唐勇 劉海洲陳曦吳健勇劉螢照 楊林凱 王琪

微小 RNA（microRNAs，miRNAs）大約由 20 個(gè)內(nèi)源性非編碼RNA組成，真核生物miRNAs通過(guò)與mRNA結(jié)合調(diào)節(jié)基因表達(dá)［1］。近年來(lái)，研究證實(shí)miRNA在腫瘤發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中起重要作用，可作為腫瘤診斷標(biāo)志物及治療的分子靶點(diǎn)［2-3］。其中，miR-200家族被發(fā)現(xiàn)可負(fù)調(diào)控下游E-Cadherin相關(guān)轉(zhuǎn)錄抑制因子ZEB1和ZEB2而調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)換（epithelial-mesenchymal transition，EMT）過(guò)程，可能抑制腫瘤轉(zhuǎn)移［4］，因而將其定義為一種潛在的治療藥物［5］。然而，研究者亦發(fā)現(xiàn)miR-200家族在不同類型癌癥中顯示出抑制或促進(jìn)轉(zhuǎn)移的相互矛盾作用，miR-200家族表達(dá)與腫瘤預(yù)后的關(guān)系也存在截然相反的報(bào)道［6］。miR-141、miR-200b和miR-200c被認(rèn)為是影響原發(fā)性腎透明細(xì)胞癌（clear cell renal cell carcinoma，ccRCC）的獨(dú)立預(yù)后標(biāo)志物［7］。過(guò)表達(dá)miR-200可抑制肺癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移［8］，但也可增強(qiáng)乳腺癌模型轉(zhuǎn)移［9］。另有研究發(fā)現(xiàn)，miR-200家族對(duì)不同腫瘤的調(diào)控機(jī)制具有差異性［10］。因此，發(fā)現(xiàn)和解釋miR-200家族的驅(qū)動(dòng)生物學(xué)差異，將對(duì)基于miR-200家族的個(gè)體化治療具有重要意義。

miR-200 家 族 共 包 括 miR-429、miR-200a、miR-200b、miR-200c和 miR-141等 5個(gè) miRNAs分子。miR-200a、miR-200b、miR-429 具有相同的核心序列“AAUACU”，而miR-200c、miR-141核心序列為“AACACU”。miR-200家族因具有序列保守性，被認(rèn)為存在相同的靶基因，并參與相似的生理調(diào)控功能，有助于分析其潛在調(diào)控機(jī)制。本研究利用癌癥基因圖譜（the Cancer GenomeAtlas，TCGA）收錄的PanCanAtlas轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，根據(jù)miR-200家族表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系，對(duì)21種腫瘤進(jìn)行分子分型，探討miR-200家族調(diào)控腫瘤異質(zhì)性的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 泛癌樣本

研究對(duì)象來(lái)自TCGA分析工作組（AWGs）定義的泛癌（Pan-Cancer）樣本，選擇21種不同組織病理學(xué)的惡性實(shí)體腫瘤類型共7 642例樣本進(jìn)行分析。從PanCanAtlas項(xiàng)目網(wǎng)站（https：//gdc.cancer.gov/aboutdata/publications/pancanatlas）分別下載患者的臨床特征數(shù)據(jù) TCGA Clinical Data Resource（TCGA-CDR）Outcome，miRNA轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù) pancanMiRs_EBadjOn-ProtocolPlatformWithoutRepsWithUnCorr--ectMiRs_08_04_16.csv和RNA-seq數(shù)據(jù)EBPlusPlusAdjustPANCAN_IlluminaHi-Seq_RNASeqV2.geneExp.tsv。

1.2 組織芯片樣本

組織芯片（tissue microarray，TMA）制作選擇廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院2009年5月至2014年12月的膀胱癌手術(shù)組織蠟塊，所有標(biāo)本均經(jīng)臨床及病理確診，具有完整的臨床及病理學(xué)資料。共納入100例膀胱癌患者，平均年齡（64.13±9.57）歲，pTNM 分期T0期3例，T1～T2期 45例，T3～T4期 52例；肌層浸潤(rùn)88例。

1.3 miR-200家族與預(yù)后的相關(guān)性分析

TCGA臨床終點(diǎn)統(tǒng)計(jì)根據(jù)PanCanAtlas生存工作組新開(kāi)發(fā)的TCGA泛癌臨床標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)集（TCGA Pan-Cancer Clinical Data Resource，TCGA-CDR［11］），以臨床確診至因任何原因引起死亡的時(shí)間為總生存期（overall survival，OS），每種腫瘤取 5個(gè) miRNA 表達(dá)值。根據(jù)miRNA值中位數(shù)，將患者劃分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，并比較生存情況。

1.4 miR-200家族靶標(biāo)基因預(yù)測(cè)

采用Mirwalk3在線網(wǎng)站（http：//mirwalk.umm.uniheidelberg.de/search_mirnas/）對(duì)miR-200家族靶標(biāo)基因進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，預(yù)測(cè)miRNA靶向結(jié)合3'非翻譯區(qū)（untranslated region，UTR）或蛋白質(zhì)編碼區(qū)域（coding sequence，CDS）的 mRNA，以 Targetscan 和 miRDB 數(shù)據(jù)庫(kù)均預(yù)測(cè)到的基因作為miR-200家族靶標(biāo)基因合集。

1.5 WGCNA聚類分析

選擇PanCanAtlas項(xiàng)目中膀胱癌、胃腺癌、腎乳頭狀細(xì)胞癌、肝細(xì)胞癌、胸腺瘤的RNA-seq數(shù)據(jù)，提取miR-200家族靶標(biāo)基因集合的表達(dá)值。miR-200家族表達(dá)值作為輸入表型，運(yùn)行加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析（weighted correlation network analysis，WGCNA）R 語(yǔ)言包，假定基因網(wǎng)絡(luò)服從無(wú)尺度分布，不同節(jié)點(diǎn)的相異系數(shù)大于0.8，找出miR-200關(guān)聯(lián)性最高和協(xié)同表達(dá)的基因模塊，模塊內(nèi)基因與輸入表型相關(guān)系數(shù)≥0.2或≤-0.2視為顯著互作。采用cystoscape中的cytohubba插件計(jì)算該模塊中最核心的5個(gè)基因作為單個(gè)miRNA調(diào)控信號(hào)通路。

1.6 TMA免疫組組化學(xué)法檢測(cè)

膀胱癌TMA為本實(shí)驗(yàn)室自制，以辣根過(guò)氧化物酶顯色的免疫組織化學(xué)法檢測(cè)芯片金屬蛋白酶抑制劑 2（TIMP metallopeptidase inhibitor 2，TIMP2）的表達(dá)。結(jié)果由2位病理醫(yī)師采取雙盲法判定，評(píng)分不一致的切片取均值。綜合每張切片的染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行判定。根據(jù)切片組織中細(xì)胞顯色深淺分為5個(gè)評(píng)分等級(jí)：無(wú)顯色記為0分，淡黃色記為1分，黃色記為2分，棕色記為3分，棕褐色記為4分。陽(yáng)性細(xì)胞占同類細(xì)胞數(shù)的百分比評(píng)分：無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞記為0分，≤5%記為1分，6%～25%記為 2分，26%～50%記為3分，51%～75%記為4分，＞75%記為5分。以上述2項(xiàng)的乘積為最終總積分。根據(jù)TIMP2值中位數(shù)，將患者劃分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，并比較生存情況。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)組織miRNA表達(dá)

選取制作TMA的膀胱癌石蠟標(biāo)本提取RNA，按照Qiagen公司的miScriptII Reverse Transcription Kit試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行總miRNA的cDNA合成，熒光定量PCR反應(yīng)體系的下游引物使用miScript SYBR Green PCR Kit試劑盒中提供的通用引物，上游引物由英濰捷基（廣州）貿(mào)易有限公司合成。以人U6 snRNA為內(nèi)參，采用相對(duì)定量法檢測(cè)miR-200家族成員在膀胱癌組織的表達(dá)，以 ΔCt表示 miRNA表達(dá)量，ΔCt=［目的miRNA的Ct值（樣本組）-U6的Ct值（樣本組）］。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用R Studio（版本號(hào)3.6.1）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。采用pearson相關(guān)系數(shù)分析miR-200家族表達(dá)水平與TIMP2蛋白表達(dá)的線性關(guān)系，生存率計(jì)算采用Kaplan-Meier法，Log-rank法比較生存差異，擬合Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型進(jìn)行生存比較，計(jì)算預(yù)測(cè)因子的風(fēng)險(xiǎn)比率（hazard ratio，HR）及 95%可信區(qū)間（confidence interval，CI），HR＜1為保護(hù)因素，反之為危險(xiǎn)因素。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-200家族與不同腫瘤預(yù)后的相關(guān)性

利用PanCanAtlas數(shù)據(jù)分析21種實(shí)體腫瘤的總生存時(shí)間，繪制生存比較森林圖，結(jié)果顯示，miR-429、miR-200a、miR-200b、miR-200c和 miR-141等 5個(gè)miRNAs分子與不同腫瘤生存時(shí)間顯著相關(guān)。miR-200家族高表達(dá)是膀胱癌（HR=0.55～0.68，P=0.0001～0.0340）和胃腺癌（HR=0.61～0.72，P=0.0055～0.0170）預(yù)后的保護(hù)因素。但是高表達(dá)miR-200家族的肝細(xì)胞癌（HR=1.46～1.65，P=0.0061～0.0120）和胸腺瘤（HR=7.44～13.04，P=0.0002～0.0210）患者總生存時(shí)間明顯較低表達(dá)組短。具有相同核心序列的miR-200家族成員（miR-200a、miR-200b、miR-429）高表達(dá)可顯著提高腎乳頭狀細(xì)胞癌患者OS（HR=0.23～0.28，P＜0.0001），而 miR-141和miR-200c高表達(dá)組是患者OS的危險(xiǎn)因素（HR=2.53～2.90，P=0.0004～0.0016），圖 1。

2.2 miR-200家族靶標(biāo)基因在不同腫瘤間的異質(zhì)性分析

Mirwalk3在線網(wǎng)站預(yù)測(cè)miR-200家族靶向結(jié)合的mRNA，Targetscan和miRDB數(shù)據(jù)庫(kù)均預(yù)測(cè)到的基因共有356個(gè)，以此作為miR-200家族靶標(biāo)基因合集。根據(jù)miR-200家族對(duì)腫瘤生存的影響，選取其與生存呈正相關(guān)的膀胱癌和胃腺癌、與生存呈負(fù)相關(guān)的肝細(xì)胞癌和胸腺瘤以及相關(guān)性不同的腎乳頭狀細(xì)胞癌進(jìn)行miRNA靶標(biāo)基因的腫瘤間異質(zhì)性分析。WGCNA聚類結(jié)果顯示，miR-200家族與5種腫瘤的相關(guān)模塊基因均不一致，存在明顯的腫瘤間異質(zhì)性，其中膀胱癌、腎乳頭狀細(xì)胞癌和胸腺瘤可富集到顯著相關(guān)模塊，肝細(xì)胞癌和胃腺癌無(wú)相關(guān)性。

膀胱癌中，miR-200家族富集到1個(gè)負(fù)顯著相關(guān)mRNA模塊（圖2A），包括7個(gè)靶基因（圖2B），其中TIMP2、SULF1基因與miR-200家族表達(dá)顯著相關(guān)（圖2C）。利用TCGA的RNA-seq數(shù)據(jù)分析，結(jié)果顯示TIMP2基因高表達(dá)是膀胱癌患者總生存時(shí)間的危險(xiǎn)因素（HR=1.55，95%CI：1.16～2.08，P=0.0031，圖 2D）。

在腎乳頭狀細(xì)胞癌中，miR-141和miR-429富集到1個(gè)共同的靶基因模塊（圖3A），miR-141對(duì)模塊中包括EPHA2在內(nèi)的8個(gè)基因顯示出明顯負(fù)相關(guān)（r＜-0.2）。miR-429負(fù)調(diào)控靶向基因?yàn)閂AT1L和ELAVL2（圖3B），且與 EPHA2和 PTPN13基因表達(dá)呈正相關(guān)（r＝0.325，0.282），見(jiàn)圖 3C。胸腺瘤未富集到與 miR-200家族呈負(fù)相關(guān)的靶基因模塊（圖4A～B），且miR-429表達(dá)水平與EPHA2和PTPN13基因一致，PTPN13是影響胸腺瘤生存時(shí)間的危險(xiǎn)因素（HR=4.65，95%CI：1.08～20.13，P=0.025，圖 4C）。

2.3 膀胱癌miR-200家族靶向調(diào)控TIMP2的驗(yàn)證

選取本課題組自制的膀胱癌TMA驗(yàn)證miR-200家族對(duì)TIMP2的調(diào)控作用。熒光定量PCR檢測(cè)miR-200家族成員表達(dá)，免疫組織化學(xué)法檢測(cè)TIMP2蛋白表達(dá)（圖5A），病理評(píng)分結(jié)果顯示TIMP2蛋白在膀胱癌組織中的表達(dá)范圍是0～12，中位值為4.33。miR-200家族成員與TIMP2蛋白表達(dá)的pearson相關(guān)性分析顯示，miR-429、miR-200a、miR-200b、miR-200c和miR-141等5個(gè)miRNAs分子均與TIMP2蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r＜-0.5，P＜0.001，圖 5B），且高表達(dá) TIMP2 蛋白的膀胱癌患者總生存時(shí)間較低表達(dá)患者短（HR=0.68，95%CI：0.41～0.91，P=0.002，圖 5C）。

3 討論

圖1 miR-200家族成員與21種實(shí)體腫瘤總生存期的關(guān)系Fig.1 Relationship between miR-200 family members and overall survival of 21 solid tumors

圖2 miR-200家族靶向調(diào)控膀胱癌的基因富集分析Fig.2 miR-200 family targeted gene enrichment in bladder cancer

圖3 miR-200家族靶向調(diào)控腎乳頭狀細(xì)胞癌的基因富集分析Fig.3 miR-200 family targeted gene enrichment in renal papillary cell carcinoma

圖4 miR-200家族靶向調(diào)控胸腺瘤的基因富集分析Fig.4 miR-200 family targeted gene enrichment in thymoma

圖5 膀胱癌組織中TIMP2蛋白表達(dá)與miR-200家族表達(dá)的相關(guān)性驗(yàn)證Fig.5 Correlation between TIMP2 protein expression and miR-200 family expression in bladder cancer

miR-200家族因被發(fā)現(xiàn)可抑制ZEB1/ZEB2基因，參與調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞凋亡［12］及EMT途徑［13］，被認(rèn)為在癌癥預(yù)后判斷及治療中具有巨大潛力［14］。然而，利用miR-200家族預(yù)測(cè)不同腫瘤預(yù)后的結(jié)果完全相反［15-17］。miR-200對(duì)不同腫瘤預(yù)后影響的Meta分析亦得出完全相反結(jié)論，認(rèn)為miR-200家族具有較高的預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)異質(zhì)性［18］。對(duì)于這一異質(zhì)性結(jié)果，研究者最初考慮受種族、測(cè)試方法、樣本大小和樣本保存影響。然而，PanCanAtlas項(xiàng)目排除上述因素差異后，發(fā)現(xiàn)miR-200家族表達(dá)對(duì)腫瘤患者OS和PFS的預(yù)測(cè)仍存在顯著異質(zhì)性，因此我們推測(cè)miR-200家族特異性成員在不同器官或組織中的表達(dá)水平不同，以及不同腫瘤組織中miR-200家族靶基因的異質(zhì)性，導(dǎo)致miR-200家族評(píng)估預(yù)后的差異。

本研究對(duì)排除實(shí)驗(yàn)因素影響的21種實(shí)體腫瘤，分析miR-200家族與患者OS的關(guān)系，結(jié)果顯示miR-200家族高表達(dá)是膀胱癌和胃腺癌患者生存時(shí)間的保護(hù)因素，是肝癌和胸腺瘤患者生存時(shí)間的危險(xiǎn)因素；miR-200a、miR-200b、miR-429 和 miR-200c、miR-141對(duì)腎乳頭狀細(xì)胞癌生存的影響則相反，證實(shí)miR-200家族核心序列差異對(duì)不同腫瘤預(yù)后的影響具有異質(zhì)性。進(jìn)一步對(duì)miR-200家族靶基因進(jìn)行聚類分析，發(fā)現(xiàn)miR-200家族高表達(dá)可延長(zhǎng)膀胱癌患者總生存時(shí)間，且顯著負(fù)調(diào)控靶標(biāo)基因TIMP2的表達(dá)，提示miR-200家族可能通過(guò)下調(diào)TIMP2基因表達(dá)而抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移，是膀胱癌潛在的良好預(yù)后判斷指標(biāo)。本研究同時(shí)采用自建的膀胱癌TMA驗(yàn)證，亦證實(shí)miR-200家族與TIMP2蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，且TIMP2蛋白表達(dá)升高是膀胱癌的不良預(yù)后因素。

研究報(bào)道，EPHA2基因與肝癌、乳腺癌、前列腺癌和胰腺癌等增殖和轉(zhuǎn)移有關(guān)，被認(rèn)為是癌基因及治療靶標(biāo)［19］。本研究靶基因富集聚類分析顯示miR-141可負(fù)調(diào)控腎乳頭狀細(xì)胞癌EPHA2基因表達(dá)，推測(cè)miR-141可能通過(guò)靶向抑制EPHA2表達(dá)，從而延長(zhǎng)患者生存時(shí)間。而胸腺瘤分析結(jié)果顯示miR-429與EPHA2和PTPN13表達(dá)均呈正相關(guān)，說(shuō)明miR-429介導(dǎo)EPHA2和PTPN13表達(dá)可能導(dǎo)致腎乳頭狀細(xì)胞癌和胸腺瘤不良預(yù)后。研究發(fā)現(xiàn)PTPN13可通過(guò)引發(fā)src激酶失活而調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞侵襲性［20］。有研究認(rèn)為miRNA通過(guò)靶向3'UTR的mRNA抑制轉(zhuǎn)錄和靶向CDS區(qū)抑制蛋白質(zhì)翻譯［21］，但miRNA促基因表達(dá)的機(jī)制不明，miR-429靶向調(diào)控何基因后導(dǎo)致EPHA2和PTPN13升高的具體機(jī)制尚不清楚。

本研究表明，miR-200家族對(duì)不同腫瘤預(yù)后的影響具有異質(zhì)性，miR-200家族靶標(biāo)分子眾多，而這些基因在不同組織及腫瘤亞型表達(dá)的差異可能導(dǎo)致了miR-200家族生物功能異質(zhì)性，但具體機(jī)制尚不明確，有待未來(lái)選擇更多腫瘤樣本進(jìn)一步研究。