廖春英　袁建清　李志剛

摘要：目的 觀察七氟烷預(yù)處理對(duì)大鼠缺血性腦損傷的神經(jīng)保護(hù)作用。方法 將SD大鼠分為實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組和假手術(shù)組，七氟烷預(yù)處理實(shí)驗(yàn)組大鼠后，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組建立局灶性腦缺血再灌注模型（MCAO），24 h后各組進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)估、測(cè)量腦梗死面積，MCAO 3d后TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡。結(jié)果 實(shí)驗(yàn)組神經(jīng)功能缺損評(píng)分明顯低于對(duì)照組（P<0.05），實(shí)驗(yàn)組腦缺血損傷面積明顯小于對(duì)照組（P<0.05），MCAO 3d 后實(shí)驗(yàn)組TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞明顯少于對(duì)照組（P<0.05）。結(jié)論 七氟烷預(yù)處理對(duì)于缺血性腦損傷有神經(jīng)保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞：七氟烷；預(yù)處理；腦缺血；神經(jīng)保護(hù)

Abstract：Objective To investigate the neuroprotection of sevoflurane preconditioning for local cerebral ischemia. Methods 36 two-month old Sprague-Dawley male rats were randomly divided into sham group， experimental group and control group. Experimental group was exposed to sevoflurane for 30 min/day on 4 consecutive days and then underwent a 60 min middle cerebral arterial occlusion （MCAO）， while control group underwent MCAO only. At 24 h after reperfusion all the groups were investigated by neurological severity score （NSS） for neurological deficits， TTC staining for infarct percentage， TUNEL was performed to determine the percentage of cell death after MCAO 3d. Results The NSS score and infarct percentage in experimental group decreased significantly compared with those of control group at 24 h after reperfusion （P< 0.05）， The percentage of TUNEL positive cells of experimental group was reduced significantly compared to that of control group at 3 d after reperfusion （P< 0.05）. Conclusion Sevoflurane preconditioning provides neuroprotection against local cerebral ischemia.

Key words：Sevoflurane；Preconditioning；Cerebral Ischemia；Neuroprotection

缺血性腦損傷是一種致死率、致殘率極高的常見(jiàn)病，研究治療缺血性腦損傷的有效措施和藥物，是近年來(lái)醫(yī)學(xué)研究的一大熱點(diǎn)。近期有研究通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)和大鼠腦片電生理等離體實(shí)驗(yàn)表明[1]，一種臨床上常用的揮發(fā)性麻醉藥七氟烷（sevoflurane），在腦缺氧中具有神經(jīng)保護(hù)作用，本研究通過(guò)七氟烷預(yù)處理大鼠后建立局灶性腦缺血再灌注模型（MCAO），進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)估、測(cè)量腦梗死面積、TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡，在體研究來(lái)觀察七氟烷預(yù)處理腦缺血后神經(jīng)保護(hù)作用。

1 資料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 成年（月齡2個(gè)月）健康雄性SD大鼠36只，體質(zhì)量250～300 g，由贛南醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組和假手術(shù)組，每組各12只。

1.2七氟烷預(yù)處理 實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行1次/d七氟烷處理，將大鼠放入麻醉呼吸箱（Drager公司）中，保持清醒呼吸狀態(tài)，吸入1.0最小肺泡濃度（Minimum Alveolar Concentration， MAC）七氟烷（2.4%七氟烷/空氣）30 min，對(duì)照組和假手術(shù)組吸入100%空氣，連續(xù)4 d，最后1次預(yù)處理完畢后24 h，進(jìn)行MCAO模型制備。動(dòng)物吸入七氟烷期間的監(jiān)測(cè)生理指標(biāo)pH、PaCO2、PaO2和肛溫（℃），保證生理參數(shù)在正常范圍。

1.3 MCAO模型建立 應(yīng)用線栓法建立MCAO[2]模型，用6%水合氯醛麻醉（300 mg·kg-1體質(zhì)量），術(shù)中維持動(dòng)物直腸溫度（37±0.5）℃。分離并結(jié)扎右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈，注意避免刺激迷走神經(jīng)。于頸總動(dòng)脈近頸內(nèi)動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈分叉處剪一小口，插入一前端5 mm涂以硅膠的4-0絲線進(jìn)入頸內(nèi)動(dòng)脈，深度為距離頸總動(dòng)脈分叉處1.8～2.0 cm，1 h后拔出絲線進(jìn)行再灌注。假手術(shù)組除不插線栓外余步驟同上。術(shù)后在約20℃的空調(diào)環(huán)境下單籠飼養(yǎng)，自由進(jìn)水、進(jìn)食。

1.4神經(jīng)功能缺損評(píng)分 各組MCAO后24 h通過(guò)雙盲法（兩人評(píng)分，取二者平均值）進(jìn)行功能缺損評(píng)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[3]：0分，無(wú)神經(jīng)功能缺損；1分，不能完全伸直右側(cè)前爪；2分，向右側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分，向右側(cè)傾倒；4分，無(wú)自動(dòng)活動(dòng)伴有意識(shí)障礙；5分，死亡。

1.5氯化三苯基四氮唑（triphyl tetrazolium chloride，TTC）染色法測(cè)定腦梗死面積 各組MCAO后24 h隨機(jī)取6只斷頭取腦，自視交叉前4 mm開(kāi)始連續(xù)冠狀面冰凍切片（2 mm厚），共取6片，置于2%TTC（Sigma公司）染色中，37℃避光孵育20 min，存活組織深紅，壞死組織呈白色，數(shù)碼相機(jī)（DSC-T300，SONY）將每張組織照相，輸入計(jì)算機(jī)，用圖像處理軟件（Image Tool）進(jìn)行不顯色部分面積分析，并計(jì)算梗死面積[4- 5]：梗死面積%=[（∑缺血對(duì)側(cè)面積×2mm-∑缺血同側(cè)未梗死面積×2mm）/∑對(duì)側(cè)面積×2mm]×100%。

1.6 TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 各組MCAO后3 d 隨機(jī)取6只斷頭取腦，-20℃恒冷切片機(jī)自視交叉處開(kāi)始，行10 μm厚連續(xù)冠狀切片。TUNEL染色嚴(yán)格按照TUNEL試劑盒（美國(guó)Milipore公司）說(shuō)明書(shū)步驟操作。Olympus BX51熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡情況，每張片子隨機(jī)取5個(gè)視野，同一曝光條件下照相，并計(jì)算TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞百分比。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所得數(shù)據(jù)用（x±s）差表示，采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1神經(jīng)功能缺損程度評(píng)估 建模前各組大鼠評(píng)分為0分，建模后24 h評(píng)分：假手術(shù)組評(píng)分無(wú)變化，為0分，實(shí)驗(yàn)組評(píng)分為（1.5±0.7）分，對(duì)照組評(píng)分為（3.5±0.7）分，實(shí)驗(yàn)組評(píng)分明顯低于對(duì)照組（P<0.05）。

2.2各組大鼠MCAO后腦梗死面積的比較 假手術(shù)組無(wú)明顯腦梗死發(fā)生，實(shí)驗(yàn)組腦梗死的面積比率為（16.58±5.88）%，較對(duì)照組腦梗死的面積比率（31.98±10.14）%明顯減少（P<0.05）。

2.3七氟烷預(yù)處理對(duì)腦缺血后細(xì)胞凋亡的影響 假手術(shù)組可見(jiàn)極少數(shù)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞（1.27±0.25）%，MCAO 3d 后實(shí)驗(yàn)組TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞（8.25±1.40）%明顯少于對(duì)照組（31.45±2.42）%（P<0.05）。

3 討論

缺血性腦損傷是一種致死率、致殘率極高的多發(fā)病、常見(jiàn)病，且易再發(fā)和復(fù)發(fā)，嚴(yán)重危害人類(lèi)身心健康。研究治療缺血性腦損傷的有效措施和藥物，是近年來(lái)醫(yī)學(xué)研究的一大熱點(diǎn)[6]。七氟烷（sevoflurane）是一種臨床上常用的揮發(fā)性麻醉藥，可增加腦血流量，降低腦的氧代謝率[7]，近期有研究通過(guò)離體細(xì)胞培養(yǎng)和大鼠腦片電生理實(shí)驗(yàn)表明，這種吸入性麻醉藥七氟烷，在腦缺血中具有神經(jīng)保護(hù)作用[1，8-10]。

本研究通過(guò)七氟烷預(yù)處理大鼠后建立MCAO再灌注模型，進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)估、測(cè)量腦梗死面積，TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡，結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)組神經(jīng)功能缺損評(píng)分明顯低于對(duì)照組（P<0.05）；實(shí)驗(yàn)組腦梗死的面積比率較對(duì)照組明顯減少（P<0.05），MCAO 3d 后實(shí)驗(yàn)組TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞明顯少于對(duì)照組（P<0.05）。在體研究證實(shí)了七氟烷預(yù)處理腦缺血后的神經(jīng)保護(hù)作用。但其作用的具體機(jī)制尚不清楚，可能對(duì)腦血流量、腦代謝、炎癥因子及其相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)產(chǎn)生一定影響[11]。有研究認(rèn)為七氟烷可激活KATP，抑制缺血期神經(jīng)元的鈣離子和興奮性氨基酸濃度的升高[11]；減少NF-kB入核，降低其轉(zhuǎn)錄調(diào)控的炎癥因子如COX-2、iNOS、TNFa、IL-1、IL-6等來(lái)抑制炎癥反應(yīng)[12]；抑制腦缺血后的細(xì)胞凋亡[13]，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

最近，國(guó)外通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)離體研究表明，雙孔鉀通道TREK-1參與了七氟烷預(yù)處理在腦缺血中的神經(jīng)保護(hù)作用。TREK-1是一種新型的雙孔鉀離子通道亞型，可被機(jī)械牽張、多聚不飽和脂肪酸（如花生四烯酸、AA）、溶血磷脂和一些揮發(fā)性麻醉藥如氟烷、七氟烷、乙醚、氙氣等激活[14]。TREK-1廣泛表達(dá)于大鼠海馬、皮層，其活性可影響腦缺血時(shí)星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖活化以及平衡緩沖功能[15-16]。 TREK-1通道開(kāi)放后，表達(dá)具有線性I-V關(guān)系的背景鉀電流，在細(xì)胞膜靜息電位的形成和膜電位的復(fù)極化中起著重要作用，能穩(wěn)定膜電位，調(diào)節(jié)細(xì)胞的興奮性，使細(xì)胞膜超極化，減少鈣離子內(nèi)流，降低谷氨酸的轉(zhuǎn)運(yùn)和興奮性細(xì)胞毒性[14]。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)七氟烷預(yù)處理大鼠后建立MCAO再灌注模型，進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)估、測(cè)量腦梗死面積，TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡，在體研究證實(shí)了七氟烷預(yù)處理腦缺血后的保護(hù)作用，為進(jìn)一步研究其神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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編輯/金昊天