李乃選 劉紅霞 潘 虹 施 真 于臘梅

1濱州醫(yī)學(xué)院煙臺(tái)附屬醫(yī)院介入血管科 煙臺(tái) 264100；2 濱州醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室

隨著人口老齡化的加劇，年齡相關(guān)性疾病的發(fā)病率和患病人數(shù)逐年增高。世界衛(wèi)生組織預(yù)測(cè)，到2050年，全世界癡呆的人數(shù)將超過1億。血管性癡呆(vascular dementia，VD)是繼阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)后的第二種非常常見的引起癡呆的疾病，大約占癡呆發(fā)病率的15%[1]。VD是由多種腦血管異常，如低灌注、缺氧、缺血、休克等引起的一種不可逆狀態(tài)，主要表現(xiàn)為進(jìn)行性認(rèn)知障礙、記憶喪失以及思維和語言的障礙等。目前尚未發(fā)現(xiàn)控制VD病程進(jìn)展的理想方法和藥物。

參附注射液(Shenfu injection，SF)是根據(jù)南宋名醫(yī)陳自明《婦人良方》中的“參附湯”(人參、附子)加工提煉而成，主要成分為人參皂苷和烏頭類生物堿，兩者協(xié)同具有更優(yōu)的回陽(yáng)救逆、益氣固脫的功效[2]。目前該藥已在臨床用于對(duì)包括腦、肝、心臟、膽道等多個(gè)器官、組織的缺血再灌注損傷進(jìn)行保護(hù)性治療，并得出了較好的效果[3-6]。但至今為止SF對(duì)VD組織病理學(xué)改變及學(xué)習(xí)記憶功能的影響報(bào)道較少，其保護(hù)機(jī)制還有待更進(jìn)一步的研究。本實(shí)驗(yàn)擬探討SF對(duì)慢性VD大鼠學(xué)習(xí)記憶功能等腦保護(hù)作用及其機(jī)制，為臨床VD的防治提供理論依據(jù)和新的藥物靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和藥品 實(shí)驗(yàn)用健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠54只，SPF級(jí)，每只體質(zhì)量為200～250 g，購(gòu)于山東綠葉天然藥物研究開發(fā)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(魯)20090009。所有動(dòng)物自由進(jìn)食標(biāo)準(zhǔn)飼料與水，所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)符合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理規(guī)范。參附注射液購(gòu)于華潤(rùn)三九藥業(yè)有限公司(規(guī)格：10 mL/支，批號(hào)： 15120401001)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組 取健康雄性SD大鼠54只，隨機(jī)分為三組，A組假手術(shù)組；B組模型組；C組藥物組。每組再按缺血后再灌注時(shí)間點(diǎn)不同分為再灌注7、15 d、1月，每亞組各6只。

1.2.2 造模及給藥方法 造模采用雙側(cè)頸總動(dòng)脈反復(fù)夾閉再通+硝普鈉降壓法[7]。用10%水合氯醛溶液(350 mg/kg)腹腔麻醉成功后，立即取仰臥位固定于實(shí)驗(yàn)操作臺(tái)上，頸部備皮，75%酒精常規(guī)消毒，采用頸部正中切口，分離兩側(cè)頸總動(dòng)脈，穿線備用；腹腔注射0.25 mg/mL硝普鈉溶液10 mL/kg，使用無創(chuàng)動(dòng)脈夾先夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈 10 min，再開放 10 min，然后再夾閉10 min，再通；再通后在手術(shù)切口撒上適量青霉素粉末，逐層縫合切口，造模完畢。A組麻醉與手術(shù)過程與模型組、藥物組相同，但不阻斷雙側(cè)頸總動(dòng)脈，不注射硝普鈉。C組于造模后當(dāng)天開始至術(shù)后相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)每日經(jīng)腹腔注射參附注射液，劑量為10 mL/kg。

1.2.3 Morris水迷宮試驗(yàn) Morris水迷宮由自制的圓柱形水池、可移動(dòng)位置的平臺(tái)以及排注水系統(tǒng)組成[8]。水池高65 cm，直徑為160 cm，平臺(tái)高35 cm，直徑為10 cm，實(shí)驗(yàn)中注水深度沒過平臺(tái)1.5 cm。水池內(nèi)壁，底面和平臺(tái)均漆成黑色，實(shí)驗(yàn)中用無毒墨汁將水染成黑色使平臺(tái)不可見。標(biāo)記在平臺(tái)外側(cè)的四個(gè)等距離點(diǎn)把水池分為四個(gè)象限，平臺(tái)置于其中一個(gè)象限的中線上，距池壁20 cm。測(cè)試期間迷宮外各參照物及實(shí)驗(yàn)者位置保持一致，水溫控制在(25±2)℃。

實(shí)驗(yàn)前1 d將大鼠放入水池中(不含平臺(tái))自由游泳2 min，使其熟悉環(huán)境。實(shí)驗(yàn)時(shí)以水池壁上的4個(gè)標(biāo)記A、B、C、D處為入水點(diǎn)，每次實(shí)驗(yàn)時(shí)依次由該4個(gè)入水點(diǎn)將大鼠朝向池壁輕輕放入水中。記錄大鼠從入水到四肢全部登上平臺(tái)所消耗的時(shí)間作為逃逸潛伏期(escape latency，EL)，如果大鼠找到隱匿平臺(tái)讓其在平臺(tái)上停留15 s，再將其取出放在籠中休息。若動(dòng)物2 min內(nèi)尚未找到平臺(tái)，則將動(dòng)物引導(dǎo)至平臺(tái)并使它在上面停留15 s，放回籠中，潛伏期記為120 s。水迷宮測(cè)試在造模后不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行，以觀察藥物療效。每次測(cè)試所有大鼠從1個(gè)標(biāo)記處入水1回為1輪，每次4輪，每輪之間休息15 min，每天上、下午各1次，連續(xù)測(cè)試3 d (共計(jì)6次)，比較各組EL的長(zhǎng)短。

1.2.4 取材及組織病理學(xué)檢測(cè) 在相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)水迷宮試驗(yàn)結(jié)束后，各組大鼠經(jīng)10%水合氯醛(400 mg/kg，腹腔注射)深度麻醉后，迅速開胸暴露心臟，4℃ 預(yù)冷4%多聚甲醛灌注，斷頭剝離海馬組織，固定脫水包埋切片，切片厚度為5 μm, 進(jìn)行HE染色和Nissl染色，光鏡下觀察神經(jīng)元損傷情況并拍照，照片放大倍數(shù)為物鏡×目鏡。另大鼠灌注固定后參照腦立體定位圖譜選取海馬CA1區(qū)，選取標(biāo)本進(jìn)行電鏡標(biāo)本制備，透射電鏡觀察此腦區(qū)超微結(jié)構(gòu)變化。

2 結(jié)果

2.1 一般情況觀察 大鼠在造模術(shù)中，腹腔注射硝普鈉后夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈時(shí)可見大鼠口唇發(fā)紺，而四肢末端無明顯發(fā)紺，腦電圖在缺血期間呈現(xiàn)一條直線，提示大鼠腦部缺血。造模術(shù)后存活的大鼠多數(shù)表現(xiàn)為行動(dòng)遲緩、活動(dòng)減少、眼裂變小、精神萎靡、反應(yīng)遲鈍、毛發(fā)無光、進(jìn)食減少、體重下降，這些癥狀多在72 h后逐漸減輕。假手術(shù)組大鼠無明顯變化。各組大鼠均無明顯肢體癱瘓。

2.2 Morris水迷宮試驗(yàn)檢測(cè) 通過Morris水迷宮檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，VD大鼠逃逸潛伏期在各個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)均較假手術(shù)組明顯著延長(zhǎng) (7 d組：P<0.01； 15 d組：P<0.001；1 月組：P<0.001)，說明各模型組大鼠的空間學(xué)習(xí)、記憶能力顯著下降，造模成功。模型組各時(shí)間點(diǎn)比較，各組間EL值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，提示隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng)，大鼠學(xué)習(xí)記憶能力逐漸下降，癡呆程度逐漸加劇。經(jīng)SF治療后，大鼠逃逸潛伏期與相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的模型組相比明顯縮短。其中7 d和1月組EL值與模型組比較存在明顯差異(7 d組：P<0.05；1月組：P<0.05)，但時(shí)間仍長(zhǎng)于假手術(shù)組(7 d組：P<0.01；1月組：P<0.001)。藥物組內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)比較，EL值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=10.667，P=0.001)。

表1 各組大鼠Morris水迷宮EL值比較

注：與假手術(shù)組比較，*P≤0.05，**P≤0.01，***P≤0.001；與模型組比較，#P≤0.05；同組各時(shí)間點(diǎn)比較，▲P≤0.05；與7d組比較，▲▲P≤0.01，▲▲▲P≤0.001；與15d組比較，★P≤0.05。

2.3 HE染色 圖1所示從左到右依次為假手術(shù)組、模型組和藥物組(SF)；從上到下依次為7 d亞組、15 d亞組和1月亞組。模型7 d組大鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞層次減少，排列稀疏，神經(jīng)細(xì)胞腫脹，細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞核體積變小，深染，結(jié)構(gòu)不清，呈核固縮表現(xiàn)，神經(jīng)纖維排列紊亂(圖1B)。模型15 d組海馬CAl區(qū)錐體細(xì)胞排列進(jìn)一步稀疏、紊亂，細(xì)胞核固縮為三角形或多角形，脫失現(xiàn)象較明顯(圖1E)。模型1月組海馬CA1區(qū)細(xì)胞嚴(yán)重脫失，膠質(zhì)細(xì)胞明顯增生(圖1H)。藥物組較相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的模型組有明顯改善。錐體細(xì)胞水腫略減輕，但錐體細(xì)胞排列紊亂，核固縮仍明顯，部分見神經(jīng)纖維缺失(圖1C、F、I)。

圖1 各組大鼠HE染色 (×400倍)

2.4 Nissl染色 圖2所示從左到右依次為假手術(shù)組、模型組和藥物組(SF)；從上到下依次為7 d亞組、15 d亞組和1 m亞組。 假手術(shù)組各時(shí)間點(diǎn)大鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞及其頂樹突排列整齊且密集，胞漿中尼氏體(粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的核糖體)分布均勻、豐富、顆粒狀、染色深(圖2A、D、G)。模型組各時(shí)間點(diǎn)大鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞排列稀疏，細(xì)胞間隙增大，其頂樹突縮短甚至消失，可見到陷空細(xì)胞，錐體細(xì)胞層有大片細(xì)胞缺失。許多錐體細(xì)胞胞漿內(nèi)尼氏體邊集、減少甚至消失，部分神經(jīng)元內(nèi)出現(xiàn)小空泡(圖2B、E、H)，模型組從7 d～1月組損傷逐漸加重。藥物組各時(shí)間點(diǎn)較相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的模型組有所改善，大鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞及其頂樹突排列尚整齊、密集，胞漿中尼氏體增多，損傷程度減輕(圖2C、F、I)。

圖2 各組大鼠Nissl染色 (×400倍)

2.5 電鏡檢測(cè) 圖3所示從左到右依次為1月時(shí)間點(diǎn)的假手術(shù)組、模型組和藥物組(SF)。假手術(shù)組突觸結(jié)構(gòu)完整清晰，突觸前膜內(nèi)可見大量清亮的突觸小泡。模型組突觸前膜的完整性破壞，部分區(qū)域斷裂、模糊，前膜內(nèi)突觸小泡數(shù)量明顯減少，突觸數(shù)目減少。SF治療后突觸數(shù)目有所增加，突觸的完整性得到大幅度改善，突觸前膜內(nèi)可見較多的突觸小泡。

圖3 各組大鼠海馬組織超微結(jié)構(gòu) (1月)

3 討論

VD是指因多次腦卒中或長(zhǎng)期慢性腦缺血等腦血管因素造成腦組織損害，導(dǎo)致大腦功能全面衰退的綜合征，主要表現(xiàn)為學(xué)習(xí)記憶和認(rèn)知能力減退、情緒改變與行為障礙等。多年來，人們對(duì)VD進(jìn)行了大量的研究，包括其發(fā)病的危險(xiǎn)因素、發(fā)生機(jī)制、診斷和治療等。很多學(xué)者認(rèn)為腦缺血/再灌注和長(zhǎng)期慢性腦灌注不足損傷了中樞神經(jīng)系統(tǒng)是VD發(fā)病的主要原因，已形成了許多假說，如腦內(nèi)能量代謝障礙學(xué)說，興奮性遞質(zhì)的興奮毒性學(xué)說，細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載學(xué)說，自由基代謝紊亂學(xué)說，NO細(xì)胞毒學(xué)說，細(xì)胞內(nèi)酸中毒學(xué)說，神經(jīng)免疫機(jī)制等。目前認(rèn)為，VD的發(fā)生發(fā)展可能是一個(gè)多種致病因素、多個(gè)病理環(huán)節(jié)相互作用和累積的結(jié)果，病程是一個(gè)多靶點(diǎn)、多層次、多途徑的動(dòng)態(tài)演變過程，腦缺血/再灌注時(shí)，它們互為因果，形成惡性循環(huán)，最終導(dǎo)致神經(jīng)元壞死。但迄今為止，確切的VD發(fā)病機(jī)制尚不清楚。

目前大鼠是制備VD模型最常用的動(dòng)物。常用的模型主要有大腦中動(dòng)脈栓塞(MCAO)模型、多發(fā)性腦梗塞癡呆(MID)模型、四血管阻斷全腦缺血模型(4-VO)、雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎模型(2-VO)、腦缺血再灌注結(jié)合降壓模型、腦缺血再灌注結(jié)合失血模型、卒中傾向高血壓大鼠致癡呆模型等。不同的模型適用于不同病因誘發(fā)癡呆的研究。雖然動(dòng)物模型較多，但國(guó)際上還沒有一個(gè)公認(rèn)的理想的VD模型。本實(shí)驗(yàn)采用的是雙側(cè)頸總動(dòng)脈反復(fù)夾閉再通+硝普鈉降壓法[7-8](即腦缺血再灌注結(jié)合降壓模型)。該方法可導(dǎo)致進(jìn)行性的學(xué)習(xí)記憶功能障礙，較好較全面地模擬了人類的血管性癡呆的實(shí)際發(fā)病情況，又沒有明顯的肢體運(yùn)動(dòng)障礙，同時(shí)手術(shù)操作簡(jiǎn)單，無需開顱，術(shù)后不影響動(dòng)物進(jìn)食，動(dòng)物死亡率低，可長(zhǎng)期存活，可以較好的模擬人類的VD。大鼠腦缺血后，其腦血流的變化是一個(gè)先劇烈下降(造模后一周內(nèi))而后逐漸緩慢恢復(fù)的過程，造模1個(gè)月后，損傷組大鼠腦血流已經(jīng)達(dá)到對(duì)照組的2/3，8周后，損傷組大鼠腦血流只輕度低于對(duì)照組[9], 造模6個(gè)月后，損傷大鼠腦血流已經(jīng)與對(duì)照組無差別[10]。本實(shí)驗(yàn)觀察了大鼠腦缺血后7、15 d和1月時(shí)間點(diǎn)的變化，發(fā)現(xiàn)，在這些時(shí)間點(diǎn)大鼠的腦損傷呈進(jìn)行性變化，至于其腦血流的變化將在以后的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步觀察。

智能障礙是VD的主要癥狀之一，其中學(xué)習(xí)記憶能力減退在VD患者尤為顯著。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)[11](Morris water maze test，Rachard Morris，1981)是80年代初建立起來的判斷動(dòng)物空間學(xué)習(xí)記憶能力的重要實(shí)驗(yàn)方法，已被證實(shí)是一種在研究學(xué)習(xí)和記憶機(jī)理方面非常有用的工具，成為一種研究空間學(xué)習(xí)和記憶的標(biāo)準(zhǔn)模式。本實(shí)驗(yàn)通過檢測(cè)大鼠逃逸潛伏期的長(zhǎng)短，反映大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶功能。大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力越好，其逃避潛伏期越短；反之亦然。在本實(shí)驗(yàn)中，模型組大鼠與假手術(shù)組比較，逃逸潛伏期明顯延長(zhǎng)(P<0.01)，表明學(xué)習(xí)記憶能力較差，出現(xiàn)顯著的學(xué)習(xí)記憶功能障礙，說明造模成功。Morris水迷宮測(cè)試的平臺(tái)位置與大鼠位置、狀態(tài)無關(guān)，是一種異我為參照點(diǎn)的空間參考記憶，屬于陳述性記憶，而臨床健忘和癡呆的病人，正是陳述性記憶首先受損比較突出[12]。

腦慢性缺血后最明顯的神經(jīng)損傷是神經(jīng)細(xì)胞體和突觸連接的減少。本實(shí)驗(yàn)利用HE染色、尼氏染色和透射電鏡觀察了假手術(shù)組和模型組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在腦慢性缺血7、15 d和1月后，海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞層次減少，排列稀疏，神經(jīng)細(xì)胞腫脹，細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞核體積變小，深染，結(jié)構(gòu)不清，呈核固縮表現(xiàn)，脫失現(xiàn)象嚴(yán)重。許多錐體細(xì)胞胞漿內(nèi)尼氏體邊集、減少甚至消失，部分神經(jīng)元內(nèi)出現(xiàn)小空泡，神經(jīng)纖維排列紊亂，并且損傷程度隨時(shí)間延長(zhǎng)呈進(jìn)行性加重。突觸的完整性破壞，部分區(qū)域斷裂、模糊，前膜內(nèi)突觸小泡數(shù)量明顯減少，突觸數(shù)目減少。這與既往的文獻(xiàn)報(bào)道一致，雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎2、4、8～13周后分別有6%～29%、55%、67%的動(dòng)物的海馬區(qū)出現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量減少[9-10]。

VD主要與缺血性腦血管病有關(guān),長(zhǎng)期慢性腦缺血是VD形成的最重要因素之一。近年來，中藥對(duì)腦缺血或腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用研究較多，但并未實(shí)現(xiàn)臨床療效的根本突破。SF已在臨床用于保護(hù)多個(gè)器官組織的缺血再灌注損傷，并得到了較好的效果。文獻(xiàn)報(bào)道在腦缺血再灌注損傷模型中，SF能減少腦組織MDA水平和提高SOD和谷胱甘肽(GSH)表達(dá)，減輕腦組織神經(jīng)元變性程度，降低梗死面積[13]；SF還能提高Nrf2蛋白的表達(dá)，并調(diào)節(jié)下游蛋白血紅素加氧酶1和醌氧化還原酶1的表達(dá)，發(fā)揮抗氧化作用[14]。對(duì)于VD，SF下調(diào)凋亡相關(guān)基因 Bax 和 Caspase-3 的表達(dá)，上調(diào)抗凋亡基因 Bcl-2 水平，發(fā)揮抗海馬神經(jīng)元凋亡作用，改善 VaD 大鼠學(xué)習(xí)記憶能力[15-16]。

本實(shí)驗(yàn)觀察了SF對(duì)VD大鼠空間學(xué)習(xí)記憶功能的影響。SF藥物組大鼠逃逸潛伏期與相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的模型組相比明顯縮短(P﹤0.05)，但時(shí)間仍長(zhǎng)于假手術(shù)組(P﹤0.01)，說明SF能從一定程度上改善大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶功能。利用HE染色、尼氏染色和透射電鏡觀察模型組和SF治療組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：大鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞數(shù)較相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的模型組增多，錐體細(xì)胞水腫減輕，神經(jīng)纖維排列仍紊亂，胞漿中尼氏體逐漸增多，突觸的完整性得到改善，突觸前膜內(nèi)可見較多的小泡，損傷程度較模型組減輕。這些都體現(xiàn)了SF對(duì)癡呆后海馬CA1區(qū)的保護(hù)作用。海馬是大腦學(xué)習(xí)記憶的關(guān)鍵腦區(qū)之一，又是最易受缺血、衰老等因素影響的腦區(qū)之一。SF能改善大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶功能，減少腦缺血大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，同時(shí)還能增加海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中核糖體(尼氏體)的數(shù)量，增加細(xì)胞突觸的表達(dá)。核糖體是合成蛋白質(zhì)的場(chǎng)所，核糖體數(shù)量增加就預(yù)示著蛋白質(zhì)合成的增加，這將為該區(qū)腦組織的恢復(fù)提供足夠的能量供應(yīng)，加速海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞的復(fù)原，這也是SF發(fā)揮其腦保護(hù)作用、改善癡呆后學(xué)習(xí)記憶功能的分子機(jī)制之一。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SF能在一定程度上減少VD大鼠海馬組織病理?yè)p害和神經(jīng)元丟失，改善VD大鼠空間學(xué)習(xí)記憶功能，從而改善大鼠的癡呆癥狀。但是關(guān)于其進(jìn)一步具體機(jī)制的研究還需更深入的工作。眾所周知，突觸可塑性是學(xué)習(xí)記憶的神經(jīng)生物學(xué)基礎(chǔ)。腦缺血或再灌注后海馬突觸可塑性與學(xué)習(xí)記憶障礙的關(guān)系非常密切。所以下一步的工作計(jì)劃將是對(duì)其具體機(jī)制的研究，尤其是與突觸及突觸可塑性相關(guān)機(jī)制的研究將作為工作的重點(diǎn)內(nèi)容。