魯明騫，陸海燕，馮雪松，高嫣，李莉娥，李薇，張蓉，孔慶志

(1三峽大學第一臨床醫(yī)學院 宜昌市中心人民醫(yī)院，湖北宜昌443000；2宜昌人福藥業(yè)有限責任公司；3武漢市中心醫(yī)院 武漢市腫瘤研究所)

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，2015年世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，女性因乳腺癌而死亡占各種腫瘤死亡的首位[1]。在我國，乳腺癌發(fā)病率占女性惡性腫瘤的第一位。手術聯(lián)合放療、化療、內分泌、靶向藥物、免疫和中醫(yī)中藥等綜合治療是乳腺癌的主要治療方式，經過規(guī)范的治療，大部分乳腺癌患者是可以治愈的，但部分患者在初診時即為中晚期，不能完全根治[2]。因此，進一步了解乳腺癌的發(fā)病機制，尋找新的藥物和新的靶點，對提高乳腺癌的治愈率和生存率、改善生活質量有重要意義。目前研究發(fā)現(xiàn)，微小RNA(microRNA)與多種惡性腫瘤密切相關[3～7]，在腫瘤診斷、治療與預后中發(fā)揮著重要作用。因此，microRNA有可能成為腫瘤診斷、治療和預后的一個潛在的生物標志物。既往研究發(fā)現(xiàn)，槐耳清膏在乳腺癌中可發(fā)揮抑制細胞增殖、誘導細胞凋亡、降低放化療毒副反應、提高乳腺癌術后化療患者的免疫功能等作用[8～11]，但其機制尚不明確。2013年5月～2015年8月，我們對槐耳清膏作用于乳腺癌雌激素受體陽性(ER+)的MCF-7細胞及雌激素受體陰性(ER-)的MDA-MB-231細胞中microRNA表達譜的影響進行研究，初步探討乳腺癌細胞中microRNA的表達譜變化，為研究槐耳清膏治療乳腺癌的分子機制提供依據。

1 材料與方法

1.1 細胞與材料 乳腺癌細胞(MCF-7及MDA-MB-231)購自美國Amercian Type Culture Collection(ATCC)。PRM-1640培養(yǎng)液購自美國Gibco公司；胎牛血清購自美國Hyclone公司；0.25%胰蛋白酶購自上海碧云天生物技術有限公司；二甲基亞砜購自Amersco公司；TRIzol購自美國Invitrogen公司；Annexin V-FITC/PI試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；熒光素報告基因檢測試劑購自美國Promega公司；TaqMan microRNA逆轉錄試劑盒、mirVana TmmicroRNA Isolation Kit試劑盒購自德國Qiagen公司。

1.2 細胞培養(yǎng) MCF-7及MDA-MB-231細胞于5×105/孔平鋪于六孔板中，5% CO2、37 ℃培養(yǎng)24 h，分別加入濃度為9 mg/mL槐耳清膏(槐耳清膏組)和相同體積的PBS(對照組)，5% CO2、37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)24 h，待提取RNA。

1.3 microRNA的篩選 利用熒光實時定量PCR法。根據mirVana TmmicroRNA Isolation Kit試劑盒要求提取兩種細胞的RNA，分光光度計測定260 nm及280 nm的吸收值，評估RNA的純度和濃度，并采用Agilent Bioanalyzer 2100評價總RNA質量。上述實驗重復3次。microRNA測定由博奧生物技術有限公司完成。將3次實驗提取的RNA混合，加入100 ng總的RNA去磷酸，用pCp-Cy3標記，標記后的microRNA與Agilent人類microRNA雜交，經清洗、掃描，由Feature Extraction10.7軟件提取。用TRIzol提取總的RNA，異丙醇沉淀濃縮RNA，分光光度計定量。microRNA分離，芯片篩選出乳腺癌MCF-7及MDA-MB-231細胞中上調和下調的microRNA。以熒光信號強度的比值log2(ratio)<-1或>1為顯著性差異表達microRNA。

2 結果

2.1 MCF-7細胞microRNA表達譜變化 槐耳清膏作用于乳腺癌MCF-7細胞后，表達上調的有miR-7-5p、miR-21-5p、miR-100-5p、miR-125b-5p、miR-126-3p、miR-328-5p，表達下調的有miR-10b-5p、miR-31-5p、miR-127-3p、miR-128-3p、miR-145-5p、miR-146-5p、miR-199a-5p、miR-200b-5p、miR-205-3p、miR-206、miR-210-5p、miR-218-5p、miR-221-3p、miR-326、miR-340-5p、miR-335-5p、miR-345-5p、miR-375、miR-373-3p、miR-451a、miR-520a-3p。miR-7-5p、miR-21-5p、miR-126-3p在MCF-7細胞系中上調最明顯。

2.2 MDA-MB-231細胞microRNA表達譜變化 槐耳清膏作用于MDA-MB-231細胞后，表達上調的有miR-10b-5p、miR-21-5p和miR-127-3p，表達下調的有miR-7-5p、miR-31-5p、miR-100-5p、miR-125b-5p、miR-126-3p、miR-128-3p、miR-145-5p、miR-146-5p、miR-199a-5p、miR-200b-5p、miR-205-3p、miR-206、miR-210-5p、miR-218-5p、miR-221-3p、miR-326、miR-328-5p、miR-340-5p、miR-335-5p、miR-345-5p、miR-375、miR-373-3p、miR-451a、miR-520a-3p。miR-10b-5p、miR-21-5p在MDA-MB-231細胞系中上調顯著。

2.3 兩種細胞中共同變化的microRNA 在MCF-7和MDA-MB-231細胞中，表達共同上調的是miR-21-5p，共同下調的有miR-31-5p、miR-128-3p、miR-145-5p、miR-146-5p、miR-199a-5p、miR-200b-5p、miR-205-3p、miR-206、miR-210-5p、miR-218-5p、miR-221-3p、miR-326、miR-328-5p、miR-340-5p、miR-335-5p、miR-345-5p、miR-375、miR-373-3p、miR-451a、miR-520a-3p。

3 討論

癌癥的發(fā)生和發(fā)展是多因素參與、多基因改變及多階段發(fā)展的復雜生物學過程，其分子調控機制目前仍未完全明確。microRNA是一類長度18～25 nt的非編碼RNA，能影響蛋白質的表達，是一類十分重要的轉錄后調控因子，參與并調控人類約30%的編碼基因。microRNA具有高度的保守性和器官組織特異性，通過調控靶基因的表達，對細胞發(fā)育、增殖、分化和凋亡等有一定作用。microRNA是基因調控中的核心成分，在癌癥發(fā)生中有些具有癌基因作用，可促使腫瘤的發(fā)生；有些則具有抑癌基因的作用，能抑制腫瘤的生長，同時也參與癌癥的增殖、浸潤、血管生成、凋亡及信號轉導通路等環(huán)節(jié)[12,13]。目前研究發(fā)現(xiàn)2 000多個microRNA能調控大約1/3的人類基因表達[14]。隨著基因芯片和高通量測序技術的出現(xiàn)以及研究的進一步深入，microRNA的特點和功能被進一步認識。研究發(fā)現(xiàn)，不同的腫瘤甚至組織分類及分子分型都具有特異相關的microRNA表達譜[15,16]。因此可通過基因芯片和高通量測序技術的應用篩選腫瘤特異相關的microRNA表達譜，從而為腫瘤的早期診斷及靶向治療提供特異有效的靶點。

劉冬冬等[17]對乳腺癌患者血清中差異表達的microRNA表達譜進行分析，通過高通量測序技術篩選出28個差異性表達的microRNA，認為血清中hsa-miR-374a-5p、hsa-miR-223-3p、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-320a這4種microRNA有可能作為乳腺癌診斷的潛在標志物。而Sochor等[18]研究發(fā)現(xiàn)，早期乳腺癌患者治療后血清miR-155、miR-181b、miR-19a、miR-24 的表達水平下調，其表達水平與乳腺癌風險程度及治療效果相關。對于三陰性乳腺癌中差異表達的microRNA表達譜，Sylwia等[19]認為miR-190a、miR-136-5p、miR-126-5p、miR-135b-5p和miR-182-5p可能與三陰性乳腺癌的發(fā)生發(fā)展有關。

槐耳用于治療惡性腫瘤已有1 000多年的歷史，其主要抗癌成分為槐耳蛋白多糖(PS-T)，功能是抑制細胞增殖、誘導細胞凋亡、減少細胞遷移和侵襲、逆轉細胞耐藥、提高患者免疫功能和生活質量[20,21]。本課題組前期結果表明，槐耳清膏能抑制裸鼠移植瘤的生長，降低MCF-7細胞成瘤能力和細胞生長成瘤性，抑制細胞增殖[22]?；倍甯鄬θ橄侔┘毎鲋骋种婆c細胞凋亡、細胞周期調控、核苷酸轉移酶活性等因素密切相關，表明槐耳清膏對乳腺癌細胞的增殖抑制和抗腫瘤機制有賴于其它諸多基因的相互調控，是一個多步驟、多階段的發(fā)展過程。本研究通過基因芯片篩查經槐耳清膏和PBS處理的乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231細胞系中差異表達的microRNA，發(fā)現(xiàn)槐耳清膏在有效抑制乳腺癌細胞增殖的同時，對乳腺癌細胞的microRNA表達也有影響，使MCF-7細胞中6個microRNA表達上調，21個表達下調，表達上調顯著的microRNA有miR-7-5p、miR-21-5p、miR-126-3p；使MDA-MB-231細胞中表達上調的microRNA有3個，表達下調的有24個，表達上調顯著的有miR-10b-5p和miR-21-5p。槐耳清膏作用于乳腺癌細胞后，通過異常表達的microRNA，直接或間接抑制腫瘤細胞的生長，促進細胞的凋亡，從而達到抗腫瘤的作用。

既往研究表明，miR-7-5p和miR-126-3p作為抑癌基因具有抑制腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，槐耳清膏作用于乳腺癌細胞后，使miR-7-5p表達上調，細胞周期被阻滯于G0/G1期，從而抑制乳腺癌細胞的增殖[23]；而miR-126-3p表達上調，其增殖、遷移和侵襲等能力顯著抑制，細胞凋亡明顯增強[24]，從而達到抗腫瘤的作用。miR-21-5p和miR-10b-5p在腫瘤組織中呈高表達[25,26]，具有促癌作用，槐耳清膏作用于乳腺癌細胞后，其表達應較低。但本研究發(fā)現(xiàn)其表達仍較高，其機制可能是在細胞信號傳導通路中，miR-21-5p和miR-10b-5p通過調節(jié)靶基因的變化來實現(xiàn)抑制乳腺癌的作用[27,28]，但機制仍需進一步研究。因此，miR-7-5p、miR-10b-5p、miR-126-3p與miR-21-5p有可能作為藥物治療乳腺癌潛在的新的靶點，通過影響乳腺癌細胞增殖與發(fā)展過程，并可能作為乳腺癌診斷、治療和預后的預測指標。

綜上所述，槐耳清膏可影響乳腺癌細胞中microRNA表達水平，在抑制乳腺癌細胞增殖過程中可能通過microRNA及其調控的靶基因相關信號通路來實現(xiàn)的，這些差異表達的microRNA可作為乳腺癌治療的新靶點，但其具體的分子機制有待進一步研究明確。