.32%～7.73 %；qBW-A4-2在2011年和2012年均被檢測(cè)到，加性效應(yīng)值為－0.20～－0.29，解釋的表型變異率均達(dá)到15.8%，增效基因都來自高值親本G2005，可能為多環(huán)境下較為穩(wěn)定的主效QTL；qBW-D9-1和qBW-D9-2在2013年和2014年均被檢測(cè)到，加性效應(yīng)值分別為－0.13～－0.14和－0.13，解釋的表型變異率依次為6.73%～7.35%和5.52%～6.78%。多數(shù)檢測(cè)到的QTL為主效QTL，說明鈴重可能受主基因和微效多基因共同控制。在所檢測(cè)的QTL中，26個(gè)來自父本G2005，占81.3%；6個(gè)來自母本中棉所36，占18.7%。由于高代RILs群體后代趨于純合，顯性及與顯性相關(guān)的上位性隨著同質(zhì)性的增加逐漸消失，遺傳效應(yīng)主要表現(xiàn)為加性效應(yīng)[27]。

表2 遺傳圖譜詳細(xì)信息統(tǒng)計(jì)Table 2 Detail information of the genetic map

表3 5個(gè)環(huán)境中檢測(cè)到的鈴重QTLsTable 2 Detection of QTLs associated with boll weight in five different environments

圖2 鈴重QTL定位結(jié)果Fig.2 The results of QTL mapping for boll weigh

圖2 （續(xù)）Fig.2(Continued)

利用5個(gè)環(huán)境下的數(shù)據(jù)平均值進(jìn)行分析，共檢測(cè)到9個(gè)鈴重相關(guān)QTL（表4，圖2）。qBW-A4-1、qBW-A4-2、qBW-A5-2加性效應(yīng)值分別為－0.12、－0.14和－0.09，解釋的表型變異率分別為9.27%、11.92%和5.04%。這3個(gè)QTL在單環(huán)境聯(lián)合分析中也被檢測(cè)到，說明這些位點(diǎn)穩(wěn)定性較好。qBW-A7-1和qBW-A7-2在單環(huán)境聯(lián)合分析中也被檢測(cè)到，加性效應(yīng)值分別為－0.10和－0.13，解釋的表型變異率分別為5.08%和9.62%。在A4和A7兩條染色體上各檢測(cè)到3個(gè)QTL，推測(cè)這兩條染色體與鈴重關(guān)系較為密切。

表4 利用5個(gè)環(huán)境中鈴重?cái)?shù)據(jù)平均值檢測(cè)到的QTLsTable 4 Detection of QTLs associated with boll weight basing on averages of the five environments

3 討論

3.1 海陸雜交的RILs群體適合QTL定位

由于陸陸雜交群體遺傳背景單一，同質(zhì)性強(qiáng)，后代遺傳變異范圍較小[28]，因此該研究采用陸地棉中棉所36和海島棉漸滲系G2005構(gòu)建RILs群體，從而增加了群體的多態(tài)性。每個(gè)家系由F2個(gè)體經(jīng)過多年連續(xù)自交得到，家系間基因型各異，群體內(nèi)鈴重?cái)?shù)據(jù)近似正態(tài)分布，符合數(shù)量性狀遺傳的特點(diǎn)。RILs群體重組程度高于F2群體，其遺傳圖譜比F2群體有著更高的解析度，提高了作圖的精確度。每個(gè)家系基因型純合穩(wěn)定，可在多個(gè)環(huán)境下進(jìn)行表型鑒定，這些對(duì)獲得穩(wěn)定準(zhǔn)確的QTL意義重大。

3.2 SNP標(biāo)記構(gòu)建的遺傳圖譜利于QTL定位

陸地棉基因組大，遺傳背景復(fù)雜，重復(fù)序列多，標(biāo)記開發(fā)較困難。SNP標(biāo)記是基因組中數(shù)量最多、分布最均勻、多態(tài)性最高的分子標(biāo)記[29]；相對(duì)于SSR標(biāo)記，它的遺傳穩(wěn)定性更好，易實(shí)現(xiàn)分析自動(dòng)化，是構(gòu)建遺傳圖譜理想的分子標(biāo)記[30]。隨著測(cè)序成本的不斷降低，SNP標(biāo)記將在分子標(biāo)記輔助選擇育種中發(fā)揮更大的作用。本研究總共得到369 223個(gè)SNP，親本間具有多態(tài)性的有78 127個(gè)，多態(tài)性標(biāo)記的比例達(dá)到21.16%，遠(yuǎn)大于常規(guī)SSR標(biāo)記的多態(tài)性標(biāo)記比例。利用SNP數(shù)據(jù)和SSR標(biāo)記相結(jié)合構(gòu)建的遺傳圖譜，不僅提高了圖譜的密度和覆蓋度，也間接比較了圖譜的準(zhǔn)確性[31-32]，因此定位的QTL結(jié)果更可信。中棉所36和G2005的測(cè)序深度分別為6.43×和10.57×，可能是兩者在遺傳背景上存在部分差異。2個(gè)材料的生育期、開花期、吐絮期、果枝始節(jié)等性狀也存在差異[23]，進(jìn)一步說明兩者基因組成有一定差異。RAD-seq是1種對(duì)酶切產(chǎn)生的基因組標(biāo)簽序列進(jìn)行高通量測(cè)序的技術(shù)，測(cè)序深度相差較大可能是由于不同材料基因組酶切位點(diǎn)分布及數(shù)量不同，但是本研究中的測(cè)序深度可以滿足后續(xù)的分析。

3.3 環(huán)境對(duì)鈴重的影響

鈴重屬于數(shù)量性狀，易受外界環(huán)境和栽培條件的影響，5年間的表現(xiàn)略有差異。2011、2013、和2014年鈴重波動(dòng)較大，主要原因是：2011年安陽氣候條件總體是前期旱，中后期雨澇。具體表現(xiàn)為7月中旬之前干旱無雨，棉鈴發(fā)育受影響；8～9月份陰雨天較多，對(duì)棉鈴的充實(shí)和吐絮極為不利。2013年和2014年，安陽的氣候條件總體是前中期雨水多，后期天氣晴好。具體表現(xiàn)為7月中旬到8月初陰雨較多，不利于成鈴；9月份秋高氣爽，氣溫較高，有利于上部棉鈴的充實(shí)，雖然單株鈴數(shù)較少，但鈴重較高。

3.4 增效基因來源于雙親

中棉所36和G2005均含有與鈴重相關(guān)的QTL增效位點(diǎn)，說明增效基因并非總是來源于高值親本[33]，低值親本對(duì)鈴重提高也有一定貢獻(xiàn)。增效基因來自低值親本的原因如下：高值親本中含有激活有利基因的調(diào)控基因，雜交后代獲得其調(diào)控基因后可激活低值親本有利基因的表達(dá)；由于隱蔽效應(yīng)導(dǎo)致增效基因在低值親本中不表達(dá)，當(dāng)發(fā)生重組時(shí)才被檢測(cè)到；兩者相互作用的結(jié)果[34]。

3.5 QTL數(shù)據(jù)庫比對(duì)

將棉花QTL數(shù)據(jù)庫（http://www.cottonqtldb.org）鈴重相關(guān)的QTL轉(zhuǎn)化成對(duì)應(yīng)染色體的物理圖距[35-36]，并與本研究結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)13個(gè)QTL位點(diǎn)（qBW-A4-1、qBW-A4-2、qBW-A4-3、qBW-A4-4、qBW-A5-1、qBW-A5-2、qBW-A9-1、qBW-A9-2、qBW-A10-2、qBW-A13-1、qBW-D4-1、qBW-D4-2、qBW-D8-2）與前人總結(jié)的結(jié)果相一致，說明這些位點(diǎn)對(duì)鈴重有一定的影響。qBW-A4-1、qBW-A4-2和qBW-A5-2在本研究的多個(gè)環(huán)境下被檢測(cè)到，且貢獻(xiàn)率較大，最大達(dá)15.83%，可能是較為穩(wěn)定的QTL。qBW-D4-1和qBW-D8-2在數(shù)據(jù)庫中分別對(duì)應(yīng)的QTLBW11.g和qBW-07A-c24-1，貢獻(xiàn)率分別為38.8%和13.54%，為 主 效QTL。所 以qBW-A4-1、qBW-A4-2、qBW-A5-2、qBW-D4-1和qBW-D8-2這5個(gè)QTL可為鈴重相關(guān)候選基因的篩選和驗(yàn)證提供參考。

4 結(jié)論

本研究構(gòu)建的遺傳圖譜豐富了棉花遺傳圖譜 信 息。qBW-A4-1、qBW-A4-2、qBW-A5-2、qBW-D4-1和qBW-D8-2為分析鈴重遺傳機(jī)理提了依據(jù)。