元建華 張曙波 李建旺 毛山山 崔榮花張罡

結(jié)直腸癌在我國發(fā)病率和死亡率均位居全部惡性腫瘤第5位，且近年來有上升趨勢(shì)［1］。G蛋白偶聯(lián)受體C 家族 5A（G protein-coupled receptor，family C，group 5，member A，GPRC5A）是一個(gè)全反式維甲酸所誘導(dǎo)的基因。GPRC5A在結(jié)直腸癌、肺癌、頭頸鱗狀細(xì)胞癌、胃癌、乳腺癌等腫瘤中均存在異常表達(dá)［2-6］。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）是細(xì)胞中一種重要的酪氨酸磷酸化信號(hào)通路蛋白，其信號(hào)通路是連接炎癥與腫瘤的橋梁，參與了結(jié)直腸癌、頭頸鱗狀細(xì)胞癌和乳腺癌等腫瘤的發(fā)生發(fā)展［7-9］。細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子 3（suppressor of cytokine signaling 3，SOCS3）為SOCS家族的重要分子，參與調(diào)節(jié)多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。研究報(bào)道，STAT3通路相關(guān)基因被激活后，可激活SOCS3并形成一個(gè)經(jīng)典的負(fù)反饋環(huán)，從而下調(diào)STAT3［10］。有研究發(fā)現(xiàn)，GPRC5A在肺腺癌中低表達(dá)，且可能通過穩(wěn)定SOCS3，并抑制STAT3信號(hào)通路傳導(dǎo)而發(fā)揮抑癌作用［11］。但目前三者在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用不明確。本研究檢測(cè)GPRC5A、SOCS3及STAT3在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)及其與臨床病理特征及三者表達(dá)的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2015年1月至2017年12月于中南大學(xué)湘雅醫(yī)院附屬?？卺t(yī)院手術(shù)切除的76例結(jié)直腸癌患者的癌組織及30例相應(yīng)癌旁正常組織（距癌組織≥5 cm）的石蠟標(biāo)本；同時(shí)收集患者臨床資料，主要包括性別、年齡、TNM分期（AJCC第八版分期標(biāo)準(zhǔn)）、腫瘤大小、部位、分化程度、浸潤深度及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等。納入標(biāo)準(zhǔn)：⑴所有患者均經(jīng)病理組織學(xué)檢查確診；⑵經(jīng)評(píng)估患者生存期＞3個(gè)月；⑶術(shù)前未進(jìn)行新輔助化療或放療。排除標(biāo)準(zhǔn)：⑴結(jié)直腸癌復(fù)發(fā)者；⑵合并其他惡性腫瘤者；⑶存在嚴(yán)重器質(zhì)性疾病者；⑷臨床資料不全者。本研究共納入76例結(jié)直腸癌患者，其中男43例，女33例；年齡32～84歲，中位年齡57歲。本研究經(jīng)中南大學(xué)湘雅醫(yī)院附屬?？卺t(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者及其家屬知情同意。

1.2 主要試劑

兔抗GPRC5A多克隆抗體購自美國Proteintech生物公司，鼠抗人多克隆抗體SOCS3、鼠抗人STAT3及顯色試劑盒均購自武漢谷歌生物科技有限公司。

1.3 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)GPRC5A、SOCS3和STAT3蛋白表達(dá)情況

組織經(jīng)切片、烘片、常規(guī)脫蠟、水化、PBS沖洗后，采用檸檬酸修復(fù)液修復(fù)。根據(jù)Envision法阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，血清封閉30 min，滴加一抗兔抗GPRC5A（稀釋比例為 1∶150）、鼠抗人 SOCS3（稀釋比例為 1∶100）和鼠抗人STAT3（稀釋比例為 1∶100），室溫孵育2 h，滴加EnVisionTM孵育30 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，0.1%HCl分化，自來水沖洗，藍(lán)化，梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固，顯微鏡下觀察；PBS替代一抗作陰性對(duì)照。

1.4 染色結(jié)果判定

GPRC5A的陽性染色于細(xì)胞膜，呈棕黃色或棕褐色顆粒，部分表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)；SOCS3的陽性染色主要定位于細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色或棕褐色顆粒，STAT3表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)，少數(shù)細(xì)胞核著色，染色陽性信號(hào)顆粒呈棕黃色或棕褐色。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍鏡視野，根據(jù)陽性細(xì)胞所占百分比和染色強(qiáng)度計(jì)算總評(píng)分。陽性細(xì)胞所占百分比計(jì)分：0～5%計(jì)為0分，6%～25%計(jì)為1分，26%～50%計(jì)為2分，51%～75%計(jì)為3分，＞75%計(jì)為4分。染色強(qiáng)度：無著色計(jì)為0分，淡黃色計(jì)為1分，棕黃色計(jì)為2分，棕褐色計(jì)為3分。兩項(xiàng)得分乘積≤3分為陰性（-），4～8分為弱陽性（+），8～12分為強(qiáng)陽性（++）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。GPRC5A、SOCS3、STAT3在癌組織和癌旁正常組織的表達(dá)差異及其與臨床病理特征的關(guān)系采用χ2檢驗(yàn)；三者相關(guān)性采用Spearman相關(guān)分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GPRC5A、SOCS3和STAT3在結(jié)直腸癌組織中的陽性表達(dá)情況

GPRC5A陽性表達(dá)定位于細(xì)胞膜和胞質(zhì)內(nèi)，SOCS3陽性表達(dá)主要定位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，STAT3陽性表達(dá)主要在細(xì)胞質(zhì)，少數(shù)細(xì)胞核染色，見圖1。結(jié)直腸癌組織中GPRC5A和STAT3的陽性表達(dá)率均高于癌旁正常組織（59.2%vs 33.3%，P＝0.016；69.7%vs 30.0%，P＝0.001），而SOCS3陽性表達(dá)率則低于癌旁正常組織（38.2%vs 80.0%，P＝0.001）。見表 1。

圖1 GPRC5A、SOCS3和STAT3在結(jié)直腸癌及癌旁正常組織中的陽性表達(dá)情況（×200）Fig.1 Expression of GPRC5A，SOCS3 and STAT3 in colorectal cancer tissues and adjacent normal tissues（×200）

表1 GPRC5A、SOCS3和STAT3在結(jié)直腸癌組織及癌旁正常組織中陽性表達(dá)情況的比較［n（%）］Tab.1 Comparison of the positive expression of GPRC5A，SOCS3 and STAT3 in colorectal cancer tissues and adjacent normal tissues［n（%）］

2.2 GPRC5A、SOCS3和STAT3的表達(dá)與結(jié)直腸癌患者臨床病理特征的關(guān)系

GPRC5A表達(dá)與結(jié)直腸癌的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期有關(guān)（P<0.05），SOCS3和STAT3表達(dá)與結(jié)直腸癌的分化程度、腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期有關(guān)（P<0.05）。見表2。

2.3 結(jié)直腸癌組織中GPRC5A與SOCS3、STAT3表達(dá)的相關(guān)性

Spearman相關(guān)分析顯示，結(jié)直腸癌組織中GPRC5A與 SOCS3 表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=－0.340，P=0.003），與STAT3表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.327，P=0.004）；而 SOCS3與STAT3表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=－0.308，P=0.007）。

3 討論

GPRC5A是GPCR家族成員之一。研究表明，GPRC5A在多種腫瘤中異常表達(dá)，但在不同腫瘤類型中的表達(dá)水平及在腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用存在明顯差異，其中GPRC5A在肺癌［3］和頭頸鱗狀細(xì)胞癌［4］可能作為抑癌基因，而在胃癌［5］和乳腺癌［6］中被認(rèn)為是促癌基因。SOCS3是SOCS家族重要成員之一，其結(jié)構(gòu)中含有氨基端的激酶抑制區(qū)，是JAK強(qiáng)抑制劑。JIANG等［12］研究發(fā)現(xiàn)，抑制SOCS3的表達(dá)可促進(jìn)肝癌細(xì)胞生長和增殖，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦顯示SOCS3表達(dá)缺失可促進(jìn)肝癌生長、侵襲和轉(zhuǎn)移。STATs蛋白家族是一類可被多種細(xì)胞因子激活的轉(zhuǎn)錄因子家族，STAT3是其成員之一，在細(xì)胞生長代謝和腫瘤發(fā)生發(fā)展中具有重要作用［13］。有研究發(fā)現(xiàn)，STAT3在頭頸鱗狀細(xì)胞癌、乳腺癌、胃癌、前列腺癌、腎癌等腫瘤中均被激活，被認(rèn)為是一種促癌基因，且與預(yù)后密切相關(guān)［4，8-9］。近年來有研究發(fā)現(xiàn)，GPCR5A在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)較正常結(jié)直腸組織和結(jié)直腸息肉組織明顯升高［2，14］，STAT3在結(jié)直腸癌組織中的陽性表達(dá)率亦高于癌旁正常組織［7］，但SOCS3在結(jié)直腸癌組織中的陽性表達(dá)率低于癌旁組織［15］。本研究檢測(cè)GPCR5A、SOCS3和STAT3在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)相較于癌旁正常組織，GPCR5A和STAT3在結(jié)直腸癌組織中的陽性表達(dá)率明顯升高，而SOCS3陽性表達(dá)率則明顯降低，與上述文獻(xiàn)報(bào)道一致。分析3個(gè)指標(biāo)與結(jié)直腸癌患者臨床病理特征的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)GPRC5A和STAT3高表達(dá)患者及SOCS3低表達(dá)患者腫瘤分化程度更差、TNM分期更晚和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的可能性更大，提示GPRC5A、STAT3和SOCS3可能參與結(jié)直腸癌發(fā)生以及侵襲轉(zhuǎn)移。

表2 GPRC5A、SOCS3和STAT3的表達(dá)與結(jié)直腸癌患者臨床病理特征的關(guān)系［n（%）］Tab.2 Relationship of the expression of GPRC5A，SOCS3 and STAT3 and clinicopathological features of patients with colorectal cancer［n（%）］

有研究發(fā)現(xiàn)，SOCS對(duì)JAK/STATs信號(hào)通路具有負(fù)性調(diào)控作用，且在維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞過度生長等方面發(fā)揮至關(guān)重要的調(diào)控作用［16］。在肺癌研究中，GPRC5A表達(dá)被抑制或者敲除后，EGFR、STAT3、NF-κB、cAMP 等多條信號(hào)通路被過度激活［3，11］，認(rèn)為 GPRC5A 可能通過穩(wěn)定 SOCS3，抑制STAT3信號(hào)通路傳導(dǎo)，發(fā)揮其抑癌作用［11］。而龐玲等［17］在非小細(xì)胞肺癌的研究中發(fā)現(xiàn)GPRC5A與SOCS3呈正相關(guān)，SOCS3與STAT3呈負(fù)相關(guān)。本研究進(jìn)一步分析結(jié)直腸癌組織中三者表達(dá)的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)GPCR5A與STAT3表達(dá)呈正相關(guān)，與SOCS3表達(dá)呈負(fù)相關(guān)；而STAT3與SOCS3表達(dá)亦呈負(fù)相關(guān)，與龐玲等［17］研究結(jié)果一致。

綜上所述，GPRC5A和STAT3在結(jié)直腸癌組織中高表達(dá)，而SOCS3在結(jié)直腸癌組織中低表達(dá)，三者在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)具有顯著相關(guān)性，GPRC5A與STAT3可能協(xié)同作用并下調(diào)SOCS3表達(dá)而促進(jìn)結(jié)直腸癌發(fā)生及進(jìn)展。聯(lián)合檢測(cè) GPRC5A、STAT3和SOCS3可能有助于結(jié)直腸癌診斷及評(píng)估疾病狀況。但本研究樣本量較少，三者在結(jié)直腸癌中的作用及其相互作用的具體機(jī)制仍不清楚，需進(jìn)一步研究驗(yàn)證。