陳莉 林國(guó)享 陳凱華 孫永楚 萬芳竹 朱小東，

鼻咽癌是我國(guó)高發(fā)的惡性腫瘤之一，放療是主要的治療手段［1-2］。而抗輻射是患者復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及治療失敗的主要原因［3］。因此，探討抗輻射鼻咽癌細(xì)胞遷移和侵襲機(jī)制有重要意義。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是常見的促血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子，可誘導(dǎo)血管形成，增加血管通透性，影響腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞的功能［4］。VEGF還能促進(jìn)癌細(xì)胞DNA過度復(fù)制，誘導(dǎo)放射抗性基因合成，從而產(chǎn)生放射抵抗［5］。研究發(fā)現(xiàn)VEGF在多種惡性腫瘤組織，包括鼻咽癌組織中呈高表達(dá)，可能參與腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，且與不良預(yù)后有關(guān)［6-10］。本研究通過構(gòu)建VEGF沉默表達(dá)的鼻咽癌放射抗拒細(xì)胞株，探討VEGF對(duì)細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響，以期尋找鼻咽癌放射抗拒靶點(diǎn)，為闡明鼻咽癌轉(zhuǎn)移機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

人鼻咽癌放射抗拒細(xì)胞株CNE-2R由廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院實(shí)驗(yàn)研究部構(gòu)建并保存。GV248慢病毒質(zhì)粒骨架（hU6-MCS-Ubiquitin-EGFP-IRES-puromycin）、293T 細(xì)胞、大腸桿菌菌株 DH5α、慢病毒包裝輔助質(zhì)粒pHelper 1.0載體、pHelper 2.0載體和嘌呤霉素均購自上海吉?jiǎng)P基因技術(shù)有限公司；GAPDH引物購自上海生工生物工程技術(shù)有限公司；VEGF引物由日本Takara公司設(shè)計(jì)并合成；鼠抗人VEGF-A抗體購自美國(guó)NOVUS公司；兔抗人GAPDH抗體購自美國(guó)CST公司；山羊抗兔二抗、抗鼠二抗購自上海碧云天技術(shù)有限公司。Lipofectamine 2000購自美國(guó)Invitrogen公司，凝膠成像分析儀購自美國(guó)Bio-Rad公司，熒光定量PCR儀購自德國(guó)Analytik Jena公司。

1.2 重組慢病毒表達(dá)質(zhì)粒及慢病毒構(gòu)建

在GenBank中搜索人VEGF核苷酸序列（編號(hào)：NM_001171626），設(shè)計(jì)3個(gè)干擾VEGF的靶點(diǎn)序列（LV1、LV2和LV3）和1條無關(guān)序列（NC）。根據(jù)各靶序列分別設(shè)計(jì)并合成shRNA的單鏈DNA Oligo（內(nèi)含AgeⅠ和EcoRⅠ酶切位點(diǎn)），構(gòu)建重組慢病毒表達(dá)質(zhì)粒GV248-LV1、GV248-LV2、GV248-LV3 和 GV248-NC，進(jìn)行雙酶切鑒定和測(cè)序驗(yàn)證。293T細(xì)胞置于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h，融合度達(dá)70%～80%時(shí)將上述4種重組慢病毒表達(dá)質(zhì)粒、pHelper 1.0載體質(zhì)粒、pHelper 2.0載體質(zhì)粒與Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑混合培養(yǎng)48 h，離心后獲得重組慢病毒原液VEGF-LV1、VEGF-LV2、VEGF-LV3 和 VEGF-NC，分裝并于-80℃下保存。

1.3 病毒滴度測(cè)定

293T細(xì)胞接種于96孔板（4×103/孔）培養(yǎng)24 h后，分別將 10 μL、1 μL 和 0.1 μL的慢病毒原液 VEGF-LV1、VEGF-LV2、VEGF-LV3和VEGF-NC與完全培養(yǎng)基混合成100 μL轉(zhuǎn)染液。選取所需的293T細(xì)胞孔，加入病毒轉(zhuǎn)染液培養(yǎng)4 d，用倒置熒光顯微鏡觀察熒光表達(dá)情況，計(jì)算重組慢病毒滴度，以及當(dāng)MOI=20時(shí)所需的轉(zhuǎn)染病毒體積，進(jìn)行下一步慢病毒轉(zhuǎn)染。重組慢病毒滴度=熒光細(xì)胞數(shù)/病毒原液量。MOI=病毒滴度×病毒體積/細(xì)胞數(shù)目。

1.4 構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染VEGF的CNE-2R細(xì)胞系

CNE-2R細(xì)胞接種于含10%胎牛血清+100 U/mL青霉素+100 U/mL鏈霉素的RPMI-1640完全培養(yǎng)基，用胰酶消化并傳代培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CNE-2R細(xì)胞接種于24孔板（2.5×104/孔）；培養(yǎng) 24 h后，分別轉(zhuǎn)染 1.250 μL VEGF-LV1、1.111 μL VEGF-LV2、1.429 μL VEGF-LV3和1.111 μL VEGF-NC；用嘌呤霉素篩選轉(zhuǎn)染后細(xì)胞，獲得穩(wěn)定傳代的轉(zhuǎn)染細(xì)胞系，分別記為CNE-LV1組、CNE-LV2組、CNE-LV3組和CNE-NC組，同時(shí)設(shè)CNE-2R細(xì)胞為空白對(duì)照組。在倒置熒光顯微鏡（×200）下觀察各組細(xì)胞熒光表達(dá)情況并計(jì)算轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染效率=（熒光細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)）×100%。

1.5 RT-qPCR檢測(cè)VEGF mRNA的表達(dá)

收集以上各組細(xì)胞，按照Trizol試劑說明書提取細(xì)胞總RNA，采用Primer ScriptTMRT試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。以GAPDH為內(nèi)參，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。引物序列：VEGF-F為5'-TCACAGGTACAGGGATGAGGACAC-3'，VEGF-R 為 5'-CAAAGCACAGCAATGTCCTGAAG-3'；GAPDH-F 為 5'-CAGGAGGCATTGCTGATGAT-3'，GAPDH-R 為 5'-GAAGGCTGGGGCTCATTT-3'。PCR 反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃ 30 s，1個(gè)循環(huán)；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40 個(gè)循環(huán)。采用 2-△△Ct法計(jì)算VEGF mRNA的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 Western blot檢測(cè)VEGF蛋白的表達(dá)

采用RIPA蛋白裂解液提取各組細(xì)胞總蛋白，根據(jù)BCA法進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)，取各組蛋白質(zhì)20 μg，加入適量上樣緩沖液，混勻，凝膠電泳，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h。加入稀釋的一抗［VEGF（1∶1 000）和 GAPDH（1∶1 000）］，4 ℃下?lián)u床孵育過夜，洗膜后加入稀釋的二抗（1∶1 000），室溫孵育1 h后洗膜。采用ECL化學(xué)發(fā)光法曝光，凝膠成像系統(tǒng)拍照分析并檢測(cè)各條帶灰度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力

收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化重懸后，按4×105/孔接種于6孔板中。待細(xì)胞融合度約為80%時(shí)，用200μL移液器槍頭在孔板上作劃痕標(biāo)記，用完全培養(yǎng)基連續(xù)培養(yǎng)48 h。顯微鏡觀察0 h、48 h細(xì)胞劃痕愈合情況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲能力

用不含血清的培養(yǎng)基將各組細(xì)胞重懸成3×105/mL的細(xì)胞懸液，并分別接種于含Matrigel基質(zhì)膠和不含Matrigel基質(zhì)膠的24孔板Transwell小室上室中，200μL/孔。下室中加入600μL完全培養(yǎng)基，并于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)48 h。用棉簽擦去上室中的細(xì)胞，PBS清洗，4%多聚甲醛固定40 min，姬姆薩染液染色45 min，再用 PBS清洗，晾干，在倒置顯微鏡（×200）下觀察并拍照，計(jì)數(shù)5個(gè)視野的細(xì)胞數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，若組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，進(jìn)一步的兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 重組慢病毒表達(dá)質(zhì)粒雙酶切鑒定和測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果

重組慢病毒表達(dá)質(zhì)粒雙酶切鑒定結(jié)果顯示，環(huán)狀質(zhì)粒被切斷后呈線性條帶改變，說明雙酶切位點(diǎn)正確，見圖1。經(jīng)測(cè)序進(jìn)一步鑒定，GV248-LV1組、GV248-LV2組和GV248-LV3組相應(yīng)的干擾shRNA序列成功連接到載體中，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，見圖2。

圖1 GV248-VEGF質(zhì)粒的酶切電泳圖Fig.1 Enzymatic digestion electrophoresis of GV248-VEGF plasmid

圖2 GV248-VEGF插入序列的測(cè)序峰Fig.2 Sequencing peak of insertion sequence of GV248-VEGF

2.2 重組慢病毒的滴度

倒置熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染慢病毒的4組細(xì)胞熒光強(qiáng)度隨著病毒原液體積的增加而增強(qiáng)，見圖3。當(dāng)病毒原液量為 0.1 μL時(shí)，VEGF-LV1組、VEGF-LV2組、VEGF-LV3組和VEGF-NC組的熒光細(xì)胞數(shù)分別為 8×104個(gè)、9×104個(gè)、7×104個(gè)和 9×104個(gè)；慢病毒的滴度分別為 8×108TU/mL、9×108TU/mL、7×108TU/mL、9×108TU/mL；當(dāng) MOI=20 時(shí)，慢病毒轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)所需病毒原液體積分別為1.250 μL、1.111 μL、1.429 μL、1.111 μL。

圖3 不同體積重組慢病毒對(duì)293T細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效果（×200）Fig.3 Transfection effect of different volumes of recombinant lentivirus on 293T cells（×200）

2.3 構(gòu)建穩(wěn)定沉默VEGF的CNE-2R細(xì)胞

倒置熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示，4種慢病毒分別轉(zhuǎn)染CNE-2R細(xì)胞后均帶有綠色熒光，轉(zhuǎn)染效率＞90%（圖4），說明轉(zhuǎn)染成功。RT-qPCR檢測(cè)（圖 5A）和 Western blot檢測(cè)（圖5B）結(jié)果顯示，空白對(duì)照組、CNE-NC組、CNE-LV1組、CNE-LV2組和CNE-LV3組的VEGF mRNA和蛋白表達(dá)量差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=4.129，P＜0.001；F=571.194，P=0.031），其中 CNE-LV3組VEGF的mRNA和蛋白表達(dá)量均低于其余4組（P＜0.05）。以上結(jié)果表明，CNE-LV3組細(xì)胞沉默VEGF效果最佳，以其進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.4 沉默VEGF對(duì)CNE-2R細(xì)胞遷移能力的影響

劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，空白對(duì)照組、CNE-NC組、CNE-LV3組的細(xì)胞遷移率分別為（50.17±1.76）%、（50.63±1.52）%、（37.97±1.56）%，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=59.292，P＜0.001）；與空白對(duì)照組和 CNE-NC組相比，CNE-LV3組細(xì)胞遷移率均下降（t=8.989，P＝0.001；t=10.070，P=0.001），但空白對(duì)照組與 CNE-NC組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.348，P＝0.746），見圖 6A。

Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，空白對(duì)照組、CNE-NC組、CNE-LV3組的穿膜細(xì)胞數(shù)分別為（95.3±3.8）個(gè)、（94.3±4.0）個(gè)、（41.3±1.5）個(gè)，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=261.347，P＜0.001）；與空白對(duì)照組和CNE-NC組相比，CNE-LV3組穿膜細(xì)胞數(shù)明顯減少（t=22.910，P＜0.001；t=21.305，P＜0.001）；而空白對(duì)照組與CNE-NC組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.419，P＝0.697），見圖 6B。

圖4 重組慢病毒轉(zhuǎn)染CNE-2R細(xì)胞的效果（×200）Fig.4 Transfection effect of recombinant lentivirus on CNE-2R cells（×200）

圖5 轉(zhuǎn)染后CNE-2R細(xì)胞VEGF mRNA及蛋白的表達(dá)情況Fig.5 Expression of VEGF mRNA and protein in CNE-2R cells after transfection

圖6 沉默VEGF對(duì)CNE-2R細(xì)胞遷移能力的影響Fig.6 Effect of silencing the expression of VEGF on the migration ability of CNE-2R cells

2.5 沉默VEGF對(duì)CNE-2R細(xì)胞侵襲能力的影響

Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，空白對(duì)照組、CNE-NC組、CNE-LV3組的細(xì)胞穿膜數(shù)分別為（105.3±1.5）個(gè)、（93.3±2.5）個(gè)、（46.3±2.1）個(gè)，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=774.886，P<0.001）。CNE-LV3組細(xì)胞穿膜數(shù)分別與空白對(duì)照組和CNE-NC組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=38.711，P＜0.001；t=30.237，P＜0.001）；而空白對(duì)照組與CNE-NC組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.877，P＝0.134）。見圖 7。

圖7 沉默VEGF對(duì)CNE-2R細(xì)胞侵襲能力的影響（×200）Fig.7 Effect of silencing the expression of VEGF on the invasion ability of CNE-2R cells（×200）

3 討論

正常的血管形成受血管生成因子和抗血管生成因子共同調(diào)控，當(dāng)促血管生成因子過度活躍時(shí)，可導(dǎo)致血管持續(xù)性生長(zhǎng)，使腫瘤血管異常形成［11］。VEGF廣泛存在于人體各器官，其表達(dá)受多種因素調(diào)控。在腫瘤發(fā)生發(fā)展中，腫瘤細(xì)胞能分泌較高水平的VEGF，從而引發(fā)腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂，促進(jìn)血管形成；同時(shí)VEGF還可促進(jìn)單核細(xì)胞、成纖維細(xì)胞浸潤(rùn)，從而形成腫瘤基質(zhì)并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞進(jìn)入新生血管內(nèi)，進(jìn)而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力［12］。研究發(fā)現(xiàn)，VEGF對(duì)鼻咽癌預(yù)后產(chǎn)生不良影響［13-15］。

本課題組前期研究證實(shí)構(gòu)建的鼻咽癌放射抗拒細(xì)胞株CNE-2R較CNE-2細(xì)胞具有更高的侵襲遷移能力［16］。RNA干擾技術(shù)可特異性沉默特定基因的表達(dá)，且具有級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)和可遺傳性，目前已廣泛應(yīng)用于探索基因功能、惡性腫瘤治療等。沉默基因表達(dá)的RNA干擾載體包括慢病毒、腺病毒、質(zhì)粒和siRNA化學(xué)合成等，其中慢病毒載體可轉(zhuǎn)染多種類型細(xì)胞，具有轉(zhuǎn)染效率高、可插入的基因片段多、表達(dá)穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)［17］。本研究制備3種靶向干擾VEGF基因的慢病毒載體，轉(zhuǎn)染人鼻咽癌放射抗拒細(xì)胞株CNE-2R。鑒于本課題組前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)MOI=20時(shí)慢病毒轉(zhuǎn)染效果最佳［18］，因此選取MOI=20時(shí)轉(zhuǎn)染所需的病毒體積轉(zhuǎn)染CNE-2R細(xì)胞，結(jié)果均成功構(gòu)建了沉默VEGF的CNE-2R細(xì)胞，其中CNE-LV3組VEGF沉默效果最佳，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。VEGF沉默CNE-LV3細(xì)胞的成功構(gòu)建，為進(jìn)一步探討VEGF對(duì)鼻咽癌轉(zhuǎn)移的影響奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

HE等［19］研究發(fā)現(xiàn)，沉默NETO2可降低鼻咽癌CNE-1、HONE-1細(xì)胞的侵襲和遷移能力。也有研究表明上調(diào)VEGF表達(dá)可促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞、卵巢癌細(xì)胞和肝癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力［20-22］，而抑制VEGF表達(dá)則可減弱黑色素瘤細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力［23-25］。本研究劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CNE-LV3組細(xì)胞較空白對(duì)照組和CNE-NC組細(xì)胞覆蓋劃痕區(qū)域的速度慢，細(xì)胞遷移率顯著降低；細(xì)胞遷移和侵襲的穿膜細(xì)胞數(shù)亦明顯減少，表明沉默VEGF能抑制鼻咽癌CNE-2R細(xì)胞的遷移和侵襲能力。VEGF可能是抑制放射抗拒性鼻咽癌轉(zhuǎn)移的有效靶點(diǎn)。但目前VEGF導(dǎo)致鼻咽癌轉(zhuǎn)移的具體作用機(jī)制尚未明確，后期將在分子和動(dòng)物水平進(jìn)一步探索VEGF對(duì)鼻咽癌侵襲遷移能力的影響。

本研究成功構(gòu)建了沉默VEGF表達(dá)的鼻咽癌放射抗拒CNE-2R細(xì)胞株，且沉默VEGF能有效抑制細(xì)胞遷移和侵襲能力，VEGF可能是抑制放射抗拒性鼻咽癌轉(zhuǎn)移的有效靶點(diǎn)，以VEGF為靶點(diǎn)的治療方法有望為鼻咽癌治療提供新的思路。