林慧嫻 鄭磊

1南方醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)與生物技術(shù)學(xué)院（廣州510000）；2南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院檢驗(yàn)科（廣州510000）

近年來興起的液體活檢技術(shù)克服了傳統(tǒng)組織活檢的侵入性、取樣困難以及難以監(jiān)測等局限性，使腫瘤的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測成為可能。液體活檢技術(shù)主要針對循環(huán)腫瘤核酸（circulating tumor DNA，ctDNA）、細(xì)胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）及循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cells，CTCs）等標(biāo)志物的檢測分析，具有非侵入性、重復(fù)性強(qiáng)等優(yōu)勢，在腫瘤早期診斷、治療決策、療效評(píng)估和耐藥監(jiān)測中具有巨大的發(fā)展?jié)摿εc臨床應(yīng)用前景。此外，液體活檢還可反映腫瘤的基因譜，對腫瘤診治的精準(zhǔn)化進(jìn)程具有推進(jìn)性意義，因此本文將對上述液體活檢的三大檢測標(biāo)志物的生物學(xué)特性、主要檢測方法以及臨床應(yīng)用進(jìn)行簡要綜述，為證明其臨床有效性和實(shí)用性提供思路，對指導(dǎo)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究和液體活檢的臨床實(shí)踐有重要意義。

1 循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）

腫瘤患者外周血游離DNA（cell free DNA，cfDNA）濃度比健康人群高10～100 倍，其中ctDNA 可來源于凋亡或者壞死的腫瘤細(xì)胞、CTCs和外泌體。ctDNA 長度約為150～200 bp，其存在形式包括單鏈DNA、雙鏈DNA 及DNA-蛋白復(fù)合體，半衰期為15 min～2 h。雖然ctDNA 僅占全部cfDNA的0.01%～1%，但ctDNA的遺傳信息和腫瘤組織有良好一致性，可以動(dòng)態(tài)反映腫瘤基因譜特征。

ctDNA的檢測包括濃度變化和結(jié)構(gòu)改變兩個(gè)方面。因ctDNA 占cfDNA 總量的比例較低，且ctDNA 與體細(xì)胞凋亡釋放的核酸相比可能僅有一個(gè)或數(shù)個(gè)堿基的微小差別，故對其檢測技術(shù)靈敏度要求極高。以選擇性擴(kuò)增為核心的技術(shù)包括熒光定量PCR、液滴式數(shù)字PCR［1］、cold-PCR［2］、ARMS-PCR［3］、高分辨溶解曲線分析技術(shù)［4］等，這類方法靈敏度較高，但易發(fā)生偏向性擴(kuò)增，且只可檢測已知突變。以測序技術(shù)為核心的Sanger 測序（一代）、增強(qiáng)化TAM-測序［5］和CAPP-測序［6］（二代）、納米孔單分子測序［7］（三代）等方法具有高通量和高效率的優(yōu)點(diǎn)，但成本相對較高。此外，PCR-流式聯(lián)合技術(shù)［8］、新興的微球依賴性懸浮點(diǎn)陣法［9］等在提高檢測準(zhǔn)確性和降低成本方面都有一定的提升。其中微球依賴性懸浮點(diǎn)陣法基于液相芯片技術(shù)，靈敏度提高至可檢測低至2 μL的樣本。

2 細(xì)胞外囊泡（EVs）

EVs 是細(xì)胞在生理或病理狀態(tài)下旁分泌的一種膜性囊泡，包括凋亡小體（＞1000 nm）、微囊泡（100～1000 nm）和外泌體（30～100 nm）。EVs 存在于淋巴液、血液、唾液、尿液、腦脊液等體液中，半衰期較ctDNA 與CTCs 長。EVs可將其攜帶的脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、核酸、細(xì)胞因子等物質(zhì)運(yùn)輸至特定部位，在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、增殖與分化、炎癥反應(yīng)、腫瘤轉(zhuǎn)移與耐藥等方面，發(fā)揮重要的作用。

EVs的檢測主要包括分離鑒定與內(nèi)容物分析。分離技術(shù)包括差速離心法、密度梯度離心法、尺寸排阻法、微流控法和磁珠分選法等。離心法的優(yōu)點(diǎn)是對EVs的活性損傷較小，但所需樣本量較大且分離純度較差。尺寸排阻法和微流控技術(shù)的分離效率較高，但也存在特異性不足的問題。免疫磁珠分選法具有較好的特異性，但抗原表位的激活可能不利于后續(xù)的功能分析。EVs的鑒定包括以電子顯微鏡法、納米顆粒跟蹤法、動(dòng)態(tài)光散射法為主的物理學(xué)鑒定和以蛋白印記法、酶聯(lián)免疫法為主的免疫學(xué)鑒定。物理學(xué)方法通過形態(tài)和粒徑特征對EVs 進(jìn)行表征，免疫學(xué)方法則通過檢測特異的表面蛋白標(biāo)志物對EVs 進(jìn)行鑒定和亞群分析。EVs 內(nèi)容物包括蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)和代謝物，其分析技術(shù)主要有質(zhì)譜法、流式細(xì)胞法、液滴式數(shù)字PCR法［10］、核磁共振法、表面等離子共振法［11］等。此外，近年來發(fā)展迅速的生物傳感和電化學(xué)傳感技術(shù)，如電化學(xué)“三明治”免疫夾心法［12］、將磁選與電化學(xué)檢測相結(jié)合的手持式iMEX 分析裝置［13］以及基于金屬納米顆粒直接電氧化法的多通道金芯片［14］等，均可應(yīng)用于EVs 檢測分析領(lǐng)域。其中多通道金芯片利用特異性適配體修飾不同的金屬納米顆粒，特異性捕獲表達(dá)多種標(biāo)志物的目的外泌體與微囊泡。適配體、納米材料以及電化學(xué)傳感器的聯(lián)合運(yùn)用大大提高了該技術(shù)的靈敏度以及檢測效率。

3 循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTCs）

CTCs 是自發(fā)或者因診療操作而脫離腫瘤原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶進(jìn)入外周血的腫瘤細(xì)胞，半衰期為1～2.4 h。絕大多數(shù)CTCs 在短期內(nèi)被免疫系統(tǒng)殺滅，極少數(shù)CTCs 可通過誘導(dǎo)血小板聚集成“物理屏障”逃避免疫殺傷，同時(shí)激活血小板釋放血管內(nèi)皮生長因子、TGF-β［15］等調(diào)節(jié)因子，進(jìn)而增強(qiáng)其遷移侵襲力并促進(jìn)新血管形成［16］。雖然CTCs 數(shù)量稀少（1～10個(gè)CTC/mL），但與腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)密切相關(guān)，是腫瘤預(yù)后和監(jiān)測的潛在標(biāo)志物。

CTCs 檢測包括分離富集和鑒定分析兩個(gè)方面。CTCs分離富集技術(shù)包括以過濾法、密度梯度離心法、微流控法為代表的物理學(xué)方法和以CellSearch 法［17］、Anda Test 法［18］、MagSweeper 法［19］為代表的免疫分選方法。物理方法主要依賴細(xì)胞大小、密度、電泳特征的差異，具有靈敏性高、漏檢率低的優(yōu)點(diǎn)，但是分離純度較低，且可能漏檢體積較小的CTCs。免疫方法具有較好的分離純度和特異性，但是受到表面標(biāo)志物表達(dá)異質(zhì)性的影響，可能導(dǎo)致某些CTCs亞群的漏檢。CTC-iChip［20］技術(shù)將兩種原理有機(jī)結(jié)合，先根據(jù)細(xì)胞大小進(jìn)行分離，然后利用特異性抗體（CKs 或CD45）進(jìn)行二次富集，提高了檢測的捕獲率與準(zhǔn)確性。此外，納米材料和適配體體系［21］、聲學(xué)原理［22］等也開始應(yīng)用于CTCs 檢測領(lǐng)域，端粒酶活性［23］、體內(nèi)捕獲策略［24］等逐漸成為新型檢測平臺(tái)研發(fā)的切入點(diǎn)，有望使CTCs 富集準(zhǔn)確性得到質(zhì)的飛躍。CTCs 鑒定及下游分析技術(shù)包括免疫細(xì)胞化學(xué)法、流式細(xì)胞術(shù)、熒光定量PCR、FISH技術(shù)、二代測序技術(shù)等，可結(jié)合細(xì)胞形態(tài)和腫瘤標(biāo)志物對CTCs 進(jìn)行鑒定、形態(tài)/功能亞群分析以及治療/耐藥靶點(diǎn)檢測。

4 液體活檢在腫瘤領(lǐng)域的臨床應(yīng)用

4.1 輔助臨床診斷和分期傳統(tǒng)影像學(xué)檢查未能發(fā)現(xiàn)病灶時(shí)，外周血中已存在ctDNA、EVs和CTCs，早期檢測這些標(biāo)志物有助于腫瘤的診斷。ctDNA 異常甲基化檢測已進(jìn)入結(jié)直腸癌、肺癌、胰腺癌等腫瘤篩查和診斷的臨床實(shí)踐。例如p16INK4A 啟動(dòng)子［25］、SHOX2和PTGER4等基因［26］異常甲基化均可輔助肺癌的診斷。關(guān)于EVs，研究發(fā)現(xiàn)肺癌患者的miR-21［27］、結(jié)直腸癌患者的CRNDE-h［28］表達(dá)水平顯著升高，提示EVs 可成為腫瘤的早期診斷標(biāo)志物。據(jù)報(bào)道，外泌體源性LINC00152和lncRNA-CRNDE-h 在胃癌和結(jié)直腸癌早期診斷中優(yōu)勢突出。此外，研究表明CTCs 與乳腺癌［29］、非小細(xì)胞肺癌［30］、結(jié)腸癌［31］等臨床分期的關(guān)系密切。除了數(shù)量的差異，CTCs的分子特征在腫瘤分期中也具有指示作用，CTCs 中g(shù)a733.2、muc-1，、mgb1、spdef 基因表達(dá)水平與乳腺癌分期顯著相關(guān)［32］。

4.2 輔助進(jìn)行療效評(píng)估以及耐藥性監(jiān)測液體活檢在耐藥性檢測及療效評(píng)估中的應(yīng)用引起了廣泛關(guān)注。通過檢測ctDNA的變化如乳腺癌患者HER2的異常擴(kuò)增［33］，非小細(xì)胞肺癌患者T790M 突變［34］等可預(yù)測腫瘤耐藥。外泌體在腫瘤耐藥性的產(chǎn)生與傳遞中發(fā)揮重要的作用。胰腺癌患者外泌體分泌增多，可促進(jìn)吉西他濱耐藥性的產(chǎn)生［35］。耐藥患者與敏感患者的外泌體蛋白表達(dá)也存在差異，例如卵巢癌鉑類藥物耐藥患者的外泌體annexin A3 表達(dá)水平明顯高于敏感組［36］。因此，外泌體可作為指示耐藥和評(píng)估療效的標(biāo)志物，且抑制特異性外泌體的釋放可能可逆轉(zhuǎn)耐藥性的產(chǎn)生，亦可為突破腫瘤治療的耐藥性瓶頸提供新的方向。CTCs的數(shù)量及分子特征也可提示治療效果和耐藥。CTCs 根據(jù)其分子特征可分為不同的亞群，如腫瘤干細(xì)胞樣、EMT 樣和轉(zhuǎn)移起始樣CTCs等，其中根據(jù)EMT的程度又可分為上皮型、間質(zhì)型、混合型亞群。有研究發(fā)現(xiàn)CTCs的EMT 可作為乳腺癌耐藥標(biāo)志物［37］，間質(zhì)型CTCs 比例減少提示治療有效，反之與疾病進(jìn)展相關(guān)。因此，CTCs亞群分析有助于制定個(gè)體化、有效化、靶向化的治療方案，進(jìn)一步推進(jìn)腫瘤精準(zhǔn)診治。此外，對分離出的CTCs 進(jìn)行體外培養(yǎng)，有利于藥物敏感性機(jī)制的研究，開發(fā)相應(yīng)的靶向藥物。

4.3 實(shí)時(shí)監(jiān)測腫瘤的發(fā)展?fàn)顩r和預(yù)后判斷傳統(tǒng)的組織活檢重復(fù)取樣受限，難以實(shí)現(xiàn)動(dòng)態(tài)監(jiān)測，因此臨床上治療方案的調(diào)整與預(yù)后評(píng)估困難重重。液體活檢在規(guī)避上述局限性的同時(shí)，還可綜合腫瘤異質(zhì)性因素對疾病進(jìn)展進(jìn)行監(jiān)測，并且為揭示腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制提供依據(jù)。有研究［38］發(fā)現(xiàn)肝癌患者不同血管部位的CTCs 分布與生物學(xué)特征例如EMT 狀態(tài)存在明顯的空間異質(zhì)性，對肝癌多血管CTCs 檢測有助于揭示其轉(zhuǎn)移的新機(jī)制以及預(yù)測其轉(zhuǎn)移模式。ctDNA 特征分析可溯源腫瘤的發(fā)生部位［39］，從而為腫瘤原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶的判斷提供信息。此外，ctDNA的遺傳信息和腫瘤組織有良好的一致性，可作為腫瘤復(fù)發(fā)監(jiān)測和預(yù)后評(píng)估的標(biāo)志物。例如，ctDNA的BRAF 突變水平可作為黑色素瘤患者生存的一項(xiàng)預(yù)測因素［40］。另一方面，EVs 尤其是外泌體，在預(yù)后評(píng)估中也展現(xiàn)了極大的應(yīng)用價(jià)值。EVANS等［41］指出放化療中Annexin 陽性外泌體含量和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的早期復(fù)發(fā)與總生存期相關(guān)。乳汁外泌體TGFβ2 水平分析有助于乳腺癌進(jìn)展的評(píng)估［42］。此外，大量研究表明，CTCs 是早期乳腺癌［43］、胃癌［44］、非小細(xì)胞肺癌［45］等患者的獨(dú)立預(yù)后因素。

4.4 腫瘤的靶向治療近年來，針對免疫檢查點(diǎn)抑制劑、血管形成和關(guān)鍵信號(hào)通路的腫瘤靶向療法逐漸成為熱點(diǎn)問題。ctDNA 腫瘤突變負(fù)荷、EVs 內(nèi)容物圖譜、以及CTCs數(shù)量與分子表征在靶向療法群體篩選和治療方案調(diào)整中均有指示作用。Lentz 提出全血經(jīng)膜濾過法［46］可減少外泌體，使部分患者的腫瘤縮小了50%以上。利用腫瘤抗原刺激自體樹突細(xì)胞，產(chǎn)生EVs，激活相應(yīng)抗腫瘤免疫活性，可使患者病情減緩［47］。EVs 內(nèi)容物也可作為有效的腫瘤靶向抑制劑，且EVs 是機(jī)體天然的內(nèi)源性物質(zhì)，且有較好的膜穩(wěn)定性和靶向性，可作為良好的藥物傳遞載體。研究表明，針對耐藥性肺癌，外泌體包裹紫杉醇后藥效可提高至紫杉醇直接給藥的50 倍［48］。盡管尚有許多挑戰(zhàn)亟待解決，EVs 在靶向載藥和腫瘤免疫治療方面仍展現(xiàn)出巨大的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

5 總結(jié)與展望

液體活檢作為一種非侵入性的新型檢測技術(shù)，具有取樣方便、可動(dòng)態(tài)監(jiān)測等優(yōu)勢。針對液體活檢標(biāo)志物ctDNA、EVs和CTCs的檢測分析，在腫瘤的早期診斷、耐藥監(jiān)測、療效評(píng)估、預(yù)后判斷中具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。但是，液體活檢技術(shù)也存在一些亟待解決的問題。一方面，ctDNA、EVs和CTCs的檢測技術(shù)缺乏規(guī)范化的流程和質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，尚未有統(tǒng)一的臨床參考值。另一方面，如何在提高檢測特異性、靈敏性、經(jīng)濟(jì)性之間取得平衡仍值得考量。目前，大多數(shù)檢測都只聚焦于一種分析物，而綜合多種血液分析物的多參數(shù)檢測可能可以大幅度改善檢測的精確度和使用范圍?；跈z測技術(shù)、基礎(chǔ)生物學(xué)、分子生物學(xué)等多學(xué)科發(fā)展將是液體活檢未來的方向，需要我們深入了解液體分析物的產(chǎn)生機(jī)理和動(dòng)態(tài)變化，確認(rèn)液體標(biāo)志物的臨床有效性和實(shí)用性，進(jìn)而推動(dòng)液體活檢在腫瘤臨床診療中的廣泛應(yīng)用。