張臣臣 尹熙惠 楊智昉 何希彪 方成虎

1延邊大學附屬醫(yī)院（吉林延邊133000）；2上海健康醫(yī)學院基礎(chǔ)醫(yī)學院（上海201318）

心肌梗死（myocardial infarction，MI）是冠狀動脈閉塞或痙攣所致的血流供應出現(xiàn)急劇減少或中斷時間較長，使得部分心肌因嚴重缺血、缺氧發(fā)生局部壞死。MI發(fā)生后，壞死的心肌不可再生，瘢痕組織將取而代之修復壞死區(qū)域的心肌細胞。隨時間推移，MI患者最終會出現(xiàn)心室重構(gòu)、心力衰竭，嚴重影響發(fā)病后的生存質(zhì)量，甚至死亡[1]。目前臨床治療MI主要采取3種方法：靜脈溶栓、經(jīng)皮冠狀動脈介入術(shù)、冠狀動脈旁路移植術(shù)。但是上述3種治療方法僅能在短期內(nèi)緩解病情及癥狀，并不能從根本上修復已經(jīng)受損及死亡的心肌細胞。因心肌細胞為高度分化的終末細胞，壞死后不能再生[2]，上述治療方法對已壞死心肌無再生作用。對于醫(yī)療工作者來說尋求新的治療MI及改善遠期預后的方法，意義重大。近年來，細胞替代治療以其極具潛力的應用前景引起了臨床和基礎(chǔ)醫(yī)學工作者的關(guān)注[3-6]。其核心策略為利用患者自體或異體細胞移植入受損組織或器官，最終實現(xiàn)缺失部位的替代和功能的修復。

大量動物實驗以及臨床研究已證實移植胚胎干細胞[7]、脂肪間充質(zhì)干細胞[8]、臍帶血間充質(zhì)干細胞[9-11]、骨髓間充質(zhì)干細胞[12-14]、誘導多能干細胞[15]等能使壞死的心肌再生，這些干細胞具有來源廣泛、容易體外分離、擴增等優(yōu)點，但也存在如社會倫理問題、免疫排斥反應、致瘤性、療效不確定性等不足之處[16]。因此，開發(fā)一種能解決上述不足的理想細胞來源，便成為當前細胞治療研究的熱點[17]。

人羊膜上皮細胞（human amniotic epithelial cells，hAECs）克服了以上細胞的缺點，以其廣泛可用性、干細胞特性、低免疫源性、分化可塑性、無致瘤性，容易獲取且不涉及倫理問題等優(yōu)點[18-19]，成為細胞替代治療MI的一個新的發(fā)展和研究熱點，近10年來受到了越來越多的關(guān)注。本文將圍繞hAECs在MI治療方面的作用及其機制進行綜述。

1 hAECs的來源及特性

hAECs單層分布構(gòu)成了羊膜上皮，羊膜上皮與羊水直接接觸，電鏡下可見hAECs表面的微絨毛，使得羊水與羊膜間進行物質(zhì)交換。hAECs是在受精后第8天左右由多能性上胚層分化而來，當胚囊嵌入子宮內(nèi)膜間質(zhì)時分為兩層：原始外胚層和原始內(nèi)胚層。原始外胚層隨后分化為外、中、內(nèi)三個胚層，并最終形成發(fā)育中的胚胎[16]。羊膜腔在原始外胚層中形成，靠近羊膜腔的細胞即為hAECs。

有學者[20-23]提出，器官的發(fā)生始于原腸胚，但是hAECs發(fā)生于原腸胚形成前，以及羊膜腔的隔離，原腸胚的器官形成信號分子可能不能完全作用于hAECs，推測其仍然保留有較多的干細胞特性。hAECs在體外培養(yǎng)的條件下可以表達多能干細胞標記物如OCT-4、NANOG、SOX-2等；胚胎干細胞標記物如 SSEA-3、SSEA-4、TRA 1-60、TRA1-81；以及間充質(zhì)干細胞標記物CD105、CD90、CD73等[23-28]；除表達干細胞特異標記外，hAECs還有向三個胚層組織分化的潛能[29]，國內(nèi)外大量研究表明可以誘導原代hAECs分化為心肌樣細胞[30]、成骨樣細胞[31]、胰島樣細胞[32]、肝樣細胞[33]、神經(jīng)樣細胞[34]等。不僅如此，hAECs可獲得充足的細胞數(shù)量，無致瘤性，分泌抗炎因子、防止移植后炎性反應的發(fā)生等特點[20]。

2 hAECs在MI治療的作用

體外分化研究中，MIKI等[23]已成功將hAECs分化成三個胚層的不同細胞，其中包括中胚層的心肌樣細胞，證明了hAECs向心肌細胞分化的細胞療法的可能性。FANG等[30]將表達上皮細胞特異性標記的hAECs移植入由液氮造成的MI大鼠模型后，在1個月內(nèi)能在體內(nèi)分化成表達心肌細胞特異性標記MHC的心肌樣細胞，通過免疫組化及分子生物學分析等實驗證實，分化后的細胞有效減少了梗死面積，PET及超聲心動圖等實時監(jiān)測分析進一步顯示，心臟功能也得以部分恢復。該研究更進一步將hAECs移植與臍帶血及脂肪源間充質(zhì)干細胞移植的效果做了對比，結(jié)果顯示hAECs能夠達到與臍帶血及脂肪源間充質(zhì)干細胞相似的MI治療效果。值得注意的是，移植入心臟的hAECs存活率僅有3%，且其治療機制尚不明確，預示此移植方案仍有很大的調(diào)整和優(yōu)化空間。盡管如此，在此研究中展現(xiàn)的較好治療效果仍然說明，hAECs可能是心肌再生細胞治療的極佳細胞來源。王鈺瑩等[35]將hAECs移植到左前降支結(jié)扎的大鼠模型中，發(fā)現(xiàn)hAECs移植組較MI模型組梗死區(qū)存活的心肌細胞更多，纖維化程度更小，左心室重構(gòu)減輕、延緩。

基于以上研究，ROY等[28]認為hAECs較低的移植效果可能是由于hAECs本身不具有較高的移動性和合適的胞外基質(zhì)導致的，所以用TGF-β1對hAECs進行了上皮間充質(zhì)化（epithelial-to-mesenchymal transition，EMT），并將 EMT-hAECs移植入前降支結(jié)扎的MI小鼠模型。在體外hAECs培養(yǎng)基中加入TGF-β1培養(yǎng)6 d后，hAECs典型的鵝卵石樣形態(tài)改變，呈成纖維細胞形狀，且細胞體積增大，細胞移動性增強。通過免疫組化及分子生物學分析等實驗進一步顯示，與hAECs相比EMT-hAECs膜表面蛋白、分子信號傳導通路、EMT特異蛋白比例、明膠酶的活性、細胞基質(zhì)、細胞骨架及基因的表達樣式都發(fā)生明顯變化，證明了經(jīng)TGF-β1誘導后的hAECs實現(xiàn)EMT，hAECs失去了原有的上皮細胞特征及基因表達模式。隨后的MI移植實驗顯示，EMT-hAECs相較hAECs在移植后4周表現(xiàn)出更好的治療效果，包括更高的左室射血分數(shù)，更大的心輸出量與心肌形變率。病理及生化分析結(jié)果顯示，EMT-hAECs處理的MI面積更小，TUNEL陽性的凋亡細胞更少，以及更多的骨膜蛋白分泌，但在心肌血管密度上與hAECs比較無差異。以上研究顯示出hAECs在MI治療方面的巨大前景。

3 hAECs在MI治療中提高心功能的機制

在對MI大鼠模型的細胞移植中，僅有3%的hAECs轉(zhuǎn)化為心肌樣細胞[30]。由此可見為數(shù)不多的心肌樣細胞可能并不是改善心功能的關(guān)鍵因素。SONG等[36]提出hAECs移植后的旁分泌機制可能在改善心功能中起到關(guān)鍵作用。伴隨著低氧指示分子HIF1α的明顯增多，hAECs分泌的諸多關(guān)鍵細胞因子都有明顯增加，其中包括促血管生成相關(guān)因子如血管生成素（Ang）、表皮生長因子（EGF）等，以及炎癥相關(guān)因子如白介素6（IL-6）和單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）。與體外模型結(jié)果一致，體內(nèi)實驗中hAECs移植區(qū)域附近的組織中編碼以上細胞因子的基因轉(zhuǎn)錄表達水平也有顯著提高，證明了hAECs介導的旁分泌通路的確在移植后發(fā)揮了正向的作用。值得注意的是，與移植1 d后的檢測結(jié)果相比，一周后部分細胞因子如EGF和IL-6的表達有明顯的下降，說明hAECs的旁分泌療效持續(xù)時間較短。這也反映了hAECs用于細胞替代治療的不足之處。優(yōu)化hAECs的特性成為其繼續(xù)發(fā)展另一途徑。

與未修飾的hAECs移植相比，EMT-hAECs并不是通過增強血管再生或心肌細胞再生的途徑來提高hAECs改善心功能的作用，而是借由減少梗死區(qū)TUNEL陽性凋亡細胞數(shù)量、促進心肌成纖維細胞分泌骨膜蛋白、激活整合素介導的局灶性粘附激酶信號以加快成纖維細胞增殖和遷移，以及促進細胞外基質(zhì)（ECM）重構(gòu)等分子與細胞機制，進一步縮小梗死面積。IL-8為EMT-hAECs治療過程中增加最明顯的細胞因子，其對人類心力衰竭有不良影響。但另一方面，IL-8已被證實有調(diào)節(jié)骨髓血管母細胞心肌歸巢和血管生成作用。IL-8的作用仍存在爭議[37]，但為靶向化治療MI提供了科學依據(jù)。

旁分泌作為移植細胞保護心肌、提高心功能的機制之一，為hAECs移植治療MI提供了新方向。各種干細胞衍生的外泌體通過向細胞外分泌一些蛋白質(zhì)、脂質(zhì)體及小RNA，在細胞及組織之間傳播信息，保護心臟功能[38]，參與梗死后心臟的修復[39]。其中KHAN等[40]的研究發(fā)現(xiàn)胚胎干細胞來源的外泌體促進MI后新生血管的生成、提高心肌細胞存活及降低心臟纖維化的發(fā)生。其研究還發(fā)現(xiàn)胚胎干細胞源的外泌體作用機制是通過向心臟祖細胞傳遞miR-294，促進心臟祖細胞的存活及增殖，從而修復受損心肌，提高心功能。除此之外還有各種間充質(zhì)干細胞[41-43]，其衍生的外泌體有同樣的功效。值得注意的是不同干細胞，其外泌體包含的成分及其作用機制各不相同。hAECs在移植到梗死心肌后，心功能較移植前提高，是否與其外泌體機制有關(guān)，值得進一步研究。

4 hAECs在MI治療的臨床運用及前景

目前用于MI細胞替代治療的臨床試驗方式有如下3種：經(jīng)冠狀動脈注射、心肌內(nèi)注射、靜脈注射。經(jīng)冠狀動脈注射在臨床試驗研究中最常見，即直接將干細胞注射到冠狀動脈。在YANG等[44]的臨床試驗中，16例前壁心肌梗死的患者行經(jīng)皮冠狀動脈介入術(shù)3周后，隨機將骨髓間充質(zhì)干細胞經(jīng)左前降支或右冠狀動脈注入。6個月后，隨訪發(fā)現(xiàn)患者心功能較移植前有明顯改善。但此移植方式仍存在不足，經(jīng)冠狀動脈注射在治療過程中可能引起短暫的冠狀動脈血流減少、遠端心肌缺血，甚至可能造成微循環(huán)堵塞導致新的心肌梗死。心肌內(nèi)注射的方式，即將細胞直接注射到病灶處，最大程度的保證靶部位移植細胞的數(shù)量，但其操作步驟復雜且存在心臟穿孔、血栓栓塞及惡性心律失常的風險[45]。靜脈注射，即將移植細胞直接注入到靜脈中，移植細胞經(jīng)血液循環(huán)到達靶器官，此方法雖操作簡單，但其致命缺點決定了此種方式移植效率最差。移植細胞注入循環(huán)系統(tǒng)后，大部分會遷徙到肺臟和肝臟中，真正歸巢到心臟的細胞數(shù)量僅占很小一部分[46]。目前已有的臨床試驗證實，只有少于10%的干細胞在移植24 h后能存活。移植4周后，心臟中移植的干細胞僅有約1%能存活[47]。干細胞移植前預處理，提高其在靶器官的存活率顯得尤為重要[48]。目前應用到臨床試驗的主要的方法有：通過基因修飾技術(shù)，向移植細胞內(nèi)轉(zhuǎn)染抗凋亡基因[49]，此方法雖可以提高干細胞移植后的存活率，但基因修飾后的干細胞實際治療效果有待進一步臨床試驗證實；將移植細胞與生物材料結(jié)合后移植[50-51]，即把移植細胞和先進的生物材料及技術(shù)結(jié)合以提高移植細胞存活率，但此方法實現(xiàn)條件較繁瑣，運用到實際臨床試驗前還需不斷優(yōu)化；移植前予以缺血、缺氧處理，增強其對缺氧環(huán)境下的耐受性[52-53]，即在移植前，預先將移植細胞置于和移植靶區(qū)類似的缺氧環(huán)境中，激活抗凋亡及抑制促凋亡通路，提高移植細胞的存活率。短時間內(nèi)，此種方法有效，但移植后遠期存活率，有待深入研究。

FANG等[30]研究中證明了在大鼠MI模型中移植hAECs后，有3%hAECs轉(zhuǎn)化為心肌樣細胞，且大鼠的心功能得到改善，但是其研究并未闡明心功能改善的具體機制。SONG等[36]在hAECs治療MI的研究中提出了旁分泌機制，并解釋了hAECs移植到梗死心肌后通過分泌各種促血管生成因子，使梗死區(qū)側(cè)支循環(huán)生成，挽救更多受損瀕臨死亡的心肌以改善心功能。此研究雖證明了旁分泌機制改善心功能的可行性，但未進一步研究明確哪些細胞因子在MI治療中起到關(guān)鍵作用。若能明確hAECs分泌的哪些關(guān)鍵細胞因子能修復受損心肌細胞，體外培養(yǎng)hAECs，提取關(guān)鍵細胞因子，再應用到MI患者身上，也不失為一種治療MI的新途徑。其研究還發(fā)現(xiàn)hAECs移植后持續(xù)分泌細胞因子的時間并不長，間接說明了hAECs在MI治療中存在的一些劣勢。

應對hAECs存在的缺點，ROY等[28]研究中提出在體外使用TGF-β1改良優(yōu)化hAECs，然后再移植到MI小鼠模型中，并通過實驗證明EMT-hAECs可以增強hAECs治療MI的作用。并闡述hAECs優(yōu)化后是通過減少受損心肌的凋亡及調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)加快修復受損心肌來提高對心功能的保護作用。體外進一步優(yōu)化hAECs特性，再應用到具體細胞治療，是細胞替代治療又一個新的發(fā)展方向。外泌體在保護及修復心臟的作用得到越來越多研究證實，但是其具體機制尚不明確，尤其hAECs，其外泌體在MI作用中的研究仍是空白，值得進一步深入探究。

雖然hAECs細胞替代治療研究還停留在臨床前實驗研究上，卻為MI治療提供了更多方向和手段，其在MI治療的研究潛力是不可估量的。相信其后續(xù)研究能有更大進展，并真正應用到臨床實踐中。