韋柳霞 何美玲 黃俊清 黃少欣 梁莉 何麗鳳 張玉梅

三陰性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）是一種特殊的乳腺癌類型，占乳腺癌的15%～20%［1］，具有較高的異質性及異型性，目前尚缺乏有效的治療靶點，預后較差［2］。乳腺癌易感基因1（breast cancer susceptibility gene 1，BRCA1） 是 DNA損傷同源重組修復網絡中的關鍵因子，對維持基因組穩(wěn)定具有重要作用。研究表明，BRCA1突變與TNBC發(fā)生發(fā)展密切相關，20%的TNBC存在BRCA1功能缺失［3-4］。鞣花酸（ellagic acid，EA）是一種存在于葡萄、石榴皮、草莓、堅果等植物組織中的多酚類植物化學物質，具有抗炎、抗氧化、抗纖維化、免疫調節(jié)等特性［5］。研究發(fā)現(xiàn)EA主要通過誘導腫瘤細胞凋亡以及抑制細胞周期、血管生成、癌細胞轉移而發(fā)揮抗癌作用，在乳腺癌等多種腫瘤治療中顯示良好的抗癌效果［6-8］。本研究構建BRCA1沉默的人三陰性乳腺癌MDA-MB-231細胞株，探討EA對其細胞增殖、遷移和侵襲能力的影響及作用機制，為TNBC診療尋找新的靶點。

1 材料與方法

1.1 主要材料

人三陰性乳腺癌細胞株MDA-MB-231購自中國科學院細胞庫；BRCA1 siRNA和陰性對照siRNA均購自廣州銳博生物科技有限公司。轉染試劑 LipofectamineTM3000購自美國Invitrogen公司；BRCA1、PARP1兔抗鼠多克隆抗體購自美國Abcam公司；山羊抗兔IgG二抗購自上海碧云天生物技術有限公司；高純度EA（批號：476-66-4，100 g/瓶）購自北京雅安達有限公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

MDA-MB-231細胞置于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，并于 37 °C、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每 3～4 d換液傳代。取對數生長期細胞，并用0.25%胰蛋白酶消化成單細胞懸液，用于后續(xù)實驗。

1.3 實驗分組和siRNA轉染

轉染驗證實驗分為對照組（MDA-MB-231細胞加轉染試劑LipofectamineTM3000）、陰性對照組、siRNA-1組、siRNA-2組和siRNA-3組。將對數生長期的MDAMB-231細胞接種于6孔板（3×105/孔），當融合度為50%～60%時轉染。根據LipofectamineTM3000試劑說明進行細胞瞬時轉染，分別將5 μL siRNA（BRCA1 siRNA或陰性對照siRNA）和5 μL LipofectamineTM3000溶于200 μL Opti-MEM無血清培養(yǎng)基中進行轉染。

1.4 MTT法檢測細胞增殖能力

1.4.1 EA對MDA-MB-231細胞增殖能力的影響 取對數生長期的單細胞懸液接種于96孔板（4×103/孔），共3板，培養(yǎng)18 h后更換新的培養(yǎng)基，每板分別加入不同濃度的 EA（0 μg/mL、1 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL和 20 μg/mL），每個處理組設 6 個復孔，于 37 °C、5%CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h。各孔加入10 μL 0.5%MTT溶液，避光孵育4 h，棄上清后加入150 μL二甲基亞砜，振蕩10 min，用酶標儀測波長為490 nm的吸光度值（OD值），計算細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率（%）=［1-（EA組 OD值-空白組 OD值）/（對照組OD值-空白組OD值）］×100%。同時計算各時間點EA的IC50值，確定后續(xù)實驗的藥物濃度。

1.4.2 EA對BRCA1沉默的MDA-MB-231細胞增殖能力的影響 將陰性對照siRNA和siRNA-1轉染后的MDA-MB-231細胞以及未轉染的MDA-MB-231細胞分別接種于96孔板（4×103／孔），培養(yǎng)18 h后更換新的培養(yǎng)基，分別加入100 μL終濃度為5 μg/mL的EA，并分別設為陰性對照組、siRNA+EA組和EA組，同時設置對照組（siRNA+LipofectamineTM3000）。每組設6個復孔，于37°C、5%CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)0 h、24 h、48 h、72 h、96 h。按 1.4.1 方法測定 OD 值。實驗重復3次。

1.5 RT-qPCR法檢測BRCA1和PARP1 mRNA的表達水平

收集各組細胞，按照Trizol試劑說明書提取細胞總RNA，測定RNA純度及含量，按M-MLV反轉錄試劑盒說明書對mRNA進行反轉錄。引物序列由上海生物工程公司合成，以GAPDH為內參。引物序列：GAPDH上游引物為5′-CAGGAGGCATTGCTGATGAT-3′，下游引物為 5′-GAAGGCTGGGGCTCATTT-3′；BRCA1上游引物為 5′-ACCTTGGAACTGTGAGAACTCT-3′，下游引物為 5′-TCTTGATCTCCCACACTGCAATA-3′；PARP1 上游引物為 5′-CGGAGTCTTCGGATAAGCTCT-3′，下游引物為 5′-TTTCCATCAAACATGGGCGAC-3′。反應體系為20 μL。PCR 反應條件：變性 95 °C 15 s，退火 60 °C 60 s，延伸 72 °C 15 s，40 個循環(huán)。采用 2-ΔΔCt計算mRNA的相對表達量。實驗重復3次。

1.6 Western blot檢測BRCA1和PARP1蛋白的表達水平

收集并裂解各組細胞，提取細胞總蛋白，按BCA蛋白定量試劑盒使用說明書進行蛋白定量分析。加入蛋白樣品（50 μg/孔），于8%聚丙烯酰胺凝膠電泳1.5 h，轉至PVDF膜，用含5%脫脂奶粉的TBST封閉孵育1 h，加入一抗（稀釋比例為 1∶500），4 °C 下孵育過夜，加入二抗（稀釋比例為1∶1 000），孵育1 h。ECL化學發(fā)光曝光檢測，凝膠成像儀觀察分析。實驗重復3次。采用Image Lab軟件分析蛋白條帶灰度值，蛋白相對表達量=PARP蛋白條帶灰度值/GAPDH內參蛋白條帶灰度值。

1.7 劃痕實驗檢測細胞遷移能力

將對照組、EA組、陰性對照組和siRNA+EA組細胞接種于6孔板，并于37°C、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞融合度達80%～90%時棄培養(yǎng)基，以無菌PBS清洗，以200 μL移液器槍頭在培養(yǎng)板每孔的中央沿垂直于橫線劃一直線。無菌PBS漂洗2次去除劃下細胞，在倒置顯微鏡下拍照并記為0 h。EA組、陰性對照組和siRNA+EA組細胞加入2 mL終濃度為5 μg/mL的EA，對照組加入2 mL不含EA的DMEM高糖培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。倒置顯微鏡下觀察24 h、48 h時各組劃痕的愈合情況并拍照記錄。采用Image Pro Plus 6.0軟件計算各時間點劃痕寬度并計算細胞遷移率。細胞遷移率（%）=［（0 h劃痕寬度-24 h（或 48 h）劃痕寬度）/0 h劃痕寬度］×100%。

1.8 Transwell小室檢測細胞的遷移和侵襲能力

對照組、EA組、陰性對照組和siRNA+EA組細胞消化后，加入無血清培養(yǎng)基調整細胞密度為1×104·mL-1，分別接種于含 Matrigel基質膠和不含Matrigel基質膠的24孔Transwell小室上室中，每室200 μL；下室含20%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基，每孔700 μL。常規(guī)培養(yǎng)24 h后取出小室，PBS清洗，擦拭上室內細胞，用結晶紫染色，PDS漂洗。于倒置顯微鏡下觀察，拍照，200倍鏡下隨機選取5個視野計數并計算平均值。

1.9 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 25.0軟件進行數據分析和Graphpad prism 7作圖。計量數據以均數±標準差（±s）表示，多組間樣本均數比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 鞣花酸對MDA-MB-231細胞增殖的影響

MTT 實驗結果顯示，不同濃度的 EA（1～20 μg/mL）處理MDA-MB-231細胞24～72 h均能抑制細胞增殖，見表1。根據MTT實驗結果，可計算出EA作用于MDA-MB-231 細胞 24 h、48 h、72 h 的 IC50分別為13.739 μg/mL、10.645 μg/mL、5.344 μg/mL，考慮不同濃度的EA對MDA-MB-231細胞的增殖均有抑制作用，而1 μg/mL EA作用于MDA-MB-231細胞24 h內抑制率與未加藥組無明顯差異，因此選擇5 μg/mL EA用于后續(xù)實驗。

2.2 構建BRCA1沉默的MDA-MB-231細胞

Western blot檢測結果顯示，對照組、陰性對照組和siRNA-2組在201 kD處存在BRCA1蛋白條帶，而siRNA-1組和siRNA-3組不表達BRCA1（圖1A）。RT-qPCR結果顯示，對照組、陰性對照組、siRNA-1組、siRNA-2組和siRNA-3組的BRCA1 mRNA相對表達量分別為1.018±0.078、1.000±0.088、0.057±0.024、0.423±0.069和0.260±0.023，組間差異有統(tǒng)計學意義（F=145.602，P＜0.001）。其中，對照組與陰性對照組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與對照組和陰性對照組相比，siRNA-1組、siRNA-2組和siRNA-3組的BRCA1 mRNA相對表達量均明顯降低（均P<0.001），且siRNA-1組的相對表達量最低，說明siRNA-1組中BRCA1基因的沉默效果最好（圖1B），因此選擇siRNA-1組的MDA-MB-231細胞用于后續(xù)實驗。

表1 不同濃度的EA對MDA-MB-231細胞增殖能力的影響（±s）Tab.1 Effect of different concentrations of EA on the proliferation of MDA-MB-231 cells（±s）

表1 不同濃度的EA對MDA-MB-231細胞增殖能力的影響（±s）Tab.1 Effect of different concentrations of EA on the proliferation of MDA-MB-231 cells（±s）

aComparison of inhibition rates between different drug concentrations at the same time point，P<0.05；bComparison of inhibition rates at different time points in the same drug concentration group，P<0.05；△Compared with the 0 μg/ml EA group，P＞0.05

Concentrations of EA（μg/mL） 24 h 48 h 72 h 0 0 0 0 1 3.97±1.27b△ 11.09±1.17ab 29.75±1.51ab 5 18.13±1.80ab 24.06±1.36ab 38.78±1.89ab 10 30.29±2.70ab 38.27±1.69ab 51.89±0.93ab 20 70.48±3.53ab 78.81±4.44a 84.64±1.89a Inhibition rate（%）

圖1 沉默BRCA1對MDA-MB-231細胞中BRCA1表達的影響Fig.1 Effect of transfection of BRCA1 siRNA on BRCA1 expression in MDA-MB-231 cells

2.3 EA對BRCA1沉默的MDA-MB-231細胞增殖能力的影響

MTT實驗結果顯示，作用24 h后，對照組、EA組、陰性對照組和siRNA+EA組OD值差異無統(tǒng)計學意義（F=2.871，P=0.104）。作用 48 h、72 h 和 96 h后，4 組的OD值差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.001）。兩兩比較發(fā)現(xiàn)，siRNA+EA組的OD值均低于對照組、EA組和陰性對照組（P<0.001），見表 2。

表2 EA對BRCA1沉默的MDA-MB-231細胞增殖能力的影響（±s）Tab.2 Effect of EA on proliferation of BRCA1 silenced MDA-MB-231 cells（±s）

表2 EA對BRCA1沉默的MDA-MB-231細胞增殖能力的影響（±s）Tab.2 Effect of EA on proliferation of BRCA1 silenced MDA-MB-231 cells（±s）

Group 24 h 48 h 72 h 96 h Control 0.433±0.029 0.559±0.013 1.031±0.031 1.565±0.091 EA 0.415±0.009 0.430±0.006 0.661±0.009 0.908±0.057 Negative control 0.433±0.025 0.455±0.006 0.640±0.028 0.834±0.038 siRNA+EA 0.392±0.006 0.414±0.007 0.428±0.009 0.687±0.032 F 2.871 171.664 793.770 260.484 P 0.104 <0.001 <0.001 <0.001 OD value

2.4 EA對BRCA1沉默的MDA-MB-231細胞遷移能力的影響

劃痕實驗結果顯示，培養(yǎng)24 h和48 h后，對照組、EA組、陰性對照組和siRNA+EA組細胞的遷移率差異均有統(tǒng)計學意義（F=42.749，57.167；均 P<0.001）；兩兩比較顯示，siRNA+EA組細胞遷移率均較其他組低（P<0.01），見圖 2。

圖2 劃痕實驗檢測EA對BRCA1沉默的MDA-MB-231細胞遷移能力的影響（×100）Fig.2 Effect of EA on migration ability of BRCA1 MDA-MB-231 cells detected by scratch assay（×100）

Transwell小室遷移實驗結果顯示，培養(yǎng)24 h后，對照組、EA組、陰性對照組和siRNA+EA組細胞穿膜數差異有統(tǒng)計學意義（F=93.250，P＜0.001）；且 siRNA+EA組的穿膜細胞數明顯低于其他組（P＜0.001），見圖3。

圖3 Transwell小室實驗檢測EA對BRCA1沉默的MDA-MB-231細胞遷移能力的影響（×200）Fig.3 Effect of EA on migration ability of BRCA1 silenced MDA-MB-231 cells detected by Transwell chamber（×200）

2.5 EA對BRCA1沉默的MDA-MB-231細胞侵襲能力的影響

Transwell小室侵襲實驗結果顯示，對照組、EA組、陰性對照組和siRNA+EA組細胞穿膜數差異有統(tǒng)計學意義（F=47.745，P＜0.001）。其中，EA組、陰性對照組和siRNA+EA組的細胞穿膜數均較對照組明顯減少（P＜0.001），且 siRNA+EA 組最少，見圖 4。

2.6 EA對BRCA1沉默的MDA-MB-231細胞中PARP1表達的影響

Western blot和RT-qPCR檢測檢測結果顯示，對照組、EA組、陰性對照組和siRNA+EA組的PARP1蛋白表達量分別為 0.49±0.03、0.30±0.02、0.36±0.01 和0.07±0.01，差異有統(tǒng)計學意義（F=228.194，P＜0.001）；PARP1 mRNA 表達量分別為 1.005±0.005、0.841±0.008、0.703±0.005 和 0.352±0.011，組間比較差異有統(tǒng)計學意義（F=7 790.139，P＜0.001），進一步兩兩比較發(fā)現(xiàn)，siRNA+EA組PARP1蛋白和mRNA表達量均低于其他組（P＜0.001），EA組與陰性對照組比較差異亦有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖 5。

圖4 EA對BRCA1沉默的MDA-MB-231細胞侵襲能力的影響（×200）Fig.4 Effect of EA on invasion ability of BRCA1 silenced MDA-MB-231 cells（×200）

圖5 EA對MDA-MB-231細胞中PARP1表達的影響Fig.5 Effect of EA on the expression of PARP1 in MDA-MB-231 cells

3 討論

TNBC的發(fā)生發(fā)展由多基因、多通路、多分子蛋白共同參與。TNBC因缺乏有效的治療靶點，內分泌治療效果差，目前主要以蒽環(huán)類、紫杉類、鉑類等傳統(tǒng)藥物化療為主，但大多數患者化療后耐藥，療效亦不理想。有研究觀察EA對乳腺癌細胞的影響，發(fā)現(xiàn)20 μmol/L和40 μmol/L EA可抑制人乳腺癌 MCF-7細胞中DNA甲基轉移酶的活性，從而影響DNA甲基化［9］。另有研究發(fā)現(xiàn)，15 μg/mL和20 μg/mL EA 可在 G0/G1期阻滯細胞周期且誘導細胞凋亡，從而抑制MCF-7細胞增殖［10-11］。而 WANG 等［6］研究發(fā)現(xiàn)，2.5～20 μmol/L的EA作用于乳腺癌MDA-MB-231細胞12～48 h后，可抑制細胞的增殖和血管生成。本研究采用不同濃度的 EA（1 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL 和 20 μg/mL）分別作用MDA-MB-231細胞24 h、48 h和72 h后，發(fā)現(xiàn)不同濃度的EA均可抑制MDA-MB-231細胞增殖，且其IC50分別為 13.739 μg/mL、10.645 μg/mL、5.344 μg/mL，因此選擇5 μg/mL EA進行后續(xù)實驗。

BRCA1不僅可激活S期、G2/M期DNA損傷檢測點，還可激活后續(xù)的DNA損傷修復機制，引起腫瘤細胞對化療藥物（如鉑類）耐藥，如BRCA1功能缺失，可使腫瘤細胞對順鉑敏感［12-13］。多項研究報道，與其他化療方案比較，BRCA1/2突變TNBC患者采用以鉑類為基礎的化療方案更能獲益［14-15］。本研究利用脂質體法將BRCA1 siRNA轉染MDA-MB-231細胞，成功構建BRCA1沉默的MDA-MB-231細胞，并采用5μg/mL EA處理，結果發(fā)現(xiàn)EA作用可明顯抑制BRCA1沉默的MDA-MB-231細胞的增殖、遷移和侵襲能力，且較未沉默BRCA1的MDA-MB-231細胞的增殖、遷移和侵襲能力降低，與上述文獻報道一致，說明BRCA1缺失對EA抗三陰性乳腺癌產生積極的影響。

王東等［16］報道，EA可破壞HEK-293細胞內氧化-抗氧化平衡，使細胞處于氧化應激狀態(tài)，造成細胞DNA損傷。另有研究發(fā)現(xiàn)，EA可通過調節(jié)TGF-β/Smad3信號通路而抑制MCF-7細胞增殖［10-11］。此外，EA還可通過PI3K、mTOR等多種信號通路發(fā)揮抗乳腺癌作用［17-19］，而這些信號通路均涉及多種DNA損傷修復的關鍵因子。聚腺苷酸二磷酸核糖聚合酶［poly（ADP-ribose）polymerase，PARP］是參與 DNA 損傷修復的核酶，PARP1為最主要成員之一，具有DNA損傷修復、維持基因組穩(wěn)定和調控細胞代謝、增殖、凋亡等作用［20-21］。TNBC患者多伴BRCA1基因突變或缺失，致使DNA損傷不能通過HRR機制有效修復，導致DNA損傷不斷積累；而當TNBC患者PARP1蛋白表達上調［22］，PARP1抑制劑可用于阻斷DNA單鏈斷裂修復，上述兩種因素共同殺傷腫瘤細胞，即為“協(xié)同致死”機制原理，這正是PARP抑制劑用于BRCA突變或缺失患者的理論依據。初步的臨床試驗研究已證實，BRCA基因突變或缺失的TNBC患者對PARP抑制劑更敏感，療效更明顯［23-25］。而在前列腺癌［26］及結腸癌［27］研究中發(fā)現(xiàn)，EA 在誘導細胞凋亡過程中，均涉及DNA片段化從而導致PARP被切割裂解相關機制。為了明確BRCA1缺失及其相關DNA同源重組修復通路是否對EA抗TNBC產生影響，本研究利用RT-qPCR和Western blot檢測EA作用BRCA1沉默和正常的MDA-MB-231細胞后PARP1的表達情況，結果顯示，siRNA+EA組中PARP1 mRNA和蛋白的表達量均明顯降低，表明EA可顯著抑制BRCA1沉默的三陰性乳腺癌MDA-MB-231細胞的PARP1表達，其作用機制可能與BRCA1缺失導致其相關DNA修復通路障礙有關。

綜上，EA可顯著抑制BRCA1沉默的三陰性乳腺癌MDA-MB-231細胞的增殖、遷移和侵襲，可能與抑制DNA修復通路中關鍵因子PARP1的表達，從而造成相關DNA修復通路障礙有關。但是，BRCA1突變形式多樣，EA對BRCA1突變的三陰性乳腺癌細胞株生物學行為的影響及其作用機制有待在其他三陰乳腺癌細胞中驗證，并探討更多DNA修復通路相關基因的作用。