牛霞 張曉娟 畢煬輝 張玲

食管癌是常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率和死亡率分別位居惡性腫瘤第三位和第四位［1］。與西方國家不同，我國食管癌組織學類型以食管鱗狀細胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）為主。目前，ESCC治療主要以手術(shù)結(jié)合放化療為主，但療效均不理想，5年生存率僅10%左右［2］。隨著分子靶向藥物在多種實體腫瘤成功應(yīng)用，ESCC的分子靶向治療也成為研究的熱點，但目前已知的治療靶點非常有限。

近年來，隨著新一代測序技術(shù)不斷發(fā)展，包括ESCC在內(nèi)的癌癥基因組學研究取得了較大進展［3-7］。本課題組前期應(yīng)用全基因組測序及外顯子組測序分別對14例及90例太行山ESCC高發(fā)區(qū)的ESCC患者癌組織及其配對癌旁正常組織進行研究，在全基因組水平篩選了食管癌相關(guān)的單核苷酸變異（single nucleotide variation，SNV）、小片段插入/缺失（insertion anddeletion，InDels）、拷貝數(shù)變異（copy number variation，CNV）及結(jié)構(gòu)變異（structure variation，SV）等遺傳變異，鑒定出可能賦予癌細胞選擇性生長優(yōu)勢的顯著突變基因及拷貝數(shù)變異受累基因，如 TP53、PIK3CA、NOTCH1、CDKN2A、ZNF750、FBXW7［3］。這些基因的變異可能是ESCC發(fā)生發(fā)展中的驅(qū)動事件，也可能是精準有效的分子治療靶點。蛋白酶體抑制劑已被應(yīng)用于多發(fā)性骨髓瘤、急性髓系白血病和結(jié)直腸癌等多種腫瘤中，但對ESCC的作用尚未見報道［8］。本研究進一步利用DGIdb公共藥物-基因相互作用數(shù)據(jù)庫，對前期及其他課題組已經(jīng)發(fā)表的基因組學測序數(shù)據(jù)進行分析［3-7］，篩選ESCC相關(guān)候選藥物靶基因，并進行信號通路富集分析，發(fā)現(xiàn)靶向蛋白酶體可能是ESCC治療的潛在靶點，因此進一步在體內(nèi)及體外探討蛋白酶體抑制劑硼替佐米對ESCC細胞生長的影響，以期為蛋白酶體抑制劑應(yīng)用于ESCC靶向治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

ESCC 細胞株 KYSE30、KYSE180、KYSE150、TE1、KYSE510和 Eca-109購自美國ATCC公司，由山西醫(yī)科大學轉(zhuǎn)化醫(yī)學研究中心保存。20只BALB/c裸鼠購自上海斯萊克實驗動物有限公司，雌性，4周齡，體重14～16 g，于無特殊病原體動物飼養(yǎng)室飼養(yǎng)，動物實驗經(jīng)山西醫(yī)科大學倫理委員會批準（批準號：2017LL037）。RMPI 1640培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶、胎牛血清購自Hyclone公司，四甲基偶氮唑藍（MTT）、二甲基亞砜購自美國Sigma公司，硼替佐米（bortezomib，26S蛋白酶體抑制劑）購自Selleck Chemicals公司，Ki-67鼠抗人單克隆抗體購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。光學顯微鏡為Olympus產(chǎn)品，自動酶標儀購自美國BioTek公司。

1.2 數(shù)據(jù)分析

基因組測序數(shù)據(jù)源自5個獨立隊列總共469例ESCC患者，具體信息見參考文獻［3-7］。利用DGIdb數(shù)據(jù)庫（http：//dgidb.genome.wustl.edu）對 469例 ESCC患者基于SNV及InDels的基因組測序數(shù)據(jù)進行藥物靶基因分析。

1.3 信號通路富集數(shù)據(jù)分析

采 用 Database for Annotation，Visualization，and Integrated Discovery（DAVID）v.6.7軟件在KGEE數(shù)據(jù)庫中對所有藥物靶基因進行信號通路富集分析。

1.4 細胞培養(yǎng)

ESCC細胞株 KYSE30、KYSE180、KYSE150、TE1、KYSE510和 Eca-109均用含10%胎牛血清的RMPI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，根據(jù)細胞狀態(tài)更換培養(yǎng)液，細胞長至80%～90%融合度時傳代。本課題組前期以Eca-109細胞系進行裸鼠移植瘤實驗，證實裸鼠皮下成瘤能力較強，因此選取該細胞株用于后續(xù)的裸鼠體外移植瘤實驗。

1.5 MTT法檢測細胞增殖情況

KYSE30、KYSE180、KYSE150、TE1、KYSE510 細胞以3 000/孔接種于96孔板，每孔培養(yǎng)液的最終體積為200 μL。培養(yǎng)24 h后，棄原培養(yǎng)液，以DMSO作用為對照組。分別加入含有100 nmol/L硼替佐米的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，48 h、72 h后每孔加入20 μL的MTT；4 h后吸去培養(yǎng)液，每孔加入200 μL DMSO，搖床孵育15 min，然后采用酶標儀檢測每孔的OD值。

1.6 裸鼠體外移植瘤實驗

取對數(shù)生長期Eca-109細胞，計數(shù)，注射細胞至裸鼠背部皮下，形成皮丘，密切觀察。12 d后待腫瘤直徑達5 mm后，將裸鼠隨機分2組，每組10只。硼替佐米組腹腔注射硼替佐米1.5 mg/kg，對照組僅注射 200 μL生理鹽水，3～4 d注射1次，共6次。繼續(xù)培養(yǎng)18 d，每2～3 d記錄存活小鼠數(shù)量，測量裸鼠體重及移植瘤的長徑（L）和短徑（W），計算腫瘤體積（V），公式V＝πLW2/6。皮下細胞注射30 d（腹腔注射18 d）后以頸椎脫臼方式處死裸鼠，解剖、分離、測量腫瘤體積并稱重。

1.7 免疫組織化學法檢測Ki-67蛋白的表達

所有裸鼠腫瘤組織經(jīng)10%中性福爾馬林固定，脫水，石蠟包埋，連續(xù)切片后，脫蠟、烘片，抗原修復(fù)，封閉，孵育一抗Ki-67，4℃過夜；PBST洗脫3次，室溫孵育二抗1 h，PBST洗脫4次，DAB顯色，蘇木素復(fù)染細胞核，梯度酒精和二甲苯脫水，中性樹脂封片，顯微鏡下觀察結(jié)果，并用Aperio數(shù)字病理掃描系統(tǒng)掃描切片，圖像分析軟件（Aperio Image Scope）分析Ki-67蛋白的表達情況。顯微鏡下以細胞核染成黃色或棕色為陽性細胞，在腫瘤細胞增殖活躍區(qū)連續(xù)計數(shù)10個以上高倍鏡視野約1 000個細胞，計算陽性細胞百分率，即Ki-67增殖指數(shù)。

1.8 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學分析。多組計量資料的比較采用單因素方差分析，若組間差異有統(tǒng)計學意義，則作進一步的兩兩比較，方差齊時采用LSD-t法，方差不齊時采用Dunnett T3法；計量資料的兩組比較采用獨立樣本t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 基于ESCC基因組測序數(shù)據(jù)的藥物靶基因分析

469例ESCC的基因組測序數(shù)據(jù)在DGIdb數(shù)據(jù)庫中共鑒定出307個藥物靶基因，突變頻率＞1.5%的藥物靶基因見圖1。在突變頻率＞5.0%的50個基因中，只有5個基因存在藥物-基因互作，均為ESCC相關(guān)顯著突變基因，分別為NOTCH1（突變頻率15.1%）、LRP1B（突變頻率 10.0%）、PIK3CA（突變頻率 9.2%）、CDKN2A（突變頻率 6.4%）、NOTCH3（突變頻率 5.3%）。196個突變基因突變頻率在2.5%～5.0%之間，其中5個基因存在藥物-基因互作，包括PTCH1（突變頻率4.3%）、ERBB4（突變頻率 3.2%）、ABCB1（突變頻率3.0%）、NOTCH2（突變頻率 2.8%）、BRCA（突變頻率2.0%），前3個為ESCC相關(guān)顯著突變基因。

圖1 ESCC中突變頻率＞1.5%的藥物靶基因Fig.1 Druggable genes with mutation frequency greater than 1.5%in ESCC

2.2 藥物靶基因的信號通路富集分析

通過DAVID軟件對所有藥物靶基因進行KEGG信號通路的富集分析，結(jié)果鑒定出以下ESCC相關(guān)信號 通 路 ：RTK-RAS、PI3K/AKT/mTOR、NOTCH、ERBB信號通路，以及細胞周期及蛋白酶體途徑等，見圖2。同時，發(fā)現(xiàn)蛋白酶體基因集在8%的ESCC病例中表現(xiàn)出明顯調(diào)節(jié)異常，且有27種編碼蛋白酶體的基因具有靶向治療藥物，包括PSMA3、PSMC2、PSMD12和PSMD8等。

圖2 ESCC中藥物靶基因相關(guān)的信號通路富集Fig.2 Druggable genes enriched signaling pathways in ESCC

2.3 硼替佐米對ESCC細胞增殖的影響

MTT法檢測結(jié)果顯示，100 nmol/L硼替佐米處理48 h 后，KYSE30、KYSE180、KYSE150、TE1、KYSE510細胞對照組及硼替佐米組OD值分別為（0.611±0.035 vs 0.267 ±0.045）、（1.010 ±0.073 vs 0.532 ±0.049）、（0.714±0.046 vs 0.520±0.049）、（0.571±0.028 vs 0.213±0.011）、（0.878±0.041 vs 0.209±0.023），除 KYSE150 細胞外，其余4株細胞硼替佐米組OD值與相應(yīng)的對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見圖3A；作用72 h 后，KYSE30、KYSE180、KYSE150、TE1、KYSE510細胞的對照組及硼替佐米組OD值分別為（0.924±0.064 vs 0.167±0.036）、（1.319±0.052 vs 0.273±0.010）、（1.035±0.015 vs 0.503±0.022）、（0.839±0.038 vs 0.117±0.013）、（1.173±0.029 vs 0.168±0.015），5 株細胞硼替佐米組OD值亦均低于相應(yīng)對照組（P<0.05），見圖3B。

2.4 硼替佐米對裸鼠移植瘤生長的影響

皮下腫瘤細胞接種第12天注射處形成直徑5 mm的腫瘤，成瘤率為100%。至實驗結(jié)束兩組裸鼠均未見死亡，存活率為100%。皮下注射腫瘤細胞30 d后處死裸鼠，剝離皮下腫瘤，測量腫瘤體積并稱重，結(jié)果顯示，硼替佐米組腫瘤體積低于對照組［（1 065.83±283.94）mm3vs（1 909.18±533.40）mm3，P=0.007）］，腫瘤重量亦低于對照組［（0.98±0.30）g vs（1.60±0.36）g，P=0.009］，見圖 4、圖 5。

2.5 硼替佐米對裸鼠移植瘤組織中Ki-67表達的影響

免疫組織化學法檢測結(jié)果顯示，硼替佐米治療組裸鼠移植瘤組織中Ki-67表達量為43.83±3.22，對照組為86.32±4.51，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義（P=0.001），見圖6。

圖3 硼替佐米對不同ESCC細胞增殖的影響Fig.3 Effect of bortezomib on proliferation of different ESCC cells

圖4 硼替佐米對裸鼠移植瘤體積的影響Fig.4 Effect of bortezomib on the volume of xenografts in nude mices

圖5 硼替佐米對裸鼠移植瘤重量的影響Fig.5 Effect of bortezomib on the weight of xenografts in nude mices

3 討論

癌癥的發(fā)生和發(fā)展常伴隨著異?；虻母淖?，其可導(dǎo)致體細胞不受控制地進行性生長。盡管大多數(shù)基因突變不會給癌細胞提供選擇性生長的有利條件，但如果單個細胞發(fā)生一系列足夠的驅(qū)動基因突變，即可獲得極大的惡性表型。因此，靶向癌癥-驅(qū)動突變基因及其相關(guān)信號通路，對延緩腫瘤進展和轉(zhuǎn)移尤為重要。新一代基因組測序研究提高了對癌癥分子特征的理解。本課題組前期利用全基因組測序技術(shù)鑒定了一批與ESCC相關(guān)的突變基因和信號通路［3］，但潛在藥物靶點與這些基因改變的關(guān)系尚未闡明。本次研究進一步通過DGIdb數(shù)據(jù)庫篩選ESCC相關(guān)的藥物靶基因，在篩選出的307個藥物靶基因中，只有PIK3CA和ERBB4是公認的癌基因，其突變模式以激活突變?yōu)橹?；NOTCH1、CDKN2A、PTCH1 和 BRCA2基因為公認的腫瘤抑制基因，顯示為重復(fù)性的失活突變［3-7］。同時采用DAVID軟件對藥物靶基因進行KEGG信號通路富集分析，發(fā)現(xiàn)ESCC中存在顯著改變的信號通路，包括PI3K/AKT/mTOR、RTK-RAS、ERBB、NOTCH 信號通路及細胞周期、蛋白酶體途徑等。其中蛋白酶體途徑是新發(fā)現(xiàn)的ESCC相關(guān)信號通路。

圖6 硼替佐米對裸鼠移植瘤組織Ki-67表達的影響Fig.6 Effect of bortezomib on the Ki-67 expression of xenografts tissue in nude mices

人體細胞內(nèi)存在兩種主要的蛋白質(zhì)降解途徑，即自噬溶酶體途徑和泛素-蛋白酶體途徑，其中細胞內(nèi)80%～90%的蛋白質(zhì)經(jīng)過泛素-蛋白酶體途徑降解［9］。泛素-蛋白酶體途徑參與DNA修復(fù)、細胞周期調(diào)節(jié)、藥物耐藥性、細胞增殖和凋亡、抗原呈遞等［10-12］，多種轉(zhuǎn)錄因子、細胞周期調(diào)控因子、突變蛋白等亦可發(fā)生多聚泛素化，然后經(jīng)蛋白酶體降解［9］。當一些錯誤折疊的蛋白、突變蛋白或癌蛋白發(fā)生降解異常時，就可能導(dǎo)致疾病包括癌癥發(fā)生［13-14］。YADAV等［15］報道泛素-蛋白酶體途徑異常與腫瘤發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后關(guān)系密切［16］。26S蛋白酶體是泛素-蛋白酶體的組成部分，是ATP依賴的多功能蛋白水解復(fù)合物［11，17］。硼替佐米是一種雙肽基硼酸鹽類似物［18］，屬于緩慢可逆的蛋白酶體抑制劑，通過與26S蛋白酶體的催化位點結(jié)合［10］，可抑制蛋白酶體功能，阻斷蛋白降解，發(fā)揮抑制腫瘤細胞增殖、轉(zhuǎn)移，誘導(dǎo)細胞凋亡作用［19-20］，亦是第一個被應(yīng)用于臨床的蛋白酶體抑制劑。SEKI等［21］研究發(fā)現(xiàn)蛋白酶體抑制劑硼替佐米可抑制人ESCC細胞增殖，并促進細胞凋亡。本研究采用蛋白酶體抑制劑硼替佐米在體外作用KYSE30、KYSE180、KYSE150、TE1和KYSE510等5株ESCC細胞，MTT檢測發(fā)現(xiàn)硼替佐米在體外可明顯抑制ESCC細胞的增殖能力；裸鼠移植瘤實驗結(jié)果亦發(fā)現(xiàn)硼替佐米可以抑制裸鼠腫瘤生長，提示蛋白酶體抑制劑可作為ESCC潛在的治療藥物，為ESCC的靶向治療提供新的思路。

本研究發(fā)現(xiàn)蛋白酶體途徑在ESCC中顯著改變，蛋白酶體抑制劑硼替佐米在體內(nèi)和體外均可抑制ESCC細胞生長，可能作為ESCC潛在的新的靶向治療藥物，但其在ESCC細胞系中的具體作用機制以及確切的臨床治療效果仍需進一步研究。