馮曉桃，段慧明，程永芳

(1廣西中醫(yī)藥大學 廣西中醫(yī)基礎研究重點實驗室，南寧530200；2廣西中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥科學實驗中心)

2型糖尿病(T2DM)已成為嚴重威脅人類健康的公共衛(wèi)生問題之一?，F(xiàn)代醫(yī)學研究認為，除外胰島素抵抗，胰島β細胞進行性衰竭在T2DM發(fā)生發(fā)展中起關鍵作用。因此，保護和促進胰島β細胞存活成為防治T2DM的重要策略。T2DM往往伴有脂質代謝紊亂，表現(xiàn)為高游離脂肪酸(FFA)血癥[1]。高水平FFA不僅能夠通過抑制胰島素信號通路如磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)信號通路，進而抑制胰島素靶組織對葡萄糖的攝取和利用，引起胰島素抵抗[2,3]，而且還損傷胰島β細胞，甚至導致細胞凋亡[4]。同時，F(xiàn)FA還誘導胰島β細胞產生自噬，保護細胞免受損害[5]。因此，研究FFA調控胰島β細胞自噬的分子機制有助于促進保護胰島β細胞的藥物研發(fā)?，F(xiàn)將自噬在胰島β細胞存活中的作用及FFA對其調控的分子機制研究進展綜述如下。

1 自噬在維持胰島β細胞存活中的作用

1.1 自噬流及其調控機制 自噬是真核細胞借助溶酶體降解其胞質蛋白、細胞器等成分，從而維持細胞穩(wěn)態(tài)的一個調控過程。當細胞感受到自噬信號，如饑餓、缺氧、外界壓力、細胞器損傷、微生物感染等，細胞就會在胞質內形成一膜狀結構，并不斷擴張，逐漸形成新月形的脂質雙層結構，即自噬泡；自噬泡不斷延伸，并將其周圍的細胞器如內質網(wǎng)、線粒體等物質成分包裹，形成環(huán)狀雙層膜結構的自噬體；自噬體隨后與溶酶體結合形成自噬溶酶體，溶酶體酶隨之將包裹的內容物降解，并產生氨基酸、脂肪酸等，供細胞利用。在此過程中，自噬泡和自噬體是產生自噬的形態(tài)學特征；同時，胞質內微管相關蛋白1輕鏈3(LC3)經(jīng)酶解作用形成胞質型LC3-Ⅰ，然后轉變?yōu)槟ば蚅C3-Ⅱ，定位于自噬體膜上，成為自噬的生化標志。事實上，自噬過程(即自噬流)受自噬相關基因(ATG)嚴密調控。在自噬的起始階段，ATG1能募集ATG11、ATG13、ATG17等形成復合物，從而誘發(fā)自噬；隨后形成ATG12-AGT5-AGT16L1多聚體，促進LC3蛋白轉變和定位;同時AGT6(Beclin-1)與ATG14等一起作用于經(jīng)典的Ⅲ型PI3K，促進形成自噬體膜和自噬體；而ATG2-ATG9-ATG18復合物形成則調控著ATG蛋白從成熟自噬體分解，并再循環(huán)利用[6]。

另外，自噬流還受其上游信號通路所調控。在這些信號通路中，哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是其關鍵的負性調控激酶，受Ⅰ型PI3K/Akt信號通路和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)/胞外信號活化激酶1/2(ERK1/2)信號通路激活而抑制自噬流，被AMP活化蛋白激酶(AMPK)信號通路和p53信號轉導所抑制而促進自噬。此外，AMPK信號通路和Ⅲ型PI3K信號通路還可以通過不依賴于mTOR就能誘發(fā)自噬。活化的mTOR能夠磷酸化ULK1(ATG1同源類似物)的Ser757位點，并破壞AMPK與ULK1之間的聯(lián)系，抑制自噬信號；相反，在營養(yǎng)不足的情況下，AMPK能夠直接作用于ULK1，導致ULK1多個位點磷酸化，包括Ser317和Ser777，進而促進細胞自噬。

1.2 自噬與胰島β細胞的關系 自噬在細胞生長、發(fā)育和老化等過程中都起著重要的作用。適度自噬可以更新細胞器和蛋白質，從而維持細胞內環(huán)境穩(wěn)定；而且，自噬產生的氨基酸、脂肪酸等物質又可以重新被利用，提供能量。自噬作為細胞的一種防御機制，可以清除應激狀態(tài)下受損的細胞器和蛋白質，進而保護細胞免受損害和維持細胞存活。研究表明，自噬對于維持胰島β細胞數(shù)量、結構和功能是必不可少的。胰島β細胞缺乏自噬功能可導致細胞增殖能力下降、死亡增加、體積減少、胰島素含量下降和葡萄糖刺激胰島素分泌減少以及機體高血糖、糖耐量損傷和低胰島素血癥[5,7]，而維持自噬功能可以保護胰島β細胞免受內質網(wǎng)應激等所介導的細胞損傷[8]。

2 FFA調控胰島β細胞自噬的分子機制

2.1 FFA對胰島β細胞mTOR依賴性信號通路的影響 長期高水平FFA促使胰島β細胞產生自噬，表現(xiàn)為細胞自噬泡和自噬體顯著增加，LC3-Ⅱ蛋白表達升高以及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ值增大。進一步研究顯示，飽和脂肪酸棕櫚酸(PA)能夠顯著抑制胰島β細胞mTOR、Akt和ERK磷酸化，而對mTOR和ERK蛋白表達無明顯影響[9～11]。抑制mTOR、Ⅰ型PI3K或Akt活性可以進一步提高PA誘導的自噬水平，并預防其誘導的細胞凋亡[9,11]。但也有報道發(fā)現(xiàn)，PA能夠提高胰島β細胞Akt和mTOR磷酸化水平，從而激活mTOR信號通路，抑制自噬轉化，進而提高自噬體和自噬底物表達水平，而抑制mTOR顯著降低了PA誘導的細胞凋亡[12]。

2.2 FFA對胰島β細胞非mTOR依賴性信號通路的影響 在胰島β細胞NIT-1中，PA能夠提高其自噬水平，但細胞AMPK蛋白表達及其磷酸化水平卻下降，而mTOR蛋白表達則升高，表明脂肪酸可以通過非mTOR途徑調控胰島β細胞自噬[13]。

2.2.1 FFA通過內質網(wǎng)應激誘導胰島β細胞自噬 內質網(wǎng)應激的特點是細胞內質網(wǎng)未折疊或錯誤折疊蛋白集聚。未折疊或錯誤折疊蛋白增多可被內質網(wǎng)膜上的感應器包括蛋白激酶R樣內質網(wǎng)激酶(PERK)、肌醇需求酶1α(IRE1α)和轉錄活化因子6(ATF6)所感知，觸發(fā)了未折疊蛋白反應(UPR)?；罨腜ERK磷酸化真核起始因子2α(eIF2α)，從而減少蛋白質合成，減輕內質網(wǎng)負擔，并提高ATF4翻譯；IRE1α活化則提高X盒結合蛋白1(XBP1)翻譯；而ATF6在高爾基水解后釋放活性轉錄因子和促進XBP1轉錄。這些活性轉錄因子能夠增加伴侶蛋白和蛋白折疊酶的合成，誘導未折疊、錯位折疊蛋白降解。因此，適度UPR有利于維持細胞存活和生理功能。但當內質網(wǎng)處理蛋白能力下降，或未折疊/錯誤折疊蛋白過度集聚，超過了內質網(wǎng)自身處理能力時，適度UPR就會向凋亡式UPR轉變，引起細胞凋亡。胰島β細胞富含內質網(wǎng)，蛋白合成與分泌十分活躍，容易誘發(fā)內質網(wǎng)應激。事實上，T2DM患者胰島存在明顯的內質網(wǎng)應激。研究顯示，高水平PA能誘發(fā)胰島β細胞內質網(wǎng)應激[14]，并通過C/EBP同源蛋白(CHOP)實現(xiàn)了適度UPR向凋亡式UPR轉變[15～17]?；罨腃HOP能夠下調抗凋亡蛋白Bcl-2/Bcl-XL表達，而上調促凋亡蛋白Bax表達，繼而激活凋亡執(zhí)行蛋白Caspase-3，導致胰島β細胞凋亡[4,18]。此外，PA在誘導INS-1細胞內質網(wǎng)應激的同時還伴有Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白表達升高[19]。高脂飲食也能夠提高大鼠胰島細胞Beclin-1蛋白表達和降低Bcl-2/Bcl-XL蛋白表達[20]。研究已表明，Bcl-2/Bcl-XL能夠作用于Beclin-1，進而抑制自噬。一方面，Bcl-2/Bcl-XL蛋白表達下降解除了其對Beclin-1的抑制；另一方面，高表達的Beclin-1又能夠掙脫低表達的Bcl-2/Bcl-XL蛋白控制，進而促進自噬。此外，F(xiàn)FA還能通過激活內質網(wǎng)應激下游的c-Jun氨基末端激酶(JNK)信號通路，進而抑制PI3K/Akt信號轉導，促進胰島β細胞自噬[9,18,21]。而且，活化的JNK還能夠磷酸化Bcl-2，抑制Bcl-2和Beclin-1之間的作用，促使Beclin-1釋放[22]，誘發(fā)自噬。抑制JNK可解除PA對Akt磷酸化的抑制，進而減少自噬[9]。研究表明，增強自噬可以降低胰島β細胞內質網(wǎng)應激，減少細胞凋亡[23]；而通過敲除Beclin-1或ATG5抑制自噬則增強了內質網(wǎng)應激[24]?？梢?，脂肪酸誘導胰島β細胞產生自噬至少部分是細胞對其誘導的內質網(wǎng)應激等損害所作出的一種防御性反應，以清除未折疊、錯誤折疊蛋白以及衰老、受損的細胞器，從而維持細胞內環(huán)境的穩(wěn)定。

2.2.2 FFA通過氧化應激誘發(fā)胰島β細胞自噬 氧化應激是機體受到刺激，體內氧化和抗氧化能力失衡，活性氧簇(ROS)、氮簇或自由基等產生增多，超出了自身清除能力，導致組織和細胞發(fā)生氧化損傷的病理過程。ROS包括超氧陰離子(O2-)、過氧化氫(H2O2)和羥基(HO-)。胰島β細胞產生ROS有線粒體和非線粒體途徑。在線粒體內，電子流通過電子傳遞鏈并依賴線粒體內膜4個酶復合物、細胞色素C(Cyt C)和移動載體輔酶Q進行傳遞。在傳遞過程中，O2-主要依靠復合物Ⅰ和Ⅲ產生。O2-不具有膜滲透性，但非?；钴S，能夠在超氧化物歧化酶(SOD)作用下轉變?yōu)镠2O2。H2O2是一非極性、能通過水孔蛋白自由擴散的小分子，活性明顯小于O2-，并在外部刺激下迅速合成和消失。H2O2在過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)和過氧化物氧化還原酶(Prx)的作用下，最終被催化成為氧氣(O2)和水。在線粒體外，磷酸煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADPH)氧化酶能夠將電子轉運到O2，觸發(fā)產生ROS。此外，胞質中多個氧化還原酶也能催化產生ROS。研究發(fā)現(xiàn)，胰島β細胞胞質和線粒體SOD水平是肝臟的50%，而CAT、GPx僅是肝臟的1%，表明胰島β細胞抗氧化能力不足，容易發(fā)生氧化應激。事實上，T2DM患者胰島細胞確實存在氧化應激和細胞損傷[25]。長期高水平FFA通過線粒體途徑和NADPH氧化酶途徑誘導胰島β細胞氧化應激，產生大量ROS，包括H2O2和O2-，同時伴有Bcl-2蛋白表達下降和Caspase-3活性升高以及明顯的細胞凋亡。抑制氧化應激進而減少ROS產生可以維持Bcl-2蛋白表達和抑制Caspase-3活性，從而減輕細胞凋亡。研究表明，Bcl-2能夠調控ROS信號途徑，抑制Bcl-2能夠促進線粒體質子滲漏和SOD活性，提高ROS水平[26]，導致氧化應激的惡性循環(huán)。因此，脂肪酸可通過誘導胰島β細胞氧化應激，降低Bcl-2表達，進而減少Bcl-2和Beclin-1之間的作用，實現(xiàn)對自噬的調控[4,19]。此外，ROS能滲透到內質網(wǎng)，觸發(fā)內質網(wǎng)應激[27]，進而誘導自噬[19,28]。據(jù)報道，PA通過激活氧化應激以及隨后的JNK和p38MAPK信號通路促進了心肌H9C2細胞自噬，抗氧化應激可以抑制JNK和p38MAPK活性以及細胞自噬，而抑制JNK或p38MAPK活性則減少了自噬[29]。

2.2.3 其他 在敲除了CHOP進而抑制內質網(wǎng)應激的胰島β細胞，PA誘導的JNK磷酸化水平并未完全受抑制[15]，而體內敲除CHOP也未明顯影響JNK活性[17]。這些表明，JNK活化存在著非內質網(wǎng)應激依賴性途徑。進一步研究顯示，PA能夠促進雙鏈RNA依賴性蛋白激酶(PKR)磷酸化，進而激活JNK1[30]。活化的JNK磷酸化Bcl-2，進而干擾Bcl-2和Beclin-1之間的作用，誘發(fā)自噬[24,30]。相反，抑制JNK活性則阻斷了PA誘導的胰島β細胞自噬[30]。此外，PA誘導的自噬可以被Ⅲ型PI3K抑制劑所抑制[11,31]，表明PA可以通過Ⅲ型PI3K信號通路調控胰島β細胞自噬。

綜上所述，自噬在維持胰島β細胞存活與功能中起著重要的作用，F(xiàn)FA可誘導胰島β細胞產生自噬。因此，闡明FFA調控胰島β細胞自噬的分子機制將為開發(fā)保護和促進胰島β細胞存活的藥物提供潛在的作用靶點。FFA可通過mTOR依賴的PI3K/Akt和ERK信號通路以及內質網(wǎng)應激、氧化應激途徑、PKR/JNK信號通路和Ⅲ型PI3K信號通路誘導胰島β細胞自噬。盡管如此，F(xiàn)FA調控胰島β細胞自噬的分子機制尚未完全清楚。一方面，F(xiàn)FA能夠改變細胞膜脂質構成，而磷酸肌醇結合蛋白涉及到自噬，那么胞膜脂質成分的改變是否會影響到磷酸肌醇結合蛋白進而調控自噬呢？這需要進一步研究。另一方面，F(xiàn)FA作為一種能量物質，在細胞內能夠代謝生成ATP供細胞利用。但據(jù)報道，在PA孵育的人胰島內ATP水平是下降的[12]，而AMPK表達及其活性卻下降或無改變[12,13,30]；胰島β細胞在缺乏營養(yǎng)時，自噬受到抑制。因此，有必要明確FFA是否改變了胰島β細胞能量代謝，進而影響到自噬。