李荷麗 羅季陽(yáng) 苗 虹 吳永寧 李 立

（1.中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院 北京 100176；2.國(guó)家食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中心）

1 前言

氯丙醇和氯丙醇脂肪酸酯是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的在食品中廣泛存在的一類污染物，它們引起的健康風(fēng)險(xiǎn)不容忽視。氯丙醇可以分為以下4種：3-氯-1,2-丙二醇（3-MCPD）、2-氯-1,3-丙二醇（2-MCPD）、1,3-二氯-2-丙醇（1,3-DCP）、2,3-二氯-1-丙醇（2,3-DCP），前2種屬于單氯取代的化合物，后2種屬于雙氯取代的化合物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)詳見(jiàn)圖1。氯丙醇類物質(zhì)常溫下為液體，一般溶于水、苯、甘油乙醇、丙酮、四氯化碳、乙醚或互溶。用鹽酸水解工藝生產(chǎn)的水解植物蛋白（HVP）中往往會(huì)形成3-氯-1,2-丙二醇和1,3-二氯-2-丙醇。3-MCPD可以作為二氯丙醇（1,3-DCP和2,3-DCP）的前體，在3-MCPD濃度達(dá)到一定數(shù)值時(shí)，會(huì)進(jìn)一步形成1,3-DCP和2,3-DCP，故而檢測(cè)出3-MCPD含量高的食品中常有可能伴有1,3-DCP和2,3-DCP。

圖1 氯丙醇的化學(xué)結(jié)構(gòu)

氯丙醇脂肪酸酯（即氯丙醇酯）是氯丙醇類物質(zhì)與脂肪酸進(jìn)行酯化反應(yīng)所形成的化合物，其種類較多。根據(jù)氯原子位置的不同，氯丙醇酯可以分為單氯取代的氯丙醇酯（MCPD酯）和雙氯取代的氯丙醇酯（DCP酯）。單氯丙醇脂肪酸酯（MCPD酯）中的羥基與脂肪酸縮合時(shí)個(gè)數(shù)不同，MCPD酯又分為MCPD單酯和MCPD雙酯。由于結(jié)構(gòu)的特殊性，3-MCPD單酯可進(jìn)一步形成 SN1和 SN2 2種取代類型。氯丙醇酯理論上又可以分為7類化合物，包括單氯丙醇酯（包括單氯丙醇單酯3種和單氯丙醇雙酯2種）及2種雙氯丙醇酯。其結(jié)構(gòu)與分類詳見(jiàn)圖2。

圖2 氯丙醇酯的結(jié)構(gòu)與分類

氯丙醇酯的生成與油脂的精煉過(guò)程直接相關(guān)。文獻(xiàn)表明，3-氯-1,2-丙二醇脂肪酸酯（3-MCPD酯）是目前食品中污染水平較高的氯丙醇酯。如3-MCPD酯在含有可食用油和鹽的加工食品中含量較高，因?yàn)榫珶捴参镉褪?-MCPD酯的主要來(lái)源，如餅干、油脂、小吃和糕點(diǎn)。2-MCPD酯的污染水平相對(duì)來(lái)說(shuō)比3-MCPD酯低。目前，關(guān)于1,3-DCP酯和2,3-DCP酯檢測(cè)方法及污染水平的報(bào)道相對(duì)較少。

鑒于以上基本情況，系統(tǒng)地梳理食品中的氯丙醇和氯丙醇酯靈敏、便捷、準(zhǔn)確、高效的分析檢測(cè)方法具有重要意義。本文主要從國(guó)外通用的檢測(cè)方法、國(guó)標(biāo)檢測(cè)方法和其他檢測(cè)技術(shù)3個(gè)方面系統(tǒng)地介紹氯丙醇和氯丙醇酯的檢測(cè)技術(shù)進(jìn)展。

2 國(guó)內(nèi)外氯丙醇的檢測(cè)技術(shù)

氯丙醇類物質(zhì)的檢測(cè)多采用氣相色譜-質(zhì)譜法，但因氯丙醇的極性較大，沸點(diǎn)較高，相對(duì)分子質(zhì)量較小，故需進(jìn)行衍生后生成揮發(fā)性高的物質(zhì)以提高其檢測(cè)的靈敏度。

2.1 美國(guó)官方分析化學(xué)師協(xié)會(huì)（AOAC）方法

AOAC認(rèn)可的氯丙醇檢測(cè)方法，源于英國(guó)中央實(shí)驗(yàn)室制定的3-MCPD氘代穩(wěn)定性同位素稀釋技術(shù)結(jié)合氣相色譜質(zhì)譜（GC-MS）的檢測(cè)方法，獲得國(guó)際公認(rèn)，被世界各國(guó)普遍采用。此方法在試樣中加入3-MCPD-d5內(nèi)標(biāo)溶液，以硅藻土（ExtrelutTM20）為吸附劑，正己烷與乙醚混合溶劑（體積比為9∶1）為洗脫劑，HFBI作衍生化試劑，氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法進(jìn)行定量分析，檢測(cè)限為0.005 mg/kg。AOAC的方法適用于水解植物蛋白、湯、原料、醬油、麥芽提取物、香腸、魚(yú)、奶酪、面粉、淀粉、谷物和面包中3-MCPD的測(cè)定。

2.2 中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法

2017年6月23日開(kāi)始實(shí)施的食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 5009.191—2016《食品中氯丙醇及其脂肪酸酯含量的測(cè)定》[1]代替了 GB/T 5009.191—2006《食品中氯丙醇含量的測(cè)定》、GB/T 18782—2002《調(diào)味品中 3-氯-1,2-丙二醇的測(cè)定》、SN/T 0548.1—2002《出口醬油中1,3-二氯-2-丙醇和2,3-二氯-1-丙醇的檢驗(yàn)方法》。與舊法相比，新的標(biāo)準(zhǔn)第一法優(yōu)化了樣品前處理的步驟，具有較低的檢測(cè)限和定量限；第二法增加D5-2-MCPD、D5-2,3-DCP作為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，將凈化步驟由手填的硅藻土層析柱凈化改為硅藻土小柱凈化；并刪除了原標(biāo)準(zhǔn)的第3法。這2種方法分別適用于食品中3-氯-1,2-丙二醇含量的測(cè)定和食品中氯丙醇多組分含量的測(cè)定。

2.3 其他檢測(cè)方法

根據(jù)氯丙醇及其衍生物的性質(zhì)，一般采用氣相色譜串聯(lián)電子捕獲檢測(cè)器（ECD）或氫火焰離子化檢測(cè)器（FID）進(jìn)行檢測(cè)。采用ECD測(cè)定時(shí)，一般用苯基硼酸、HFBI或三氟乙酸酐（Trifluoroacetic Anhydride，TFAA）進(jìn)行氯丙醇的衍生。由于HFBI衍生物的電負(fù)性較強(qiáng)、檢測(cè)時(shí)靈敏度較高，因此，ECD檢測(cè)更常用。Van Bergen等[2]曾報(bào)道GC-EC的檢測(cè)方法，氯丙醇的檢測(cè)限為0.05～0.1 mg/kg。

毛細(xì)管電泳法等方法也有報(bào)道。刑曉平等[3]運(yùn)用毛細(xì)管電泳法測(cè)定水解植物蛋白液中3-MCPD的檢測(cè)限為0.22 mg/L。申中蘭等[4]建立了快速高效的醬油中3-MCPD的固相萃取-氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定方法，方法檢出限為0.005 mg/kg。易青等[5]建立了在線凝膠滲透色譜-氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（Online GPC-GC-MS/MS）測(cè)定方法，目標(biāo)化合物包括3-MCPD、2-MCPD、1,3-DCP和2,3-DCP。樣品中加入同位素內(nèi)標(biāo)后，經(jīng)過(guò)凈化除雜萃取，萃取液經(jīng)濃縮后測(cè)定。此種方法并未進(jìn)行衍生化，前處理過(guò)程相對(duì)簡(jiǎn)單。4種氯丙醇的檢出限范圍為0.002～0.005mg/kg，定量限為0.005～0.01 mg/kg。

3 國(guó)內(nèi)外氯丙醇酯的檢測(cè)技術(shù)

目前，氯丙醇酯檢測(cè)主要有直接測(cè)定法和間接測(cè)定法2種。

間接法采用氣相色譜質(zhì)譜（GC-MS）法，原理是首先將樣品中目標(biāo)化合物在酸、堿或酶作用下水解轉(zhuǎn)化為游離的氯丙醇，然后對(duì)氯丙醇進(jìn)行衍生測(cè)定。此法測(cè)定的是氯丙醇酯的總含量，不能對(duì)氯丙醇酯單體的含量及種類進(jìn)行表征。常用的衍生化試劑有酮類、硼酸類、三氟乙酸酐和七氟丁酰類等。其中，又以七氟丁?；噭℉FBI、HFBA）和硼酸類（苯基硼酸，Phenylboronic Acid，PBA或丁基硼酸，Butylboronic Acid，BBA）為最常用的衍生化試劑。七氟丁?；噭┠芡瑫r(shí)與3-MCPD、2-MCPD、1,3-DCP和2,3-DCP發(fā)生衍生化反應(yīng)，所以能同時(shí)測(cè)定樣品中所有種類的氯丙醇酯。PBA只能衍生3-MCPD和2-MCPD，因而只能測(cè)定3-MCPD酯和2-MCPD酯，不能對(duì)1,3-DCP酯和2,3-DCP酯的實(shí)際污染狀況進(jìn)行監(jiān)測(cè)。

而直接測(cè)定法則是直接測(cè)定一種或幾種不同的氯丙醇酯，不需要進(jìn)行衍生反應(yīng)，大多采用液相色譜-質(zhì)譜法（LC-MS）進(jìn)行測(cè)定。因此，LC-MS的測(cè)定方法又可以稱作直接測(cè)定法。受市場(chǎng)上流通標(biāo)準(zhǔn)品種類的影響，直接測(cè)定法只能測(cè)定某個(gè)或某幾種氯丙醇酯，容易低估樣品中氯丙醇酯的含量。

3.1 德國(guó)脂肪科學(xué)學(xué)會(huì)（DGF）和美國(guó)油脂化學(xué)學(xué)會(huì)（AOCS）方法

目前，大多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道的檢測(cè)方法均源自德國(guó)脂肪科學(xué)學(xué)會(huì)（DGF）油脂中氯丙醇酯測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)方法C-III 18（09）和（DGF）C-VI 18（10）。C-III 18（09）這一方法首先將樣品中縮水甘油酯去除，然后將目標(biāo)化合物水解除雜，之后衍生，最后進(jìn)行測(cè)定。研究表明，在特定條件下酯鍵斷裂過(guò)程中3-MCPD和縮水甘油可以相互轉(zhuǎn)化。另外，此方法在采用PBA衍生后，GC-MS檢測(cè)時(shí)靈敏度受到很大影響，故此法檢測(cè)的特異性不強(qiáng)，不能準(zhǔn)確地表征食品中氯丙醇酯的實(shí)際含量。 后續(xù)改進(jìn)的（DGF）C-VI 18（10）測(cè)定氯丙醇酯的標(biāo)準(zhǔn)方法中，將氯丙醇酯在堿性條件下進(jìn)行水解，生成氯丙醇，之后將氯丙醇與衍生劑PBA反應(yīng)，再進(jìn)行GC-MS檢測(cè)，使測(cè)定結(jié)果偏大的問(wèn)題得以改善。近年來(lái)，GC-MS的檢測(cè)方法在前處理技術(shù)上也有所改進(jìn)和發(fā)展。氯丙醇酯常見(jiàn)間接測(cè)定方法詳見(jiàn)表1。

表1 氯丙醇酯的間接測(cè)定方法

美國(guó)油脂化學(xué)學(xué)會(huì)（AOCS）目前報(bào)道了3種測(cè)定氯丙醇酯的方法。Pinkston等[14]對(duì)植物油樣品直接稀釋并進(jìn)樣，用在電噴霧電離（Electrospray Ionization，ESI）模式下采用LC-MS/MS方法，測(cè)定了5種3-MCPD單酯和9種3-MCPD二酯，定量限分別為0.02～0.05 mg/kg、0.05～0.1 mg/kg，個(gè)別二酯類定量限較高，達(dá)到 0.5～1 mg/kg。 MacMahon等[15]建立了可食用油中的22種3-MCPD二酯的測(cè)定方法，樣品采用硅膠柱進(jìn)行凈化后，采用大氣壓化學(xué)電離（APCI）源正離子模式，LC-MS/MS方法進(jìn)行測(cè)定。Dubois等[16]建立了可食用油中的7種3-MCPD單酯和7種3-MCPD二酯的LC-TOFMS的測(cè)定方法，3-MCPD單酯采用固相萃?。⊿olid-Phase Extraction，SPE）、C18 和硅膠柱的凈化，3-MCPD二酯采用SPE和硅膠柱凈化。Yamazaki K.等[17]采用LC-MS/MS直接測(cè)定了油脂中10類3-MCPD酯的含量，檢出限為0.02～0.08 mg/kg。與氣相色譜或氣相質(zhì)譜法不同，液相質(zhì)譜法測(cè)定樣品前處理過(guò)程簡(jiǎn)單，不需進(jìn)行衍生化反應(yīng)。但同時(shí)這種方法也有缺點(diǎn)，如前文所述，以液相質(zhì)譜法所測(cè)定的只是某些氯丙醇酯含量，不能測(cè)得其總含量。鑒于此，以液相質(zhì)譜法所測(cè)得的含量不適合進(jìn)行食品中氯丙醇酯膳食暴露風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，但可用于氯丙醇酯的毒理學(xué)研究以及評(píng)價(jià)油脂質(zhì)量。

3.2 中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法

2017年6月23日開(kāi)始實(shí)施的食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 5009.191—2016《食品中氯丙醇及其脂肪酸酯含量的測(cè)定》第三法改為“食品中氯丙醇脂肪酸酯含量的測(cè)定氣相色譜-質(zhì)譜法”，適用于食品中4種氯丙醇酯含量的測(cè)定，檢出限為0.005～0.01mg/kg，定量限的范圍為0.01～0.025 mg/kg，彌補(bǔ)了之前國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法中沒(méi)有氯丙醇酯檢測(cè)方法的空白。

3.3 其他方法

隨著近年來(lái)檢測(cè)設(shè)備的普及，目前多采用氣相色譜和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行氯丙醇酯的檢測(cè)，基本未見(jiàn)GC法檢測(cè)技術(shù)的報(bào)道。除了李荷麗等[18]建立了穩(wěn)定性同位素稀釋的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UHPLC-MS/MS）測(cè)定動(dòng)物組織與生物體液中氯丙醇脂肪酸酯的方法之外，目前基于LC-MS技術(shù)的檢測(cè)方法，樣品基質(zhì)幾乎全部是植物油樣品。使用液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)量分析儀（LC-TOFMS）或高分辨Exactive Orbitrap質(zhì)譜儀測(cè)定植物油中3-MCPD酯的直接檢測(cè)方法也已有報(bào)道。前處理方法中MCPD單酯和二酯的分離也還僅僅限于使用制備的硅膠柱。與植物油樣品“直接稀釋和注入儀器”的方法”[19]相比，使用硅膠柱和C18固相萃取SPE柱凈化分析3-MCPD單酯和二酯[20]能獲得更低的基質(zhì)干擾和檢出限（LOD）。對(duì)單酯和二酯單獨(dú)分析可以詳細(xì)地提供單個(gè)酯類的信息，這對(duì)于了解不同MCPD酯的污染狀況具有重要的意義。

氯丙醇酯易受到酸堿度、鹽和添加物等因素的影響，故在液相色譜條件下離子化程度一般不高。鈉離子的存在有利于化合物的電離，提高化合物的響應(yīng)值，但很容易造成離子源和質(zhì)譜儀的污染，對(duì)儀器設(shè)備的損害程度較高，需要頻繁進(jìn)行清洗。再者，氯丙醇酯種類繁多，在目前的液相色譜條件下的可能不能實(shí)現(xiàn)包括同分異構(gòu)體（如SN1-3-MCPD-棕櫚酸單酯、SN2-3-MCPD-棕櫚酸單酯、2-MCPD-棕櫚酸單酯等）在內(nèi)的全部氯丙醇酯的分離，這也成為限制氯丙醇酯液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）法發(fā)展的因素。目前，除了MacMahon報(bào)道分離了2對(duì)3-MCPD 單酯和2-MCPD單酯的同分異構(gòu)體和3對(duì)3-MCPD二酯和2-MCPD二酯的同分異構(gòu)體和李荷麗等報(bào)道分離了2對(duì)3-MCPD二酯和2-MCPD二酯的同分異構(gòu)體外，其他直接測(cè)定3-MCPD酯的方法均未實(shí)現(xiàn)3-MCPD酯和2-MCPD酯的分離。

4 結(jié)語(yǔ)

目前，中國(guó)食品中氯丙醇的檢測(cè)方法研究較多，但氯丙醇酯特別是雙氯取代的氯丙醇酯檢測(cè)方法的研究還處于空白階段，并且食品加工過(guò)程中對(duì)每個(gè)環(huán)節(jié)所產(chǎn)生氯丙醇及其酯類的快速監(jiān)測(cè)手段還很有限。因此，開(kāi)展食品中氯丙醇酯檢測(cè)方法的探索研究，可為以后研究氯丙醇酯的形成機(jī)制、代謝途徑、毒理學(xué)性質(zhì)及企業(yè)改進(jìn)加工工藝和條件等控制措施方面提供技術(shù)支持。