李小珩,李 蓉,朱巧平

(1西北工業(yè)大學(xué)醫(yī)院眼科,西安 710072;2西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院眼科;3榆林市第一醫(yī)院眼科;*通訊作者,E-mail:rechelrong198222@163.com)

視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜新生血管是許多眼病的主要致盲原因,如早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變、糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy,DR)和年齡相關(guān)性黃斑變性,這些疾病分別是兒童致盲、工作年齡成人視力損害以及老年人致盲的首位原因[1-3]。可見,視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜新生血管危害嚴(yán)重且累及人群廣泛,因而近年來眼科領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)集中于探索抗血管生成的方法與策略。

槲皮素(3,3′,4′,5,7-五羥基黃酮)是在多種水果和蔬菜中發(fā)現(xiàn)的一種具有多種生物活性的天然多酚,如洋蔥、蘋果和草莓等,對人體無毒無害。近年來對槲皮素的研究日益增多,發(fā)現(xiàn)其具有抗氧化及清除氧自由基、抗纖維化、抗腫瘤、降血壓等許多藥理活性[4-6]。在一些實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭?已發(fā)現(xiàn)這些化合物在體內(nèi)和體外能抑制腫瘤以及腫瘤血管生長[5-8]。另據(jù)報(bào)道,槲皮素具有在體內(nèi)外抑制視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜血管生成的作用[9,10]。自噬是一種通過溶酶體依賴的降解方式來實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)和受損細(xì)胞器翻轉(zhuǎn)的穩(wěn)態(tài)細(xì)胞機(jī)制,已有研究提示自噬激活可促進(jìn)視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜血管生成[11]。據(jù)此推測槲皮素可能通過抑制自噬反應(yīng)發(fā)揮抗視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜血管生成的作用。已發(fā)現(xiàn)槲皮素對糖尿病具有治療作用[12],但它對DR作用如何還不清楚?；诖?本研究觀察槲皮素對高糖誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移和血管形成過程的影響及其與細(xì)胞自噬的關(guān)系,旨在為明確槲皮素在治療DR等視網(wǎng)膜或脈絡(luò)膜新生血管中的作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞株、主要試劑與儀器

RF/6A細(xì)胞系(中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫);DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基、0.25%胰酶,胎牛血清、青霉素、鏈霉素、DMSO(美國Gibco公司);槲皮素(美國Sigma公司,溶解于DMSO,濃度為10 mmol/L);LC3抗體、HRP標(biāo)記二抗(美國Santa Cruz公司);Beclin-1抗體、GAPDH抗體(美國Bioword公司);GFP-LC3質(zhì)粒(北京義翹神州生物技術(shù)有限公司);Lipofectamine 2000、Opti-MEM(美國Invitrogen公司);Matrigel(美國BD公司);CO2培養(yǎng)箱(日本Sanyo公司,MCO-15AC型);酶標(biāo)儀(美國Thermo公司,Multiskan MK3型);倒置顯微鏡(日本Olympus公司,IX51型);熒光顯微鏡(日本Olympus公司,BX53型)。

1.2 細(xì)胞處理及分組

將RF/6A細(xì)胞置于含有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 U/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中,在37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞(5.0×105個(gè)/孔)接種于6孔板,待細(xì)胞貼壁后,按如下分組處理細(xì)胞24 h:對照組(常規(guī)培養(yǎng)),高糖組(在DMEM培養(yǎng)基中加入25 mmol/L D-葡萄糖)、高糖+槲皮素組(在DMEM培養(yǎng)基中加入25 mmol/L D-葡萄糖及100 μmol/L槲皮素)。

1.3 Western blot法檢測細(xì)胞中自噬標(biāo)志LC3及Beclin-1的表達(dá)

裂解細(xì)胞提取總蛋白后,將50 μg等量總蛋白加樣到SDS-PAGE凝膠上。首先進(jìn)行電泳分離蛋白,之后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。接著在室溫下封閉PVDF膜1 h,用稀釋的一抗LC3、Beclin-1及GAPDH(均為1 ∶1 000)孵育,4 ℃搖床過夜。充分洗膜后,稀釋的HRP標(biāo)記二抗浸泡PVDF膜,室溫下?lián)u床孵育1 h。洗膜后ECL顯色,采用ChemiDoc XRS成像系統(tǒng)拍照,并用Quantity One software進(jìn)行目標(biāo)蛋白條帶灰度信號(hào)分析。

1.4 熒光顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)GFP-LC3融合蛋白的表達(dá)

當(dāng)細(xì)胞生長至89%-90%的密度時(shí),根據(jù)操作說明,采用Lipofectamine 2000將1 μg GFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染RF/6A細(xì)胞以瞬時(shí)過表達(dá)LC3,按照不同分組處理細(xì)胞,轉(zhuǎn)染后24 h,在熒光顯微鏡觀察GFP-LC3點(diǎn)狀聚集物,計(jì)數(shù)GFP陽性細(xì)胞和GFP陽性斑點(diǎn)細(xì)胞(每個(gè)細(xì)胞中有5個(gè)以上明亮的綠色聚集物斑點(diǎn)),在100個(gè)細(xì)胞里計(jì)算GFP陽性斑點(diǎn)細(xì)胞占GFP陽性細(xì)胞總數(shù)的百分比。

1.5 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移

用marker筆在6孔板背后畫橫線,每孔至少穿過5條線,每條線均勻且平行。在每孔內(nèi)接種約5×105個(gè)細(xì)胞,過夜后當(dāng)細(xì)胞鋪勻培養(yǎng)孔底部后用100 μl滅菌的移液槍頭,垂直孔板背后的黑線劃痕,使劃痕與標(biāo)記線相交。劃線完成后,使用無菌PBS洗滌細(xì)胞3次,去除劃下的細(xì)胞,使留下的間隙肉眼即清晰可見,然后更換新鮮低血清的培養(yǎng)基(1%胎牛血清)。按照不同分組處理細(xì)胞,將細(xì)胞放入37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。然后在0 h及24 h取出細(xì)胞,在顯微鏡下觀察并拍照。用Image J軟件劃取6條水平線,計(jì)算細(xì)胞間距離的均值(劃痕寬度)。細(xì)胞的相對遷移距離=24 h遷移距離-0 h遷移距離。

1.6 基質(zhì)膠實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞管腔形成

實(shí)驗(yàn)前24 h將Matrigel置于冰盒中,放入4 ℃冰箱,使膠能過夜緩慢融化,同時(shí)準(zhǔn)備4 ℃預(yù)冷的槍頭和96孔板。在超凈工作臺(tái)中,96孔板每孔內(nèi)緩慢加入200 μl液態(tài)Matrigel,37 ℃孵育30 min使基質(zhì)膠凝固。制備密度為2×105個(gè)/ml的單細(xì)胞懸液,充分混勻后每孔加入50 μl至96孔板,37 ℃靜置8 h,然后在相差顯微鏡下觀察,隨機(jī)取3個(gè)放大200倍的視野采集圖像,采用Image J軟件對形成的管腔樣結(jié)構(gòu)進(jìn)行計(jì)數(shù)(3個(gè)分叉作為1個(gè)血管腔)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 槲皮素抑制高糖誘導(dǎo)的自噬激活

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,三組RF/6A細(xì)胞LC-II/LC3-I比值比較,總體差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=60.64,P<0.001)。三組RF/6A細(xì)胞Beclin-1的表達(dá)比較,總體差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=30.90,P<0.01)。進(jìn)一步組間兩兩比較發(fā)現(xiàn):與對照組相比,高糖組和高糖+槲皮素組細(xì)胞LC3、Beclin-1表達(dá)均明顯升高(均P<0.05);與高糖組相比,高糖+槲皮素組細(xì)胞LC3、Beclin-1表達(dá)明顯下降(均P<0.05,見圖1)。在熒光顯微鏡下,各組細(xì)胞中均可見不同程度的綠色熒光斑點(diǎn)聚集,三組間比較總體差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=733.58,P<0.001)。與對照組相比,高糖組和高糖+槲皮素組的GFP陽性斑點(diǎn)細(xì)胞比例明顯升高,但高糖+槲皮素組比例明顯低于高糖組(均P<0.05,見圖2，3)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,高糖誘導(dǎo)了RF/6A細(xì)胞的自噬激活,而槲皮素可在一定程度上抑制高糖誘導(dǎo)的自噬激活。

與對照組比較,*P<0.05;與高糖組比較,#P<0.05圖1 各組RF/6A細(xì)胞LC3、Beclin-1的蛋白表達(dá)Figure 1 Expression of LC3 and Beclin-1 in RF/6A cells in each group by Western blot

圖2 各組RF/6A細(xì)胞GFP-LC3融合蛋白的表達(dá)Figure 2 Expression of GFP-LC3 fusion protein in RF/6A cells in each group

與對照組比較,*P<0.05;與高糖組比較,#P<0.05圖3 三組RF/6A細(xì)胞中GFP-LC3融合蛋白表達(dá)的比較Figure 3 Comparison of GFP-LC3 fusion protein in RF/6A cells among three groups

2.2 槲皮素抑制高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移

劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,各處理組細(xì)胞均發(fā)生不同程度的遷移。3個(gè)處理組RF/6A細(xì)胞的相對遷移距離比較,總體差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=123.89,P<0.001)。與對照組相比,高糖組和高糖+槲皮素組細(xì)胞遷移距離均明顯增加(均P<0.05)。與高糖組相比,高糖+槲皮素組細(xì)胞遷移距離明顯減小(P<0.05,見圖4)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,高糖環(huán)境下RF/6A細(xì)胞遷移能力明顯增強(qiáng),而槲皮素對高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移具有一定程度的抑制作用。

圖4 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測各組RF/6A細(xì)胞遷移 (×200)Figure 4 Migration of RF/6A cells in each group by scratch assay (×200)

2.3 槲皮素抑制高糖誘導(dǎo)的管腔形成

Matrigel管腔形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,各處理組細(xì)胞均有不同程度的管腔樣結(jié)構(gòu)形成。三組RF/6A細(xì)胞的血管形成數(shù)(個(gè))比較,總體差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=32.07,P<0.01)。與對照組相比,高糖組和高糖+槲皮素組細(xì)胞管腔形成數(shù)明顯增多(均P<0.05)。與高糖組相比,高糖+槲皮素組細(xì)胞管腔形成數(shù)明顯減少(P<0.05,見圖5,6)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,高糖誘導(dǎo)了RF/6A細(xì)胞的管腔形成,而槲皮素對高糖條件下的細(xì)胞管腔形成能力具有一定程度的抑制作用。

圖5 各組RF/6A細(xì)胞管腔形成 (×200)Figure 5 Tube formation of RF/6A cells in each group (×200)

與對照組比較,*P<0.05;與高糖組比較,#P<0.05圖6 三組間RF/6A細(xì)胞管腔形成的比較Figure 6 Comparison of tube formation in RF/6A cells among three groups

3 討論

DR是糖尿病進(jìn)展過程中發(fā)生的一個(gè)嚴(yán)重微血管并發(fā)癥,是導(dǎo)致雙眼失明最主要的原因[1,13]。長期慢性高血糖導(dǎo)致缺血、氧化應(yīng)激,炎癥激活等病理改變,導(dǎo)致血視網(wǎng)膜屏障破壞,大量促血管生成因子的釋放引起視網(wǎng)膜表面滲漏和血管異常增生、出血,最終導(dǎo)致玻璃體積血和視網(wǎng)膜脫離[14,15]。DR導(dǎo)致視網(wǎng)膜的微血管漸進(jìn)性損傷,從而導(dǎo)致患者視力下降甚至失明,嚴(yán)重影響其身心健康,不僅給個(gè)人帶來生活上的不便和心理負(fù)擔(dān),同時(shí)帶來了沉重的社會(huì)負(fù)擔(dān)。雖然現(xiàn)代醫(yī)療技術(shù)不斷進(jìn)步,但DR的治療效果仍然欠佳。視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞功能良好是血-視網(wǎng)膜屏障的保障,在高糖環(huán)境下,一系列的生化改變導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞受損,推進(jìn)DR的發(fā)展。因此認(rèn)為,在DR的發(fā)展過程中,視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙是病情進(jìn)展的主要因素[16]。

槲皮素是人類飲食的主要生物類黃酮,大量存在于洋蔥、蘋果、草莓、葡萄、銀杏等水果和蔬菜中。研究表明,槲皮素具有很強(qiáng)的抗氧化、抗炎、抗新生血管等性質(zhì),在許多疾病中表現(xiàn)出治療潛能[9,17-20]。腫瘤方面的研究提示,槲皮素抑制腫瘤生長的機(jī)制可能與其抑制新生血管生長有很大的關(guān)聯(lián)[7,8,20]。多種內(nèi)皮細(xì)胞被用于研究視網(wǎng)膜血管生成的體外實(shí)驗(yàn),RF/6A細(xì)胞是其中常用的一種視網(wǎng)膜特異性細(xì)胞,這是一個(gè)視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜結(jié)合的細(xì)胞系[21],故本研究中使用RF/6A細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對象。參考Chen等[9]應(yīng)用濃度在10-100 μmol/L的槲皮素處理RF/6A細(xì)胞后,細(xì)胞的增殖、遷移和管腔形成均受到抑制,并且隨著槲皮素濃度的增大抑制作用越明顯。故本實(shí)驗(yàn)采用100 μmol/L槲皮素作用于高糖環(huán)境下的RF/6A細(xì)胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn),槲皮素對高糖誘導(dǎo)的RF/6A細(xì)胞遷移和管腔結(jié)構(gòu)形成具有明顯的抑制作用,提示槲皮素可能有效抑制DR晚期繼發(fā)的視網(wǎng)膜新生血管形成。

細(xì)胞自噬是降解細(xì)胞內(nèi)成分的復(fù)雜生理過程,對于維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)十分重要[22]。已有研究發(fā)現(xiàn),自噬功能異常在許多疾病的病理機(jī)制中發(fā)揮重要作用[23-25]。LC3和Beclin-1是自噬形成過程的關(guān)鍵成分,被最常用作自噬分子標(biāo)記物[26]。LC3以LC3-Ⅰ(胞漿型)和LC3-Ⅱ(膜型)兩種形式存在,當(dāng)自噬發(fā)生時(shí),LC3-Ⅰ在泛素樣反應(yīng)酶的作用下與磷脂酰乙醇胺偶聯(lián)生成LC3-Ⅱ。另外,當(dāng)自噬激活時(shí),GFP-LC3融合蛋白從胞漿內(nèi)轉(zhuǎn)移到自噬體膜,在熒光顯微鏡下形成多個(gè)明亮的綠色熒光斑點(diǎn)。雖然通過電鏡檢測自噬體及其相關(guān)細(xì)胞亞結(jié)構(gòu)是檢測自噬的金標(biāo)準(zhǔn),但由于電鏡操作及數(shù)據(jù)分析專業(yè)性要求較高,目前最常用的方法是Western blot檢測LC3-Ⅰ與LC3-Ⅱ之間的轉(zhuǎn)化和比例變化,以及通過熒光顯微鏡觀察LC3點(diǎn)狀聚集物的形成[27]。本研究結(jié)合這兩種自噬檢測經(jīng)典方法,發(fā)現(xiàn)槲皮素作用后,高糖條件下RF/6A細(xì)胞表達(dá)LC3和Beclin-1蛋白明顯降低,GFP-LC3點(diǎn)狀聚集物陽性細(xì)胞比例也減少,提示槲皮素對高糖誘導(dǎo)的RF/6A細(xì)胞自噬激活具有明顯的抑制作用。

既往研究已證實(shí),細(xì)胞自噬在多種病理情況下可被激活,如缺氧、高糖,進(jìn)而促進(jìn)視網(wǎng)膜或脈絡(luò)膜血管生成過程[11,28]。近年來,國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)槲皮素的效應(yīng)與調(diào)控自噬存在關(guān)聯(lián)。例如,槲皮素可以減輕高糖對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的損傷,而這些有益作用可被自噬抑制劑逆轉(zhuǎn),提示槲皮素對高糖條件下血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用是通過激活自噬反應(yīng)來實(shí)現(xiàn)的[29]。槲皮素可抑制肝缺血損傷導(dǎo)致的肝細(xì)胞凋亡和自噬,減少炎性細(xì)胞因子的釋放,從而發(fā)揮保護(hù)作用[30]。腫瘤方面的系列研究發(fā)現(xiàn),包括槲皮素在內(nèi)的黃酮類化合物可以誘導(dǎo)自噬,通過非凋亡或非典型凋亡途徑直接抑制腫瘤細(xì)胞增殖,也可在誘導(dǎo)自噬后進(jìn)一步引發(fā)凋亡等其他致死方式間接抑制腫瘤細(xì)胞增殖,或通過抑制保護(hù)性自噬從而強(qiáng)化其他形式的殺傷作用[31]。結(jié)合本研究結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道,槲皮素可通過抑制自噬從而對高糖誘導(dǎo)的脈絡(luò)膜和視網(wǎng)膜血管生成發(fā)揮抑制作用,但確切作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究證實(shí)。