張 磊,朱 文,李建新,王 廣,鄧全紅

(荊門市第二人民醫(yī)院泌尿外科,荊門 448000;*通訊作者,E-mail:qhdengjm@163.com)

前列腺癌是男性泌尿生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一,治療主要采用手術(shù)切除、放療、內(nèi)分泌等方法,但前列腺癌患者的預(yù)后仍不理想[1]。前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展涉及遺傳學(xué)、表觀遺傳學(xué)等多層面的病理過程,盡管近年來的研究取得了一定進(jìn)展,然而前列腺癌的發(fā)生機(jī)制仍不明確[2]。長鏈非編碼RNA(long-chain non-coding RNA,lncRNA)是非編碼RNA的重要組成部分,是一類轉(zhuǎn)錄本長度大于200個(gè)核苷酸的RNA[3]。雖然lncRNA自身不能編碼蛋白,但lncRNA可通過調(diào)控下游基因的表達(dá),影響多種細(xì)胞功能[4]。越來越多的證據(jù)表明,lncRNA在多種腫瘤組織中異常表達(dá),lncRNA可能具有抑制或促進(jìn)腫瘤發(fā)生的作用[5]。有文獻(xiàn)報(bào)道,lncRNA的異常表達(dá)在前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展中可能發(fā)揮分子標(biāo)志物作用[6]。AC005154.6是一種新發(fā)現(xiàn)的lncRNA,其在前列腺癌中的表達(dá)情況及分子作用機(jī)制并不清楚。本研究通過臨床標(biāo)本和多種細(xì)胞系驗(yàn)證AC005154.6在前列腺癌組織和細(xì)胞系中的表達(dá),觀察AC005154.6對(duì)前列腺癌細(xì)胞增殖和遷移能力的影響及可能的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本

收集2016-08～2018-05荊門市第二人民醫(yī)院(荊楚理工學(xué)院附屬中心醫(yī)院)泌尿外科前列腺癌根治性切除手術(shù)標(biāo)本61例。所有患者均未行術(shù)前化療、放療。距離腫瘤邊緣大于2 cm的組織為癌旁組織,所有標(biāo)本組織學(xué)特征均經(jīng)兩名以上病理科醫(yī)生確定。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),患者或其家屬均簽署知情同意書。

1.2 細(xì)胞系和主要試劑

前列腺癌細(xì)胞系(PC-3、LNCap、C4-2B、DU-145)和正常前列腺上皮細(xì)胞(RWPE-1)購自上海生命科學(xué)院細(xì)胞所。RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清、KSFM培養(yǎng)基購自加拿大Wisent公司。攜帶無意義序列的重組慢病毒、攜帶AC005154.6序列的重組慢病毒購自上海吉瑪制藥有限公司。RT-qPCR試劑盒購自美國Roche公司。CCK-8試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。GAPDH、c-myc、u-PA、Ephrin-A1、VEGF、TNFAIP3蛋白抗體購自美國BD公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)和上調(diào)

前列腺癌細(xì)胞系(PC-3、LNCap、C4-2B、DU-145)用RPMI 1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)培養(yǎng),正常前列腺上皮細(xì)胞(RWPE-1)用KSFM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)培養(yǎng),常規(guī)培養(yǎng)在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中,隔天傳代。取對(duì)數(shù)生長期的PC-3細(xì)胞進(jìn)行感染,根據(jù)MOI=40加入病毒,感染攜帶無意義序列的重組慢病毒為對(duì)照組,感染攜帶AC005154.6序列的重組慢病毒為實(shí)驗(yàn)組。感染24 h后更換新鮮培養(yǎng)基。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測組織或細(xì)胞中AC005154.6和TNFAIP3 mRNA的表達(dá)

采用TRIzol一步法提取組織、細(xì)胞的總RNA,采用NanoDrop DN1000分析儀檢測RNA的濃度和純度,取0.5 μg RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。選擇GAPDH為內(nèi)參,采用RT-qPCR試劑盒分析,RT-qPCR循環(huán)參數(shù)為95 ℃ 3 min、95 ℃ 10 s、62 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s,40個(gè)循環(huán),RT-qPCR引物見表1。采用2-ΔΔCt方法分析AC005154.6和TNFAIP3 mRNA的表達(dá)情況。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1 Primer sequences for RT-qPCR

1.5 CCK-8法檢測PC-3細(xì)胞增殖

消化、收集對(duì)數(shù)生長期的兩組PC-3細(xì)胞,制成單細(xì)胞懸液后,以5×103個(gè)/孔接種96孔板,每組3個(gè)復(fù)孔,隔天換液。每24 h以CCK-8法檢測細(xì)胞增殖能力,具體操作:加入20 μl/孔CCK-8稀釋液,避光培養(yǎng)3 h,酶標(biāo)儀于460 nm檢測每孔的吸光度。連續(xù)檢測5次,繪制細(xì)胞生長曲線。

1.6 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測PC-3細(xì)胞遷移

消化、收集對(duì)數(shù)生長期的兩組PC-3細(xì)胞,制成單細(xì)胞懸液后,以7×106個(gè)/孔接種6孔板,每組4個(gè)復(fù)孔。待細(xì)胞融合度達(dá)到95%作用,采用200 μl槍頭在6孔板底部進(jìn)行劃痕,采用磷酸鹽溶液洗滌后加入無血清培養(yǎng)基,培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。分別在0 h和24 h,每孔選4個(gè)低倍視野,分析兩組PC-3細(xì)胞遷移率。

1.7 Western blot檢測細(xì)胞TNFAIP3及NF-κB信號(hào)通路蛋白表達(dá)

消化、收集對(duì)數(shù)生長期的兩組PC-3細(xì)胞,裂解并提取總蛋白。采用12%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白,采用PVDF膜轉(zhuǎn)膜。在5%脫脂奶粉封閉中封閉1 h,采用一抗c-myc(1 ∶2 000)、GAPDH(1 ∶3 000)、u-PA(1 ∶2 000)、TNFAIP3(1 ∶2 000)、Ephrin-A1(1 ∶3 000)、VEGF(1 ∶3 000)孵育,在4 ℃下過夜。采用二抗(1 ∶5 000)在室溫下孵育1 h,采用ECL發(fā)光試劑充分浸潤PVDF膜,采用凝膠成像系統(tǒng)拍照分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù),計(jì)量數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間計(jì)量數(shù)據(jù)比較均采用t檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AC005154.6在前列腺癌組織和癌旁組織中的表達(dá)

前列腺癌組織和癌旁組織中的表達(dá)分別為0.99±0.33和3.86±0.58,與癌旁組織比較,AC005154.6在前列腺癌組織中表達(dá)下調(diào)(t=24.31,P<0.01,見圖1)。

與癌旁組織比較,**P<0.01圖1 AC005154.6在前列腺癌組織和癌旁組織中的表達(dá)Figure 1 Expression level of AC005154.6 in prostate cancer tissues and adjacent tissues

2.2 AC005154.6在前列腺癌細(xì)胞系和正常前列腺上皮細(xì)胞的表達(dá)

與正常前列腺上皮細(xì)胞(RWPE-1)比較,前列腺癌細(xì)胞系(Huh7、PC-3、MHCC-97H和BEL-7404)中AC005154.6均表達(dá)下調(diào)(P<0.05),PC-3細(xì)胞中AC005154.6的表達(dá)量最低(P<0.01,見圖2)。

2.3 檢測慢病毒的感染效率

對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組PC-3細(xì)胞中AC005154.6相對(duì)表達(dá)量分別為1.00±0.05和8.19±0.32(t=22.27,P<0.01),提示攜帶AC005154.6序列的重組慢病毒感染成功。

2.4 上調(diào)AC005154.6對(duì)PC-3細(xì)胞增殖能力的影響

CCK-8檢測結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,實(shí)驗(yàn)組的PC-3細(xì)胞從第3天開始,增殖能力顯著降低(P<0.05,見圖3)。

與RWPE-1細(xì)胞比較,*P<0.05,**P<0.01圖2 AC005154.6在前列腺癌細(xì)胞系和正常前列腺上皮細(xì)胞中的表達(dá)Figure 2 Expression level of AC005154.6 in normal prostatic epithelium cells and prostate cancer cell lines

與對(duì)照組比較,*P<0.05圖3 AC005154.6對(duì)前列腺癌細(xì)胞PC-3增殖的影響Figure 3 Effect of AC005154.6 on proliferation of prostate cancer cells PC-3

2.5 上調(diào)AC005154.6對(duì)PC-3細(xì)胞遷移能力的影響

對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組PC-3細(xì)胞的遷移率分別為(65.57±3.83)%和(22.49±5.56)%(t=6.38,P<0.01)。與對(duì)照組比較,上調(diào)AC005154.6后的前列腺癌細(xì)胞遷移能力被顯著抑制(見圖4)。

圖4 AC005154.6對(duì)前列腺癌細(xì)胞PC-3遷移的影響Figure 4 Effect of AC005154.6 on migration of prostate cancer cells PC-3

2.6 上調(diào)AC005154.6對(duì)PC-3細(xì)胞中TNFAIP3 mRNA表達(dá)的影響

對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組PC-3細(xì)胞中TNFAIP3 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為1.00±0.04和4.70±0.28(t=13.10,P<0.01)。與對(duì)照組比較,AC005154.6可促進(jìn)PC-3細(xì)胞中TNFAIP3 mRNA的表達(dá)。

2.7 上調(diào)AC005154.6對(duì)TNFAIP3蛋白及NF-κB信號(hào)通路蛋白表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,上調(diào)AC005154.6后,PC-3細(xì)胞中TNFAIP3蛋白表達(dá)顯著增加,NF-κB信號(hào)通路蛋白如c-myc、u-PA、Eph-rin-A1、VEGF蛋白的表達(dá)顯著下降,NF-κB信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)被抑制(見圖5)。

圖5 Western blot檢測AC005154.6對(duì)TNFAIP3及NF-κB信號(hào)通路蛋白表達(dá)的影響Figure 5 Effect of AC005154.6 on the TNFAIP3 protein and NF-κB signaling pathway protein expression by Western blot

3 討論

長鏈非編碼RNA(long-chain non-coding RNA,lncRNA)由于不能編碼蛋白質(zhì),過去被認(rèn)為是基因組轉(zhuǎn)錄的“噪音”[7]。近年來的研究發(fā)現(xiàn),lncRNA可在轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá),廣泛參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展,lncRNA的異常表達(dá)可用來判斷腫瘤的發(fā)展階段、惡性程度等[8]。lncRNA已成為前列腺癌防治研究的重點(diǎn)。lncRNA可發(fā)揮抑癌基因或致癌基因,一些lncRNA如ANRIL、NEAT1等在前列腺癌中表達(dá)增加,可促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移,其高表達(dá)提示患者預(yù)后差[9,10]。一些lncRNA如MEG3等在前列腺癌中表達(dá)降低,與前列腺癌患者的不良預(yù)后顯著相關(guān)[11]。AC005154.6是一種新發(fā)現(xiàn)的lncRNA,其在前列腺癌中的表達(dá)情況和分子作用機(jī)制尚不明確。

本研究結(jié)果表明,AC005154.6在前列腺癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào),提示AC005154.6很可能對(duì)前列腺癌的發(fā)生發(fā)展起著重要作用。通過慢病毒介導(dǎo)上調(diào)PC-3細(xì)胞中AC005154.6的表達(dá),前列腺癌細(xì)胞的增殖和遷移能力明顯被抑制。腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)蛋白3(TNFAIP3)基因位于染色體6q23.3[12]。TNFAIP3具有抑癌基因活性,近年來被證實(shí)參與抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲等惡性生物學(xué)行為[13-15]。本研究結(jié)果表明,上調(diào)AC005154.6后,PC-3細(xì)胞中TNFAIP3表達(dá)顯著增加,表明AC005154.6可促進(jìn)TNFAIP3蛋白的表達(dá)。有研究表明,TNFAIP3主要通過負(fù)調(diào)控NF-κB信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo),抑制腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移[16]。Western blot結(jié)果表明,TNFAIP3表達(dá)上調(diào)后,NF-κB信號(hào)通路蛋白如c-myc、u-PA、Ephrin-A1、VEGF蛋白的表達(dá)顯著降低,表明NF-κB信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)被抑制,提示PC-3細(xì)胞的增殖和遷移能力可能降低。AC005154.6如何促進(jìn)TNFAIP3基因并不清楚。有研究表明,lncRNA在細(xì)胞中存在如SChLAP1與miR-198之間的“競爭性結(jié)合RNA”調(diào)控作用,而miRNA具有抑制靶基因表達(dá)作用,lncRNA可通過影響miRNA的活性間接調(diào)控靶基因的表達(dá)[17,18]。AC005154.6和TNFAIP3之間是否存在一個(gè)miRNA參與調(diào)控,是我們下一步研究的方向。

總之,本研究首次發(fā)現(xiàn)lncRNA AC005154.6在前列腺癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào),上調(diào)AC005154.6可通過促進(jìn)TNFAIP3基因的表達(dá),抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖和遷移能力,AC005154.6為前列腺癌新型腫瘤標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)提供了一定可能。