梁 汭，楊曉童，黃厚今，周亞杏，麻小娟

(遵義醫(yī)科大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)教研室，貴州 遵義 563099)

雞蛋是餐桌上最常見(jiàn)的食物，因?yàn)槠湄S富的營(yíng)養(yǎng)和良好的功能特性而大量應(yīng)用于食品工業(yè)。然而，雞蛋也是引起過(guò)敏反應(yīng)的“八大”食物之一[1-2]。盡管在任何年齡段都有雞蛋過(guò)敏的報(bào)道，但兒童雞蛋過(guò)敏的發(fā)生率高于成人[3-4]。雞蛋過(guò)敏主要由蛋清中存在的四種主要過(guò)敏原引起，包括卵白蛋白(54%)、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白(12%)、卵類(lèi)粘蛋白(11%)和溶菌酶(3.4%)[5]。其中卵類(lèi)粘蛋白被認(rèn)為是致敏性最強(qiáng)的過(guò)敏原，降低它的致敏性是低致敏雞蛋產(chǎn)品研發(fā)的一大難點(diǎn)。自1947年以來(lái)，卵類(lèi)粘蛋白通過(guò)用溶劑如乙醇、三氯乙酸、三氯乙酸和丙酮以及三氯乙酸和乙醇沉淀而得到純化[6-7]。然而，在這些純化方法中使用的有機(jī)溶劑可能對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響[8]，影響變應(yīng)原活性；也有用離子交換色譜從蛋清中純化卵類(lèi)粘蛋白的報(bào)道，不使用有機(jī)溶劑[9]，但是這種方法非常復(fù)雜，首先要經(jīng)過(guò) Q-Sepharose Fast Flow柱，然后是目標(biāo)峰的收集、透析、凍干，最后是基于CM-Toyopearl 650M陽(yáng)離子交換柱純化的一種方法。也有研究表明卵類(lèi)粘蛋白也可通過(guò)雙水相系統(tǒng)進(jìn)行純化[10]，但是其中涉及聚乙二醇1500和各種無(wú)機(jī)鹽。然而，這些方法均致力于該蛋白質(zhì)的獲得，沒(méi)有一種方法可以在加工后保留該蛋白的免疫活性。由于雞蛋主要過(guò)敏蛋白等電點(diǎn)的不同(卵清蛋白，4.5；卵轉(zhuǎn)鐵蛋白，6.5；卵類(lèi)粘蛋白，4.1；溶菌酶，10.7)，所以通過(guò)離子交換色譜分離卵類(lèi)粘蛋白似乎是可行的。在前期實(shí)驗(yàn)中我們使用陰離子交換柱純化了其他三種主要過(guò)敏原：卵清蛋白、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白和溶菌酶，但是未能使用這種方法分離純化出卵類(lèi)粘蛋白[11]。在這方面，陽(yáng)離子交換柱可能適用于卵類(lèi)粘蛋白的分離純化。所以，本研究旨在通過(guò)陽(yáng)離子交換柱從全蛋清中分離得到卵類(lèi)粘蛋白純品，并進(jìn)一步考察其得率、純度和免疫原性，為其應(yīng)用于過(guò)敏原實(shí)驗(yàn)室研究提供基礎(chǔ)條件。

1 材料與方法

1.1 材料 新鮮雞蛋(當(dāng)?shù)仞B(yǎng)殖場(chǎng))，CM-Sepharose fast flow (FF)(GE Healthcare Bio-Sciences AB,Uppsala,Sweden)，完全弗氏佐劑、不完全弗氏佐劑和卵類(lèi)粘蛋白標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA)。

1.2 制備蛋清上樣液 根據(jù)佟平等[12]的研究，首先從雞蛋清中除去干擾蛋白如卵粘蛋白和球蛋白。操作方法為將新鮮分離的蛋清與等體積的蒸餾水混合，向混合物中加入2MHCl調(diào)pH至6.0，在4℃下溫和攪拌3 h后，在3,000g離心10 min(4℃)。后收集上清液，并用2M HCl調(diào)節(jié)pH至3.8。再次離心后，收集上清液分裝并保存在-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 通過(guò)CM-Sepharose FF純化卵類(lèi)粘蛋白 將蛋清上樣溶液(5 mL)上樣到預(yù)先用醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH4.7)平衡的CM-Sepharose FF柱(1.6 cm×20 cm)上。使用相同的緩沖液以1.5 mL / min的洗脫速率進(jìn)行洗脫。收集目標(biāo)峰，用PEG 20,000濃縮，透析，冷凍干燥并儲(chǔ)存在-20℃直至下一步分析。

1.4 SDS-PAGE電泳測(cè)定純度 收集目標(biāo)分離峰并將濃縮的樣品(8 mg / mL)與上樣緩沖液(Beyotime，Shanghai，China)以3∶1(v / v)混合，在95℃下加熱10 min。然后在12% SDS凝膠中每孔上樣15μL樣品，并在100V(Bio-Rad)下進(jìn)行電泳分離。凝膠用考馬斯亮藍(lán)染色液染色，脫色后，通過(guò)凝膠成像儀拍照。

1.5 得率分析 通過(guò)比較冷凍干燥后分離的蛋白質(zhì)的重量與其在全蛋清中的比例來(lái)計(jì)算卵類(lèi)粘蛋白的得率，蛋清中的蛋白質(zhì)含量通過(guò)凱氏定氮法測(cè)定。

1.6 免疫活性分析 將分離純化的卵類(lèi)粘蛋白的免疫活性與該蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行比較。在本課題組前期建立的多克隆抗體制備方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行適當(dāng)修改[13]：每次免疫接種使用弗氏佐劑混合1 mg卵類(lèi)粘蛋白(分別混合純化產(chǎn)物和標(biāo)準(zhǔn)品)免疫兩只8周齡新西蘭大白兔(許可號(hào)SCXK(渝)2017-0010)，免疫周期為每周1次，共免疫八次并且從第3次免疫開(kāi)始通過(guò)ELISA法測(cè)定血清效價(jià)。

2 結(jié)果

2.1 陽(yáng)離子交換層析法純化蛋清中的卵類(lèi)粘蛋白 預(yù)先用醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH4.7)平衡層析介質(zhì),在蛋清上樣后用相同的緩沖液洗脫。當(dāng)層析柱的pH從3.8增加到4.7后，分別在上樣60、230和260 min洗出三個(gè)分離峰，洗脫曲線如圖1所示。三個(gè)分離峰的SDS-PAGE分析表明，卵類(lèi)粘蛋白在第一個(gè)峰(F1)中洗脫；卵白蛋白混合在另外兩個(gè)峰(F2和F3)中(見(jiàn)圖2a)。將90μg純化的卵類(lèi)粘蛋白上樣到凝膠上，沒(méi)有顯示雜質(zhì)(見(jiàn)圖2b)，并且純度分析顯示層析純化的卵類(lèi)粘蛋白的純度達(dá)到94.1%。F2主要以卵白蛋白為主，純度為79.1%。

圖1 CM-Sepharose FF 分離蛋清組份(F)陽(yáng)離子層析曲線

圖2 通過(guò)離子交換層析獲得的分離峰(a)和較高濃度(90 μg)的純化卵類(lèi)粘蛋白的SDS-PAGE(b)

2.2 卵類(lèi)粘蛋白的得率 通過(guò)比較凍干后分離的蛋白質(zhì)的重量與其在全蛋清中的比例來(lái)計(jì)算卵類(lèi)粘蛋白的得率。通過(guò)凱氏定氮法計(jì)算出全蛋清中11.4%為蛋白質(zhì)。經(jīng)過(guò)一個(gè)完整的分離純化過(guò)程，收集到14.3 mg卵類(lèi)粘蛋白，總得率為45.8%。表1為該方法與已報(bào)道方法的比較。

表1 與報(bào)道方法相比本方案純化卵類(lèi)粘蛋白的得率與純度

ND：Not Detected。

2.3 純化的卵類(lèi)粘蛋白的免疫活性 以卵類(lèi)粘蛋白標(biāo)準(zhǔn)品為參照，通過(guò)兔血清效價(jià)和IgG結(jié)合能力來(lái)評(píng)估純化卵類(lèi)粘蛋白的免疫活性。通過(guò)圖3可見(jiàn)在第六次免疫時(shí)血清效價(jià)達(dá)到最高。

通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)抑制ELISA評(píng)估IgG結(jié)合能力，結(jié)果見(jiàn)圖4。通過(guò)比較兩樣品的IC50值，可見(jiàn)陽(yáng)離子交換層析法純化的卵類(lèi)粘蛋白和商業(yè)標(biāo)準(zhǔn)過(guò)敏原具有相似的免疫活性。

圖3 免疫過(guò)程中血清效價(jià)的變化

A：純化卵類(lèi)粘蛋白包被的酶標(biāo)板以及純化卵類(lèi)粘蛋白免疫的兔血清用作一抗；B：卵類(lèi)粘蛋白標(biāo)準(zhǔn)品包被的酶標(biāo)板以及卵類(lèi)粘蛋白標(biāo)準(zhǔn)品免疫的兔血清用作一抗。圖4 層析純化的卵類(lèi)粘蛋白IC 50值與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)比

3 討論

雞蛋清經(jīng)過(guò)預(yù)處理后，最終將蛋清上樣溶液pH調(diào)節(jié)至3.8，選擇該pH值是基于CM-Sepharose FF的使用說(shuō)明和卵類(lèi)粘蛋白的等電點(diǎn)。在此pH值下，所有蛋清蛋白都帶負(fù)電，并在上樣時(shí)與陽(yáng)離子交換柱的固相結(jié)合。F1分離峰純化的卵類(lèi)粘蛋白在SDS-PAGE凝膠上顯示出彌散條帶，該結(jié)果與已有報(bào)道相同[15]，這可能與卵類(lèi)粘蛋白的高糖基化率有關(guān)。然而，卵白蛋白的純化延長(zhǎng)了該過(guò)程的持續(xù)時(shí)間，建議單純卵類(lèi)粘蛋白的純化在120 min停止純化過(guò)程。通過(guò)以上結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，CM-Sepharose FF純化卵類(lèi)粘蛋白可以在2 h內(nèi)獲得目的蛋白純品。

通過(guò)表1的結(jié)果可見(jiàn)本實(shí)驗(yàn)使用的陽(yáng)離子交換層析法比Tankrathok等[9]建立的兩個(gè)層析柱聯(lián)用的方法分離卵類(lèi)粘蛋白具有更高的純度和得率。雖然該方法不如有機(jī)溶劑沉淀法[6]所獲得卵類(lèi)粘蛋白的得率高，但在整個(gè)純化過(guò)程中沒(méi)有使用有機(jī)溶劑，可對(duì)該過(guò)敏原的活性會(huì)有更好的保護(hù)作用。

在此次實(shí)驗(yàn)中盡管由于新西蘭兔數(shù)量少(只有2只)而無(wú)法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，但是純化的或商業(yè)的卵類(lèi)粘蛋白誘導(dǎo)的血清效價(jià)沒(méi)有任何實(shí)質(zhì)性差異，而且，本實(shí)驗(yàn)主要目標(biāo)為獲得多克隆抗體來(lái)研究過(guò)敏原卵類(lèi)粘蛋白IgG結(jié)合能力的變化，因此，在本實(shí)驗(yàn)中兩只兔子被認(rèn)為是足夠的。

卵類(lèi)粘蛋白是雞蛋清中的主要過(guò)敏原，由于其熱穩(wěn)定性和消化穩(wěn)定性，卵類(lèi)粘蛋白是生產(chǎn)低過(guò)敏雞蛋產(chǎn)品的主要障礙。降低該過(guò)敏原致敏性的研究通常需要純化的卵類(lèi)粘蛋白。目前獲得純化卵類(lèi)粘蛋白的方法主要是有機(jī)溶劑沉淀法，但是過(guò)敏原在此過(guò)程中可能會(huì)發(fā)生變性。而迄今為止，尚未見(jiàn)報(bào)道卵類(lèi)粘蛋白在純化過(guò)程檢測(cè)其活性(尤其是免疫活性)。Abeyrathne等[7]試圖檢測(cè)其免疫活性，但由于沒(méi)有商業(yè)卵類(lèi)粘蛋白抗體而未能開(kāi)展。在本研究中，不僅制備了抗卵類(lèi)粘蛋白兔血清，且通過(guò)本實(shí)驗(yàn)所建立的陽(yáng)離子交換層析法純化的卵類(lèi)粘蛋白顯示出與該過(guò)敏原商業(yè)標(biāo)準(zhǔn)相似的免疫活性。因此，本實(shí)驗(yàn)利用CM-Sepharose FF陽(yáng)離子交換層析技術(shù)，建立了制備高純度、高免疫活性卵類(lèi)粘蛋白的方法，該方法簡(jiǎn)便易行，成本低廉，值得推廣。