康道歡，史彩平

(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院/國(guó)家兒童健康與疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，杭州310003)

鋅離子在視網(wǎng)膜上的含量較高，主要分布于視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞，并且在調(diào)節(jié)突觸傳遞、抗氧化應(yīng)激反應(yīng)中起重要作用。研究[1]表明，暗適應(yīng)的破壞、黃斑變性等與人體內(nèi)鋅離子缺乏導(dǎo)致的視網(wǎng)膜抗氧化劑減少有關(guān)。鋅離子同樣可以降低糖尿病患者中脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)和谷胱甘肽水平[2]。研究[3]表明，促紅細(xì)胞生成素(EPO)具有保護(hù)缺氧狀態(tài)下視網(wǎng)膜神經(jīng)和血管的作用，EPO可以通過(guò)抑制HIF-1α的表達(dá)起抗VEGF的作用[4]。研究[5]發(fā)現(xiàn)，EPO及其受體在視網(wǎng)膜中表達(dá)，并且EPO對(duì)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的保護(hù)存在劑量關(guān)系。在低氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜中，EPO通過(guò)抗凋亡途徑來(lái)保護(hù)一過(guò)性缺血缺氧和再灌注損傷，同時(shí)EPO還可以通過(guò)降低炎性因子(TNF-α、IL-1β)的表達(dá)改善缺氧性視網(wǎng)膜病變中的炎性反應(yīng)[6]。鋅離子轉(zhuǎn)運(yùn)體8(ZnT8)在視網(wǎng)膜上表達(dá)，主要表達(dá)于視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞、Müller細(xì)胞。已有文獻(xiàn)報(bào)道ZnT8在糖尿病患者靜脈血[7]及糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中的表達(dá)下降，并且抑制HIF-1α的表達(dá)可以增加ZnT8的表達(dá)。本研究通過(guò)在大鼠Müller細(xì)胞系rMC-1中加入氯化鋅(ZnCl2)及EPO，觀察外源性鋅離子、EPO對(duì)大鼠Müller細(xì)胞系rMC-1細(xì)胞活力、細(xì)胞凋亡率影響，并在此基礎(chǔ)上，通過(guò)在rMC-1細(xì)胞中加入氯化鈷(CoCl2)誘導(dǎo)低氧環(huán)境[8]，觀察低氧環(huán)境、EPO對(duì)rMC-1細(xì)胞中鋅離子濃度、ZnT8表達(dá)的影響?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 加入外源性鋅離子培養(yǎng)的大鼠Müller細(xì)胞系rMC-1細(xì)胞活力及EPO調(diào)節(jié)作用觀察

1.1.1 細(xì)胞培養(yǎng)、分組及鋅離子和EPO的給予 取凍存于液氮中的rMC-1細(xì)胞置于37 ℃水浴鍋中解凍1 min后，轉(zhuǎn)移到含9 mL DMEM+10%血清+1% P/S培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，置于37 ℃培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)3～4代。取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的rMC-1細(xì)胞，按1 000個(gè)/孔接種于96孔板中，分成3組，分別記為ZnCl2組、ZnCl2+EPO組、正常對(duì)照組，分別加入ZnCl2、ZnCl2+EPO、等量培養(yǎng)基，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。ZnCl2組ZnCl2終濃度為125 μmol/L，ZnCl2+EPO組ZnCl2終濃度為125 μmol/L、EPO的終濃度為40 U/mL。

1.1.2 ZnCl2組、ZnCl2+EPO組、正常對(duì)照組細(xì)胞活力觀察 采用MTT法。各組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，PBS清洗一次，加入0.5 mg/mL的MTT溶液孵育4 h，移去上清液，保留結(jié)晶體，每孔加入100 uL DMSO，37 ℃搖床低速振蕩10 min，選擇490 nm為主波長(zhǎng)，570 nm為參比波長(zhǎng)，在酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔的光密度值(OD值)，計(jì)算細(xì)胞活力。細(xì)胞活力=OD值(490 nm)/OD值(570 nm)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.1.3 ZnCl2組、ZnCl2+EPO組、正常對(duì)照組細(xì)胞凋亡率觀察 采用TUNEL法。各組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，PBS漂洗細(xì)胞2次，蛋白酶K(20 μg/mL)室溫孵育5 min，PBS漂洗2次；加入50 μL TUNEL反應(yīng)混合液于標(biāo)本上，在37 ℃暗濕盒中孵育1 h；PBS漂洗2次，DAPI(2 μg/mL)室溫下孵育5 min染核，熒光顯微鏡下觀察，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。細(xì)胞凋亡率=熒光細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2 低氧環(huán)境下大鼠Müller細(xì)胞系rMC-1細(xì)胞內(nèi)鋅離子濃度變化及EPO的調(diào)節(jié)作用觀察

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)、分組及CoCl2和EPO的給予 取凍存于液氮中的rMC-1細(xì)胞置于37 ℃水浴鍋中解凍1 min，解凍后轉(zhuǎn)移到含9 mL DMEM+10%血清+1% P/S培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，置于37 ℃培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)3～4代。取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的rMC-1細(xì)胞接種于蓋玻片上，分成3組，分別記為CoCl2組、CoCl2+EPO組、正常對(duì)照組，分別加入CoCl2(誘導(dǎo)低氧環(huán)境)、CoCl2+EPO、等量培養(yǎng)基。CoCl2組CoCl2終濃度為200 μmol/L，CoCl2+EPO組CoCl2終濃度為200 μmol/L、EPO的終濃度為40 U/mL。

1.2.2 CoCl2組、CoCl2+EPO組、正常對(duì)照組鋅離子濃度觀察 采用鋅離子探針FluoZin-3 AM檢測(cè)低氧環(huán)境及EPO對(duì)rMC-1細(xì)胞內(nèi)鋅離子濃度的影響。各組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，在37 ℃條件下加入FluoZin-3 AM(5 μmol/L)孵育1 h，PBS清洗1次，然后將蓋玻片換成新鮮培養(yǎng)基，37 ℃下繼續(xù)培養(yǎng)30 min，DAPI染核5 min，PBS清洗3次，每次5 min，DAKO封片，熒光顯微鏡下觀察各組細(xì)胞的熒光情況。取1×105個(gè)rMC-1細(xì)胞于熒光比色杯中，用熒光分光光度計(jì)檢測(cè)在激發(fā)波長(zhǎng)為365/490 nm處的熒光強(qiáng)度，以熒光強(qiáng)度表示細(xì)胞內(nèi)鋅離子濃度。

1.2.3 CoCl2組、CoCl2+EPO組、正常對(duì)照組rMC-1細(xì)胞內(nèi)ZnT8表達(dá)影響觀察 ①采用qRT-PCR法檢測(cè)各組rMC-1細(xì)胞內(nèi)ZnT8 mRNA。各組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，棄培養(yǎng)基后用蛋白酶溶解收集細(xì)胞，TRIzol試劑提取RNA，取500 ng RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，逆轉(zhuǎn)錄條件為：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。以cDNA作為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR總反應(yīng)體積20 μL。引物序列如下：ZnT8正向引物為5′-AAGTGGAGACTCTGTGCTGCTTCA-3′,反向引物為5′-GGCCTCGATGACAACCACAAAGAA-3′,β-actin正向引物為5′-GTAAAGACCTCTATGCCAACA-3′,反向引物為5′-GGACTCATCGTACTCCTGCT-3′。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性15 min，95 ℃變性10 s，60 ℃繼續(xù)延伸40 s，共39循環(huán)。以2-ΔΔCt表示細(xì)胞中ZnT8 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。②采用Western blotting法檢測(cè)各組rMC-1細(xì)胞內(nèi)ZnT8 蛋白。各組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，棄培養(yǎng)基后用蛋白酶溶解收集細(xì)胞，加入組織蛋白抽提液提取蛋白，BCA法測(cè)蛋白濃度；取配制好的10%的膠，以每泳道40 mg蛋白進(jìn)行電泳分離，電泳條件為80 V 30 min，120 V 1 h，4 ℃下300 mA 2 h轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5% PBS脫脂牛奶封閉30 min，加入一抗4 ℃孵育過(guò)夜，二抗室溫孵育2 h，Odyssey Infrared Imaging系統(tǒng)計(jì)算細(xì)胞中ZnT8蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 ZnCl2組、ZnCl2+EPO組、正常對(duì)照組rMC-1細(xì)胞活力及凋亡率比較 ZnCl2組、ZnCl2+EPO組、正常對(duì)照組rMC-1細(xì)胞活力分別為0.252±0.034、0.342±0.031、0.513±0.040，組間相比，P均<0.05，說(shuō)明rMC-1細(xì)胞在外源性鋅離子處理后活力下降，EPO治療具有保護(hù)作用。

ZnCl2組、ZnCl2+EPO組、正常對(duì)照組rMC-1細(xì)胞凋亡率分別為60.326%±5.230%、28.268%±3.756%、15.124%±3.521%，組間相比，P均<0.01。

2.2 CoCl2組、CoCl2+EPO組、正常對(duì)照組rMC-1細(xì)胞中鋅離子濃度、ZnT8表達(dá)比較 CoCl2組、CoCl2+EPO組、正常對(duì)照組rMC-1細(xì)胞內(nèi)鋅離子濃度分別為6.712%±1.251%、4.723%±0.892%、3.428%±0.522%，組間相比，P均<0.05。

CoCl2組rMC-1細(xì)胞中ZnT8 mRNA和蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為0.224±0.038、2.436±0.187，CoCl2+EPO組rMC-1細(xì)胞中ZnT8 mRNA和蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為0.314±0.030、3.082±0.247，正常對(duì)照組rMC-1細(xì)胞中ZnT8 mRNA和蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為0.385±0.025、3.583±0.256，組間相比，P均<0.01，說(shuō)明rMC-1細(xì)胞中ZnT8 mRNA和蛋白的表達(dá)在CoCl2處理后表達(dá)下降，在EPO治療后表達(dá)升高。

3 討論

鋅是人體內(nèi)第2豐富的微量元素，并且是維持細(xì)胞正常功能的必須元素，在人體代謝中起重要作用，比如酶的合成、胰島素的合成和釋放等，同樣在免疫反應(yīng)、氧化應(yīng)激、老化過(guò)程中起重要作用。鋅離子豐富表達(dá)于視網(wǎng)膜色素上皮、脈絡(luò)膜和神經(jīng)視網(wǎng)膜，在視網(wǎng)膜中鋅離子參與維持正常的視覺(jué)功能、調(diào)節(jié)突觸傳遞和抗氧化應(yīng)激作用，同時(shí)在視網(wǎng)膜生理、病理過(guò)程中起重要作用[9]。研究[7]表明，人體鋅離子缺乏會(huì)導(dǎo)致的視網(wǎng)膜中抗氧化劑的減少進(jìn)而導(dǎo)致暗適應(yīng)的破壞、黃斑變性和白內(nèi)障等。同時(shí)實(shí)驗(yàn)[10]表明，口服補(bǔ)鋅治療對(duì)早期糖尿病大鼠視網(wǎng)膜病變具有保護(hù)作用，然而在糖尿病視網(wǎng)膜病變晚期，視網(wǎng)膜缺氧條件下，鋅離子的缺乏或超載，均對(duì)視網(wǎng)膜細(xì)胞具有毒害作用。同時(shí)已有許多研究[11,12]表明，細(xì)胞內(nèi)鋅離子蓄積對(duì)神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞和其他細(xì)胞有毒害作用。我們實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了鋅離子蓄積對(duì)細(xì)胞的毒性作用，即在外源性鋅離子處理后，rMC-1細(xì)胞活力下降、細(xì)胞凋亡率增加。同時(shí)EPO對(duì)外源性鋅離子蓄積誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性具有保護(hù)作用，即EPO治療后細(xì)胞活力提高、細(xì)胞凋亡率顯著減少。

本研究結(jié)果表明，低氧環(huán)境下rMC-1細(xì)胞內(nèi)的鋅離子濃度增加，同時(shí)缺氧狀態(tài)下細(xì)胞內(nèi)鋅離子蓄積可能對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，因此缺氧狀態(tài)下鋅離子蓄積產(chǎn)生的細(xì)胞毒害作用可能為缺氧性視網(wǎng)膜損傷的一個(gè)機(jī)制。此結(jié)果還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。已有研究[3]表明，EPO具有保護(hù)缺氧狀態(tài)下視網(wǎng)膜神經(jīng)和血管的作用，EPO可以通過(guò)抑制HIF-1α的表達(dá)起到抗VEGF的作用、EPO可以通過(guò)降低缺氧條件下一些炎癥因子(IL-2、TNF-α等)的表達(dá)發(fā)揮視網(wǎng)膜保護(hù)作用。EPO及其受體表達(dá)于Müller細(xì)胞上。為此，我們研究低氧狀態(tài)下EPO對(duì)Müller細(xì)胞內(nèi)鋅離子是否有調(diào)控作用。我們的研究表明，EPO治療可顯著性減少低氧狀態(tài)下細(xì)胞內(nèi)鋅離子的蓄積，即在低氧狀態(tài)下細(xì)胞內(nèi)鋅離子濃度顯著性增加，在EPO治療后細(xì)胞內(nèi)鋅離子顯著降低。綜上，EPO通過(guò)降低缺氧狀態(tài)下鋅離子蓄積產(chǎn)生的細(xì)胞毒性作用，可能為EPO保護(hù)缺氧性視網(wǎng)膜病變的其中一個(gè)機(jī)制。

研究[2]表明，細(xì)胞內(nèi)鋅離子穩(wěn)態(tài)是靠鋅離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及鋅結(jié)合蛋白維持的。鋅離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白主要分為ZnT(SLC30A)和ZIP(SLC39A)兩大家族，ZnT的作用為轉(zhuǎn)運(yùn)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的鋅離子到細(xì)胞外，ZIP的作用與ZnT正好相反，轉(zhuǎn)運(yùn)細(xì)胞外或細(xì)胞核內(nèi)的鋅離子到細(xì)胞質(zhì),這些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在鋅離子的調(diào)節(jié)過(guò)程中起重要作用。ZnT8廣泛分布于視網(wǎng)膜中，主要表達(dá)于視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞和Müller細(xì)胞中，其在調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鋅離子的動(dòng)態(tài)平衡中起著重要的作用。ZnT8豐富表達(dá)于Müller細(xì)胞中，其對(duì)鋅離子的調(diào)控作用是把鋅離子轉(zhuǎn)移到細(xì)胞外或細(xì)胞核中，從而降低胞漿內(nèi)鋅離子濃度，且已有研究[2]表明低氧狀態(tài)下Müller細(xì)胞內(nèi)ZnT8表達(dá)降低。因此，我們檢測(cè)EPO對(duì)低氧狀態(tài)下ZnT8 mRNA及蛋白水平表達(dá)的影響。本研究結(jié)果表明，在CoCl2處理后，ZnT8 mRNA及蛋白水平的表達(dá)均顯著降低，并且在EPO治療后其表達(dá)顯著增加。因此，EPO可以增加低氧狀態(tài)下Müller細(xì)胞內(nèi)ZnT8的表達(dá)。

綜上所述，EPO對(duì)鋅離子蓄積產(chǎn)生的細(xì)胞毒害作用如細(xì)胞活力降低、細(xì)胞凋亡率增加具有保護(hù)作用，EPO可減少低氧狀態(tài)下rMC-1細(xì)胞內(nèi)鋅離子濃度，其機(jī)制可能與增加ZnT8表達(dá)有關(guān)。本細(xì)胞研究結(jié)果還需動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證，其它鋅離子轉(zhuǎn)運(yùn)體ZnT3、ZnT6、Zip1、Zip2、Zip3等在低氧模型中是否改變及EPO調(diào)節(jié)ZnT8的信號(hào)通路也需進(jìn)一步研究。