楊 穎,胡 家,李 蕾,殷愛紅,李慎濤

(首都醫(yī)科大學中心實驗室蛋白質(zhì)組學研究平臺,北京 100069;*通訊作者,E-mail:lishentao@sina.com)

組蛋白的賴氨酸殘基存在多種翻譯后修飾類型,如乙?；?acetylation)、巴豆?；?crotonylation)、甲基化(methylation)、磷酸化(phosphorylation)和泛素化(ubiquitination)等。這些翻譯后修飾是細胞進行表觀遺傳調(diào)控的方式之一,通常在包括轉(zhuǎn)錄、DNA復制和修復以及染色質(zhì)動力學等DNA-模板進程中發(fā)揮關鍵的作用[1,2]。這些修飾可以被一些效應蛋白選擇性地識別以維持正常的細胞生長和發(fā)育,識別過程的失調(diào)控通常與發(fā)育異常和腫瘤的發(fā)生相關聯(lián)[3,4]。識別過程的調(diào)控機制已成為目前表觀遺傳調(diào)控相關領域內(nèi)的研究熱點。YEATS結構域是一類識別組蛋白?；揎椀拈喿x器。包含YEATS結構域的蛋白與不同修飾組蛋白的親和力存在明顯差異,從而導致其在細胞內(nèi)發(fā)揮不同的功能[5,6]。近年有關YEATS蛋白功能的研究多由其與不同修飾組蛋白多肽的相互作用為切入點,進而深入探究其作用機制[7]。在這些研究中,等溫滴定微量熱(ITC)技術是鑒定YEATS蛋白與不同修飾組蛋白多肽相互作用的主要手段[6]。

表面等離子共振(SPR)和ITC技術是近年來檢測生物分子間相互作用的主要分析技術。但是,由于組蛋白多肽易與芯片基質(zhì)發(fā)生非特異性的吸附,從而限制了SPR技術在此領域內(nèi)的應用。本次實驗旨在采用Biacore T200分析系統(tǒng)建立高通量篩選和鑒定與特定蛋白相互作用的組蛋白多肽的SPR方法。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 SA傳感芯片、HBS-EP+和PBS緩沖液、surfactant P20、5 mol/L NaCl以及200 mmol/L NaOH購自美國GE Healthcare公司;生物素標記試劑盒EZ-Link NHS-LC-LC-Biotin reagents和BCA蛋白定量試劑盒購自美國Thermo Fisher公司;組蛋白多肽(分子量約2 kD)由北京中科亞光生物科技有限公司合成;YEATS2蛋白(分子量25 kD)和牛血清白蛋白BSA購自美國Sigma公司。

1.1.2 儀器 Biacore T200分子互作分析儀,美國GE Healthcare公司;EnVision多標記讀板儀,美國PerkinElmer公司。

1.2 方法

1.2.1 蛋白質(zhì)在SA芯片表面的固定 用生物素標記試劑盒將蛋白(BSA和YEATS2)生物素化,并采用BCA比色法檢測蛋白質(zhì)的濃度。以HBS-EP緩沖液作為蛋白質(zhì)固定過程中的運行緩沖液。將SA芯片裝入儀器中,芯片表面用1 mol/L NaCl和50 mmol/L NaOH的混合液潤洗3次,每次60 s,將蛋白質(zhì)用PBS緩沖液稀釋至50 ng/μl的濃度,以30 μl/min的流速分別注入芯片表面Fc1或Fc2通道,最終達到800 RU左右的固定量。HBS-EP沖洗芯片直至基線穩(wěn)定。

1.2.2 多肽與芯片表面相互作用的測試 用含0.05% P20的PBS緩沖液(PBS-P)作為運行緩沖液,檢測前,用PBS-P高流速沖洗芯片,直至基線穩(wěn)定。將多肽用PBS-P稀釋至250 μmol/L,以30 μl/min的流速分別注入芯片F(xiàn)c1和Fc2通道60 s,先后分別檢測多肽與芯片表面的非特異性結合以及與BSA和YEATS的結合水平。

1.2.3 多肽與蛋白質(zhì)作用的親和力分析 將不同多肽用PBS-P分別稀釋至3.9,7.8,15.6,31.2,62.4,125,250 μmol/L,采用動力學分析Wizard模板中的動力學和親和力法進行動力學實驗,以30 μl/min的流速進樣,結合時間和解離時間均設為60 s,以Fc1作為參比通道,用Biacore T200分析軟件擬合所得數(shù)據(jù),計算不同多肽與蛋白質(zhì)的解離平衡常數(shù)KD。

2 結果

2.1 BSA對H3K27cr多肽與芯片基質(zhì)非特異性結合的影響

將250 μmol/L的H3K27cr多肽注入?yún)⒈韧ǖ繤c1和YEATS2反應通道Fc2中,如圖1A所示,當Fc1未固定BSA時,Fc1傳感曲線迅速上升到200 RU左右,之后緩慢上升,呈時間依賴性,解離過程一開始便迅速下降至基線水平,提示多肽與芯片基質(zhì)存在非特異性結合;而當Fc1固定等量BSA時,進樣后曲線迅速上升至200 RU,之后維持平臺期直至進樣結束,無上升趨勢。圖1B顯示Fc2響應值扣減Fc1響應值得到的傳感圖,排除了多肽與運行緩沖液折光率差異的影響,反映多肽與YEATS2蛋白實際結合水平。如圖1所示,Fc1未固定BSA時,進樣后曲線呈現(xiàn)下降的趨勢,Fc1固定BSA后,多肽與YEATS2的結合過程顯示為快結合快解離。

A. H3K27cr與參比通道Fc1結合的傳感圖 B. H3K27與YEATS2結合的傳感圖圖1 BSA阻斷H3K27cr多肽與芯片基質(zhì)的非特異性結合Figure 1 BSA blocked non-specific interaction between H3K27cr peptide and matrix on the chip

2.2 BSA與H3K27多肽相互作用的檢測

為了研究BSA與H3K27多肽是否存在相互作用,使用Fc1固定BSA的芯片,將H3K27cr多肽倍比稀釋成7個濃度梯度,依次流過芯片表面。傳感圖和擬合結果顯示,多肽流過BSA表面產(chǎn)生的響應值與其濃度呈線性遞增關系(見圖2),提示BSA與多肽無特異性結合。

A. BSA與不同濃度的H3K27cr結合的傳感圖 B. 結合的響應值與H3K27cr濃度的關系曲線圖2 BSA與H3K27cr多肽無特異性結合Figure 2 H3K27cr did not bind to immobilized BSA

2.3 YEATS2與不同修飾的H3K27多肽相互作用親和力的檢測

為了比較YEATS2與帶有不同修飾的H3K27多肽相互作用的親和力,將H3K27cr、H3K27ac和H3K27多肽分別倍比稀釋成不同濃度,依次流過固定了BSA和YEATS2蛋白的芯片,Fc2響應值扣減Fc1響應值所得結果顯示,H3K27cr和H3K27ac與YEATS2的結合過程均為快結合快解離,而H3K27與YEATS2無明顯結合。隨著H3K27cr和H3K27ac濃度升高,與YEATS2相互作用的結合信號也隨之增強,與H3K27cr相比,等濃度H3K27ac與YEATS2的結合水平較低,125 μmol/L的H3K27ac與YEATS2的反應響應值比等摩爾濃度的H3K27cr低50%(見圖3A)。將數(shù)據(jù)用分析軟件進行擬合處理,計算出多肽與YEATS2相互作用的親和力常數(shù)KD(見圖3B)。YEATS2與H3K27cr作用的親和力最高[KD=(40.83±5.31)μmol/L],其次是H3K27ac[KD=(97.50±6.29)μmol/L],H3K27最低(無法確定KD值)。

3 討論

采用SPR技術檢測蛋白質(zhì)與多肽的相互作用,通?？梢赃x擇3種固定配體的方法:①通過氨基偶聯(lián)法將蛋白質(zhì)固定在CM5芯片上;②將生物素標記的多肽固定在SA芯片上;③將生物素標記的蛋白質(zhì)固定在SA芯片上。在本研究中,我們采用了第3種固定方式,同樣是將蛋白固定在芯片上,氨基偶聯(lián)法所形成的酰胺鍵的鍵長約為0.13 nm,可能會導致蛋白質(zhì)的特異性作用位點失活,而生物素標記后間隔臂的長度為前者的20倍,因此SA捕獲法可以充分保留蛋白質(zhì)的結合活性;但是,組蛋白多肽中賴氨酸和精氨酸等堿性氨基酸含量高,其等電點通常為10-11,而芯片的基質(zhì)葡聚糖的等電點為3.5,多肽在中性的運行緩沖液中,易與芯片的基質(zhì)發(fā)生非特異性吸附。因此,第2種固定方式是目前檢測蛋白質(zhì)與多肽相互作用的常用方法[8],但與固定生物素化蛋白方法相比,檢測通量低,芯片消耗量大,不適用于一個蛋白與3個以上多肽相互作用的篩選和鑒定實驗。

在一些研究相互作用的生化實驗中,如Western Blot和ELISA,BSA是封閉液的主要成分,用來封閉非特異性結合位點[9]。此外,在免疫共沉淀實驗中,無關抗體常被用來作為特異性抗體的陰性對照,以排除非特異性相互作用的可能性[10]。在本研究中,我們將等量的生物素標記的BSA固定在參比通道上,一方面,用來封閉芯片基質(zhì)上非特異性結合位點,另一方面,代替芯片上的葡聚糖,作為YEATS2的陰性對照蛋白。由結果可見,BSA不僅有效地阻斷了H3K27多肽與芯片的非特異性吸附,而且其自身與多肽無明顯結合活性。

應用此方法我們檢測了3個不同修飾的H3K27多肽與YEATS2蛋白的結合特征,發(fā)現(xiàn)YEATS2與H3K27多肽的結合水平和親和力均為H3K27cr> H3K27ac> H3K27,由此可見,YEATS2蛋白傾向于結合巴豆?；腍3K27組蛋白,與Zhao等[7]采用ITC技術檢測所得結論吻合。就KD數(shù)值而言,SPR技術檢測的YEATS2與H3K27cr和H3K27ac相互作用的KD分別為40.8 μmol/L和97.5 μmol/L,文獻報道ITC技術檢測的KD值分別為31.7 μmol/L和226.2 μmol/L[7]。KD數(shù)值的差異與采用不同的技術原理和反應體系相關。從時效的角度上比較,本研究方法優(yōu)于ITC技術,用ITC法檢測一對蛋白與多肽的相互作用耗時約1.5 h,切換樣品需人工操作;而SPR法可在無人值守的情況下連續(xù)自動進行一個蛋白與多至10個多肽相互作用的檢測。綜上所述,我們首次采用參比通道固定BSA的方法,解決了多肽與芯片非特異性結合的問題,適用于高通量篩選和鑒定與蛋白質(zhì)相互作用的多肽,可以與ITC技術配合使用。