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1.大連民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，遼寧 大連 116600;2.大連民族大學(xué)生物技術(shù)與資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116600

復(fù)方木雞顆粒是在民間藥方“木雞湯”的基礎(chǔ)上開發(fā)研制而成的顆粒劑，由云芝提取物、山豆根、菟絲子、核桃楸皮等藥材制成，具有治療肝炎、肝纖維化、肝癌的作用[1-3]。作為最具有代表性的滿族藥，復(fù)方木雞顆粒對肝病治療機(jī)制獨(dú)特，具有較大的研究價值。

復(fù)方木雞顆粒自上市以來，由于其能特異性地抑制甲胎蛋白(AFP)升高，為治療肝病開辟了一條新途徑，因而吸引了越來越多的的關(guān)注。動物實(shí)驗(yàn)證明，復(fù)方木雞顆粒對化療藥物有明顯的減毒作用，且具有較強(qiáng)的抗癌活性，在臨床上可作為一種化療藥物的減毒手段和抗癌免疫增強(qiáng)劑，可明顯提高癌癥患者的治療效果[4-11]。復(fù)方木雞顆?，F(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)無含量測定項(xiàng)，有文獻(xiàn)分別對該制劑中苦參堿和金絲桃苷的含量進(jìn)行檢測，但多成分含量測定方面未見有研究報道[4,6]。課題組在前期研究中已鑒定或推斷了復(fù)方木雞顆粒甲醇提取物中36種主要化學(xué)成分，且對其制劑中的多糖和生物堿成分進(jìn)行了含量測定，本研究建立HPLC法 同時測定復(fù)方木雞顆粒中沒食子酸、香草酸、綠原酸、咖啡酸、丁香酸和對香豆酸6種成分含量的分析方法，并對不同批次復(fù)方木雞顆粒的質(zhì)量進(jìn)行分析與評價，為復(fù)方木雞顆粒的質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器 島津LC2010A液相色譜儀(配有Class-VP工作站、在線脫氣機(jī)、輸液泵、自動進(jìn)樣器、柱溫箱和紫外檢測器，日本島津公司)；KQ 2200E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；ME104 萬分之一[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]。

1.2 試藥 對照品香草酸(802B021)、咖啡酸(110B022)、對香豆酸(112B023)、丁香酸(C100-79561)、綠原酸(1211D022)購自北京索來寶科技有限公司，對照品沒食子酸(110780-201508)購于中國食品藥品檢定所，各對照品質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大于 98%。乙腈、甲醇和磷酸(色譜純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司)；純凈水(杭州娃哈哈集團(tuán))。復(fù)方木雞顆粒由丹東藥業(yè)集團(tuán)提供(批號170-101，170201，170202，170203，170303，170304)。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品儲備液的制備 精密稱取對照品沒食子酸、香草酸、綠原酸、丁香酸、咖啡酸和對香豆酸適量，精密稱定，用甲醇配制成質(zhì)量濃度分別為2.001、1.030、1.080、1.050、0.204、0.025 g·L-1的混合對照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備 取本品適量，研細(xì)，取粉末(過60目篩)約2.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定重量，超聲30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取濾液，殘渣再次置于具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定重量，超聲30 min，放冷，濾過，合并兩次濾液置蒸發(fā)皿中，水浴揮干，殘渣加入甲醇適量使溶解，轉(zhuǎn)移至5 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，過0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.3 色譜條件 采用WondaSil C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，以0.2%磷酸水溶液(A)-甲醇(B)為流動相，洗脫梯度：0～15 min，5%～20% B；15～20 min，20%～30% B；20～40 min，30%～40% B；40～45 min，40%～5% B；45～50 min，5% B。流速1.0 mL·min-1，檢測波長 254 nm和 325 nm，柱溫 30 ℃，進(jìn)樣量 10 μL。

2.4 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 精密吸取“2.1”項(xiàng)下混合對照品溶液0.5 mL，甲醇稀釋定容至10 mL，得沒食子酸100.0 mg·L-1、香草酸52.50 mg·L-1、咖啡酸10.2 mg·L-1、丁香酸54.00 g·L-1、綠原酸51.50 mg·L-1、對香豆酸1.25 mg·L-1的混合對照品溶液。分別精密吸取該對照品溶液和“2.2”項(xiàng)下供試品溶液10 μL，按照“2.3”項(xiàng)下色譜條件測定，記錄色譜圖。本實(shí)驗(yàn)條件下所測得的6個成分與相鄰色譜峰的分離度良好，與其他組分分離完全，沒食子酸、綠原酸、香草酸、咖啡酸、丁香酸和對香豆酸保留時間分別為11.3 min、25.5 min、27.0 min、27.6 min、28.8 min和34.9 min，色譜系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)符合含量測定要求，色譜圖如圖1所示。

2.5 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.1”項(xiàng)下對照品儲備液各 0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.5、5.0 mL，分別置10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，制成一系列濃度(1)的混合對照品溶液。按照“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，以各對照品質(zhì)量濃度(X，mg·L-1)為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，各成分回歸方程和線性范圍見表1。結(jié)果表明，6個成分在測定范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。 將混合對照品溶液逐步稀釋， 分別以 S /N = 3 和 S /N = 10時各對照品的質(zhì)量濃度作為檢出限( LOD) 和定量限( LOQ)，結(jié)果見表 1。

表1 各被測成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程、線性范圍和相關(guān)系數(shù) (n=6)

2.6 儀器精密度試驗(yàn) 精密吸取供試品溶液(批號：170101)5 μL，依“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，計算沒食子酸、香草酸、丁香酸、綠原酸、咖啡酸和對香豆酸峰面積的RSD(n=6)分別為1.1%、0.46%、1.4%、1.5%、1.9%、0.74%、0.58%、1.1%、0.61%，表明儀器精密度良好。

2.7 重復(fù)性考察 取批號170101樣品粉末6份，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按“2.3”項(xiàng)下色譜條件測定，記錄峰面積，計算含量。結(jié)果沒食子酸、香草酸、丁香酸、綠原酸、咖啡酸和對香豆酸含量(n=6)分別為371.8、210.0、272.5、437.7、1.970、3.970 mg·L-1，其RSD分別為0.84%、4.8%、4.5%、4.0%、4.9%、4.2%、2.1%，表明重復(fù)性良好。

2.8 供試品溶液穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液(批號：170101)，分別于配制后0、6、12、24 h進(jìn)樣測定，結(jié)果沒食子酸、香草酸、丁香酸、綠原酸、咖啡酸、對香豆酸峰面積的RSD(n=6)分別為1.8%、3.1%、2.7%、4.9%、4.2%、4.4%和3.1%，表明供試品溶液在 24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的同一批次的復(fù)方木雞顆粒樣品(170101) 9份，每份1.0 g。精密稱取沒食子酸、香草酸、丁香酸、綠原酸、咖啡酸、對香豆酸對照品適量，加甲醇分別制成沒食子酸(0.8 g·L-1)、香草酸(0.4 g·L-1)、丁香酸(0.4 g·L-1)、綠原酸(0.4 g·L-1)、咖啡酸(0.008 g·L-1)、對香豆酸(0.005 g·L-1)的混合對照樣品。取0.8、1.0、1.2 mL各3份，加入9份樣品中。按照“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“2.3”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行含量測定，計算 6種成分的平均回收率及RSD，結(jié)果見表2。6種待測成分的平均回收率在95.3%～ 99.8%，RSD均小于5.0%，表明方法的準(zhǔn)確度良好。

2.10 樣品含量測定 分別取不同批號的復(fù)方木雞顆粒按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，以外標(biāo)法計算6個酚酸類成分的含量，結(jié)果見表3。

表2 加樣回收率 (n=3)

表2 加樣回收率 (n=3)

表3 復(fù)方木雞顆粒中6種成分含量測定結(jié)果 (/mg·g-1)

3 討論

復(fù)方木雞顆粒提取物中成分復(fù)雜，本實(shí)驗(yàn)首先考察不同比例的甲醇和乙醇為提取溶劑，以及超聲和回流提取方法對方劑的提取效率，結(jié)果表明甲醇超聲提取兩次的各被測成分色譜峰峰面積最大，故采用甲醇溶液作為提取溶劑。

流動相的選擇：由于復(fù)方中藥材的化學(xué)成分復(fù)雜，故選擇梯度洗脫系統(tǒng)。被測成分均為有機(jī)酸類物質(zhì)，為了防止色譜峰拖尾，故在流動相中加入酸?？疾旒状?水、乙腈-水2種溶劑系統(tǒng)，以及流動相中加入不同比例的甲酸、乙酸、磷酸、醋酸銨的分離效果，結(jié)果顯示甲醇-0.2%磷酸水溶液系統(tǒng)基線平穩(wěn)，峰型較好，分離效果最佳。

波長的選擇：采用 DAD二極管陣列檢測器在200 ～ 400 nm范圍內(nèi)掃描各對照品溶液的紫外吸收，沒食子酸、丁香酸和咖啡酸的最大吸收波長為270 nm，香草酸為260 nm，綠原酸為247 nm和325 nm，對香豆酸為313 nm。為保證各待測成分能得到較好的響應(yīng)且分離效果最佳、干擾最少，最終選擇254 nm為沒食子酸、香草酸和丁香酸的檢測波長；325 nm為綠原酸、咖啡酸和對香豆酸的檢測波長。

復(fù)方木雞顆粒各味藥材化學(xué)成分復(fù)雜，主要含有多糖、生物堿、酚酸類和黃酮類等成分。其中酚酸類成分藥理作用廣泛，如抗炎癥反應(yīng)、抑制血小板聚集、抗血栓、抗氧化、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡等。前期研究中從復(fù)方木雞顆粒提取物中檢測到生理活性較強(qiáng)、含量較高的綠原酸、沒食子酸、丁香酸、對香豆酸和咖啡酸。為彌補(bǔ)現(xiàn)行方劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的不足，本實(shí)驗(yàn)篩選該6種酚酸類成分作為檢測指標(biāo)，供試品含量測定的結(jié)果表明，10批復(fù)方中沒食子酸和綠原酸的含量質(zhì)量分?jǐn)?shù)均值為0.08%，香草酸和丁香酸的含量質(zhì)量分?jǐn)?shù)小于0.06%，咖啡酸和對香豆酸的含量質(zhì)量分?jǐn)?shù)均不足0.001%。復(fù)方木雞顆粒中的酚酸類成分多來自核桃楸皮和菟絲子，咖啡酸和對香豆酸的含量不足0.001%，因此并不適用于復(fù)方木雞顆粒質(zhì)量的評價指標(biāo)，而沒食子酸、綠原酸、香草酸和丁香酸的含量可用于該方劑的質(zhì)量控制。本研究基于雙波長法對復(fù)方木雞顆粒中6個酚酸類成分含量的同時測定，為復(fù)方木雞顆粒質(zhì)量評價提供新的參考。