王 偉，程 亮，朱海霞，郭青云

(1. 青海大學(xué)，西寧 810016; 2. 青海省農(nóng)林科學(xué)院，西寧 810016；3.青海省農(nóng)業(yè)有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西寧 810016；4.農(nóng)業(yè)部西寧作物有害生物科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，西寧 810016)

野燕麥(AvenafatuaL.)為禾本科燕麥屬小麥田伴生性雜草，一年生或越年生，屬田間惡性雜草，在世界各地農(nóng)田均有分布。其分蘗力強(qiáng)、適應(yīng)能力強(qiáng)、繁殖率高，對(duì)田間農(nóng)作物構(gòu)成主要威脅[1]。目前，中國(guó)16個(gè)省(區(qū))約160萬(wàn)hm2農(nóng)田遭受不同程度野燕麥的侵害，其中冬麥區(qū)危害率達(dá)15.6%，春麥區(qū)危害率達(dá)25.3%，每年導(dǎo)致糧食減產(chǎn)約17.5億kg[2]。目前，對(duì)野燕麥的防除主要采取小麥播前選種、人工拔除以及采用化學(xué)防除等方法，但小麥播前選種與人工拔除不僅成本昂貴，而且防除效果也不理想，因此大田噴施化學(xué)除草劑就成為防除野燕麥的首要措施[3]，但采用化學(xué)除草劑防除存在諸多弊端，如環(huán)境污染、抗藥性等一系列問題。因此，開展新型除草劑的研究，尤其是微生物源除草劑的研究，對(duì)發(fā)展生態(tài)農(nóng)業(yè)、防除田間雜草具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

利用自然界生物中具有生物活性的代謝產(chǎn)物開發(fā)成新的生物源除草劑是雜草防除的一個(gè)重要途徑和未來(lái)發(fā)展方向。自然界中的微生物(包括真菌、細(xì)菌、病毒)是開發(fā)成為生物除草劑的重要來(lái)源，其中應(yīng)用最廣的為真菌。目前，有超過(guò)40個(gè)屬的真菌已經(jīng)或者正在被考慮開發(fā)成為生物源除草劑[4]。近年來(lái)，隨著生防真菌的發(fā)掘和研究，尋找新的具有除草活性的真菌難度越來(lái)越大，因此從鹽堿地等極端環(huán)境中分離具有優(yōu)良除草活性的特殊菌株逐漸成為研究的熱點(diǎn)[5]。由于鹽堿地具有高的鹽堿、高滲透壓的特殊環(huán)境，其中蘊(yùn)含著特殊的微生物資源，目前所利用的特殊環(huán)境微生物資源僅是自然界存在微生物資源的一小部分[6]。本研究從青海省尖扎縣坎布拉鎮(zhèn)鹽堿土樣中篩選得到除草活性較高的NO6菌株，對(duì)該菌株進(jìn)行種屬鑒定，并對(duì)其次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行初步研究，對(duì)今后農(nóng)田雜草的防除和開發(fā)鹽堿地生態(tài)環(huán)境土壤微生物資源具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材 料

菌株是從青海省尖扎縣坎布拉鎮(zhèn)海拔2 800 m鹽堿土壤中篩選得到的真菌菌株。雜草野燕麥(Avenafatua)種子采自青海省農(nóng)林科學(xué)院植保所試驗(yàn)田，由青海省農(nóng)業(yè)有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要儀器試劑

臺(tái)式冷凍離心機(jī)(Sigma公司)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海市愛朗儀器有限公司)、生化培養(yǎng)箱(寧波江南儀器廠)、PCR儀(Bio-Rad公司)、顯微鏡(Olympus公司)、高效液相色譜儀(江蘇漢邦科技有限公司)。石油醚、正丁醇、乙酸乙酯、葡萄糖、氯化鈉(分析純，天津大茂化學(xué)試劑廠)、瓊脂粉(美國(guó)Sigma公司)、析硅膠(200～300目，青島海洋化工有限公司)、薄層層析硅膠板(青島海洋化工有限公司)。HPLC甲醇(德國(guó)默克公司)。馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)。

1.3 菌株的分離、純化

參照方中達(dá)[7]的方法。稱取土壤樣品10 g放入盛有90 mL滅菌超純水的三角瓶中，振蕩20 min，使土壤與水充分混合。用無(wú)菌水對(duì)混合液進(jìn)行梯度稀釋至10-2、10-3、10-4等不同體積分?jǐn)?shù)稀釋液。取100 μL稀釋液涂布于PDA固體培養(yǎng)基表面，每個(gè)體積分?jǐn)?shù)3個(gè)重復(fù)，28 ℃恒溫箱中培養(yǎng)3～5 d，待菌落長(zhǎng)出后，從菌落邊緣挑取少量菌絲，進(jìn)行再次純化后保存于PDA試管斜面中，備用。

1.4 菌株發(fā)酵濾液及粗提物的制備

分離獲得的菌株接入PDA液體培養(yǎng)基中，28 ℃、200 r/min搖床震蕩培養(yǎng)5～7 d，將發(fā)酵液8 000 r/min離心5 min，棄沉淀，取上清過(guò)0.22 μm濾膜去除菌體，得到發(fā)酵濾液。NO6菌株發(fā)酵濾液用等體積石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取2～3次，至萃取液變?yōu)闊o(wú)色，經(jīng)減壓濃縮后分別得到石油醚提取物、乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物。

1.5 除草活性測(cè)定

除草活性測(cè)定采用培養(yǎng)皿分析法[8]。分別測(cè)定菌株發(fā)酵濾液和各提取物對(duì)野燕麥除草活性。選擇飽滿完整的雜草種子，用10 g/L次氯酸鈉溶液進(jìn)行表明消毒，無(wú)菌水沖洗3次，在12孔板的孔中鋪上圓濾紙片，加入待測(cè)發(fā)酵濾液1 mL，每孔置10粒種子進(jìn)行除草活性測(cè)定。每處理重復(fù)3次，另設(shè)清水作為空白對(duì)照，28 ℃智能光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)，處理3～5 d后測(cè)定根長(zhǎng)和芽長(zhǎng)，計(jì)算抑制率。按如下公式計(jì)算抑制率：抑制率=[(空白對(duì)照組的根(芽)長(zhǎng)-處理組的根(芽)長(zhǎng))/空白對(duì)照組的根(芽)長(zhǎng)]×100%。

將粗提物用二甲基亞砜溶解，配制成100 μg/mL的藥液。在12孔板的孔中鋪上圓濾紙片，加入待測(cè)藥液1.0 mL，待溶劑揮發(fā)干后，加入1.0 mL蒸餾水，選擇10粒成熟度一致的露白的雜草種子置孔中，保鮮膜封好，于28 ℃智能光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每處理重復(fù)3次，測(cè)定根長(zhǎng)和芽長(zhǎng)，計(jì)算抑制率。

1.6 除草活性物質(zhì)分離純化

經(jīng)大批發(fā)酵，獲得菌株NO6發(fā)酵液共36 L，發(fā)酵液經(jīng)5 000 r/min冷凍離心30 min，收集上清液部分。加入等體積的乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯相40 ℃減壓濃縮，再用甲醇浸提2遍，過(guò)濾除去不溶物，50 ℃減壓濃縮除去甲醇得浸膏31 g。粗提浸膏首先經(jīng)過(guò)正相硅膠柱層析，二氯甲烷/甲醇(體積比為25∶1、20∶1、15∶1、10∶1和1∶1)梯度洗脫，每50 mL洗脫液收集為一瓶，TLC檢測(cè)洗脫進(jìn)程，同時(shí)進(jìn)行除草活性檢測(cè)，最終合并活性餾分。利用制備型高效液相色譜儀(20 mm×250 mm，10 μm)在流動(dòng)相為φ=48%甲醇、檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm、流速為3 mL/min、進(jìn)樣量為100 μL的色譜條件下，對(duì)上述經(jīng)過(guò)硅膠柱層析所得的活性餾分進(jìn)行分析，并檢測(cè)其除草活性。

1.7 菌株的鑒定

1.7.1 形態(tài)學(xué)鑒定 菌株形態(tài)學(xué)鑒定參考《真菌鑒定手冊(cè)》[9]，根據(jù)菌落的生長(zhǎng)特性、顏色、菌絲的形態(tài)特征、孢子的形態(tài)進(jìn)行鑒定。

1.7.2 分子鑒定 真菌基因組DNA的提取使用Ezup柱式SK8259試劑盒[生工生物工程(上海)股份有限公司]。采用真菌通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)進(jìn)行ITS序列擴(kuò)增。電泳回收產(chǎn)物由生工生物工程(上海)股份有限公司純化并測(cè)序。利用Blastn(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)與GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行比對(duì)，獲得同源性高的菌株ITS序列，利用Clustal W 按最高同源性的原則進(jìn)行排序，之后利用MEGA 5.05軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定菌株分類地位。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

利用SPSS 20.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析(Duncan多重比較分析，P=0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株發(fā)酵液及粗提物的除草活性測(cè)定

2.1.1 菌株發(fā)酵液對(duì)燕麥種子萌發(fā)的抑制效果 采用濃度梯度稀釋法，從青海尖扎縣坎布拉鎮(zhèn)土壤中共分離得到9株真菌菌株(表1)。采用不同菌株發(fā)酵濾液對(duì)野燕麥種子萌發(fā)的抑制作用進(jìn)行測(cè)定。試驗(yàn)結(jié)果表明：菌株NO6發(fā)酵濾液對(duì)野燕麥的胚根和胚芽萌發(fā)均有很強(qiáng)的抑制作用，抑制率分別達(dá)到93.10%和91.20%，菌株NO8-5和NO2-4發(fā)酵濾液對(duì)野燕麥種子的萌發(fā)抑制作用次之；菌株F8、1和NO9-1發(fā)酵濾液對(duì)野燕麥的胚芽和胚根抑制率低于60%；F10和G14發(fā)酵濾液對(duì)燕麥種子萌發(fā)抑制率均較低，對(duì)燕麥胚芽抑制率分別為-22.98%、-22.01%，胚根抑制率均低于30%，表明其對(duì)燕麥的胚芽生長(zhǎng)有一定促生作用。

表1 不同菌株發(fā)酵液抑制野燕麥種子萌發(fā)效果Table 1 The germination effect ofAvenafatua L. seeds inhibited by different biocontrol strains

注：數(shù)值為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”，同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著，下同。

Note:Data were presented as “mean±SE”, data with different lowercase letters within a column indicated significant difference at 0.05 level,the same below.

2.1.2 粗提物對(duì)燕麥種子萌發(fā)的抑制效果 綜合考慮，選用對(duì)野燕麥胚根和胚芽抑制作用顯著的真菌菌株NO6，制備提取該菌株的粗提物，通過(guò)培養(yǎng)皿分析法測(cè)其不同粗提物處理對(duì)野燕麥胚根和胚芽的抑制作用。由表2可知，在100 μg/mL 的質(zhì)量濃度條件下，菌株NO6各粗提物對(duì)野燕麥胚根和胚芽的抑制作用存在顯著差異。其中乙酸乙酯粗提物對(duì)野燕麥胚芽抑制率達(dá)到97.09%，對(duì)胚根的抑制率為96.08%，要顯著高于正丁醇和石油醚粗提物的抑制作用，正丁醇和石油醚粗提物的除草抑制活性相當(dāng)，達(dá)到90%以上，但這兩者處理之間沒有顯著差異。

表2 培養(yǎng)皿分析法測(cè)定菌株NO6對(duì)野燕麥的防除效果Table 2 The control effect of fungi strain NO6 on Avena fatuaby Petri dish analysis

2.2 除草活性物質(zhì)分離純化

乙酸乙酯萃取得到的粗提物，按極性由弱到強(qiáng)的溶劑系統(tǒng)進(jìn)行梯度洗脫后，共收集500個(gè)餾分，經(jīng)過(guò)TLC檢測(cè)合并得到16個(gè)餾分(編號(hào)為Fr1～Fr16)，各餾分旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干后的甲醇溶解液，經(jīng)培養(yǎng)皿分析法進(jìn)行除草活性檢測(cè)，結(jié)果顯示16個(gè)合并餾分具有不同程度的除草活性(圖1)，表現(xiàn)為胚芽和胚根受到不同程度的抑制，其中以餾分Fr4除草活性最強(qiáng)，餾分Fr3和Fr5的對(duì)野燕麥有弱的抑制生長(zhǎng)作用，初步確定除草活性成分主要分布在Fr3～Fr5號(hào)餾分中，同時(shí)對(duì)具有除草活性的餾分Fr3～Fr5進(jìn)行TLC檢測(cè)(圖2)，確定合適展開劑的比例，為下一次硅膠柱層析提供合適的洗脫劑比例。

左邊A1～A4分別代表Fr1～Fr4;B1～B4代表Fr5～Fr8;C1～C4代表Fr9～Fr12;右邊A1～A4分別代表Fr13～Fr16;B1～B4為空白對(duì)照。

A1-A4 represent Fr1-Fr4; B1-B4 represent Fr5-Fr8 and C1-C4 represent Fr9-Fr12 on the left，respectively.A1-A4 represents Fr13-Fr16 and B1-B4 represents blank control.

圖1菌株NO6發(fā)酵液正相硅膠柱分離的不同餾分除草活性檢測(cè)
Fig.1DifferentfractionherbicidalactivitytestseparatedbynormalphasesilicagelcolumnofstrainNO6fermentationliquid

圖2 菌株 NO6發(fā)酵液正相硅膠柱分離的除草活性餾分的TLC檢測(cè)Fig.2 TLC assays of different herbicidal fractions of strain NO6 broth after normal phase silica gel column purification

將硅膠柱層析中得到的具有較強(qiáng)除草活性組分Fr4轉(zhuǎn)溶于甲醇進(jìn)行HPLC分析。圖3為餾分Fr4的HPLC分析圖，可見該組分包括3個(gè)組分，其保留時(shí)間分別為13.852 min、29.718 min、66.868 min，分別標(biāo)記為組分1、組分2和組分3，分別將這3個(gè)組分收集制備，培養(yǎng)皿分析結(jié)果顯示(圖4)，組分3有明顯的除草活性，其對(duì)野燕麥胚芽、胚根的抑制率分別達(dá)到87.74%和93.17%。組分1和甲醇洗脫組分除草活性較低。需要指出的是，組分2對(duì)野燕麥胚芽、胚根的抑制率分別為-36.13%和-99.08%，這表明其對(duì)野燕麥種子萌發(fā)有較強(qiáng)的促生作用(表3)。

圖3 餾分4 的HPLC峰譜圖Fig.3 HPLC results of herbicidal components Fr4

2.3 菌株的鑒定

2.3.1 形態(tài)學(xué)鑒定 菌株NO6的菌落呈圓形，絨狀、叢卷毛至粉狀，培養(yǎng)初期多呈白色，后期變成淡黃色，偶成淡紅色，背面無(wú)色或淡黃色至粉紅色。菌絲生長(zhǎng)緩慢，但產(chǎn)孢速度較快。分生孢子梗多不分枝，垂直著生于菌絲分枝或短的小分支上。分生孢子球形至近球形，或呈卵圓型，無(wú)色透明，壁薄(圖5)。

A1,A2,A3分別代表峰1，2和3餾分，A4代表甲醇洗脫組分，B1～B4代表空白對(duì)照 A1, A2, and A3 represent peak 1, 2 and 3 components, respectively. A4 represent component washed down by methanol. B1-B4 represents CK

圖4 餾分4反相HPLC分離的不同組分除草活性檢測(cè)Fig.4 Herbicidal activities of different components about fraction Fr4 after reverse HPLC purification

A.菌落 Colony；B.分生孢子梗 Conidiophore；C.分生孢子 Conidia

2.3.2 分子鑒定 菌株NO6經(jīng)rDNA-ITS序列通用真菌引物PCR擴(kuò)增后，獲得552 bp大小的序列片段(圖6)，將序列測(cè)定結(jié)果上傳至GenBank，其序列登錄號(hào)為MH091336。利用GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中BLASTn軟件對(duì)該序列和GenBank中已登陸的rDNA-ITS序列進(jìn)行同源性比較，該菌與球孢白僵菌同源性均在99%以上，調(diào)取其中與之同源性較高的菌株rDNA-ITS序列，利用軟件Clustal W進(jìn)行多重匹配排列分析，采用鄰近法構(gòu)建菌株系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)合菌株形態(tài)，確立該菌株的種屬關(guān)系。由系統(tǒng)發(fā)育樹(圖7)可以看出，菌株NO6與Beauveria屬內(nèi)各種的一致性均在99.0%以上，系統(tǒng)發(fā)育分析歸于同一分支，并結(jié)合其形態(tài)學(xué)特征，確定NO6菌株均為球孢白僵菌(Beauveriabassiana)成員。

圖6 NO6菌株的PCR產(chǎn)物的10 g/L瓊脂糖凝膠電泳Fig.6 Electrophoresis of 10 g/L agarose gel of PCR production for strain NO6

圖7 基于ITS rDNA序列Blast結(jié)果構(gòu)建的菌株NO6的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.7 Phylogenetic tree of fungi strain NO6 based on Blast results of ITS rDNA sequence

3 結(jié)論與討論

微生物作為一類重要的天然生物資源，特別是近些年來(lái)，從特殊生境微生物中尋找具有生物活性代謝產(chǎn)物成為一個(gè)熱點(diǎn)研究領(lǐng)域，尤其在真菌生物活性物質(zhì)研究和開發(fā)利用領(lǐng)域，人們陸續(xù)從中分離和開發(fā)出新一代抗生素、抗病毒抗腫瘤藥物和生物農(nóng)藥產(chǎn)品等。這些物質(zhì)在醫(yī)療保健、生物農(nóng)藥、生物肥料、綠色飼料及環(huán)境保護(hù)等領(lǐng)域發(fā)揮著舉足輕重的作用，日益受到研究者的青睞和重視。本試驗(yàn)從青海省尖扎縣坎布拉鎮(zhèn)鹽堿土壤分離出具有除草活性的NO6真菌菌株，經(jīng)過(guò)菌落、菌絲和孢子形態(tài)特征以及rDNA-ITS序列鑒定，初步確定該菌株為球孢白僵菌Beauveriabassiana。球孢白僵菌(Beauveriabassiana)隸屬于白僵菌屬，該屬真菌分布廣泛，是世界最常見的土壤蟲生真菌[10]，也是植物內(nèi)生真菌[11]，對(duì)多種植物害蟲、病原菌有很好的抑制作用，可以提高寄主植物的抗病蟲能力并促進(jìn)植物生長(zhǎng)，具有雙重生防活性和促生作用[12-13]。本試驗(yàn)分離得到的具有除草活性的菌株NO6，是鹽堿土壤微生物資源真菌的首次報(bào)道。

微生物能夠產(chǎn)生種類繁多、結(jié)構(gòu)新穎、活性多樣和作用靶標(biāo)特異的次級(jí)代謝產(chǎn)物，已成為發(fā)現(xiàn)新藥先導(dǎo)化合物的重要來(lái)源。近年來(lái)，隨著對(duì)微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物的深入研究，人們?cè)诎l(fā)掘大量有價(jià)值的活性天然產(chǎn)物的同時(shí)，對(duì)于微生物資源的重復(fù)篩選工作日益突現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)具新穎結(jié)構(gòu)的活性物質(zhì)的機(jī)率逐漸下降。針對(duì)這一問題，不斷拓展微生物藥物新資源，從特殊生境中尋求結(jié)構(gòu)新穎活性物質(zhì)就成為研究者關(guān)注的熱點(diǎn)[14-15]。關(guān)于特殊環(huán)境微生物次生代謝產(chǎn)物中具有抗菌、抗腫瘤研究報(bào)道的較多[16-17]，而對(duì)具有除草活性的代謝產(chǎn)物鮮有報(bào)道，靳麗萍等[18]報(bào)道從黃蜻幼蟲腸道中分離出擬盾殼霉屬真菌，采用色譜分離技術(shù)從乙酸乙酯粗提物中分離出除草活性成分，在質(zhì)量濃度為100 μg/mL，對(duì)稗草和反枝莧幼根生長(zhǎng)有明顯的抑制作用，抑制率分別為94.1%和79.0%。周瑜等[19]從青海高原分離的鏈霉菌，其發(fā)酵液經(jīng)溶劑萃取、層析和色譜技術(shù)分離純化出除草活性物質(zhì)，該物質(zhì)在低質(zhì)量濃度下可使雜草黃化，高質(zhì)量濃度時(shí)可抑制雜草種子發(fā)芽。薛章榮等[20]在東部海島中分離鏈霉菌，其發(fā)酵液中含有除草活性物質(zhì)，該物質(zhì)在75 g/hm2劑量下，對(duì)闊葉雜草千金子、牛筋草、反枝莧和鱧腸的抑制率高達(dá)96.0%～100.0%。

針對(duì)微生物的代謝產(chǎn)物的分離和純化，可以通過(guò)柱層析法[21]分離發(fā)酵產(chǎn)物的化學(xué)成分，現(xiàn)主要采用的是薄層層析[22]、凝膠過(guò)濾色譜法[23]和液相色譜等。本試驗(yàn)采用硅膠柱層析和半制備HPLC的方法對(duì)菌株NO6除草物質(zhì)進(jìn)行分離純化，初步得到3個(gè)活性組分，其中第3組分的除草活性明顯強(qiáng)于其他組分，并明確各組分的保留時(shí)間及HPLC分析條件，為進(jìn)一步分析除草活性組分的化學(xué)結(jié)構(gòu)奠定基礎(chǔ)。

本研究從青海尖扎縣坎布拉鹽堿土中共分離得到9株生防菌株，通過(guò)培養(yǎng)皿分析初篩，以真菌菌株NO6發(fā)酵液表現(xiàn)出相對(duì)較高抑制效果。通過(guò)對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行溶媒萃取，發(fā)現(xiàn)菌株NO6乙酸乙酯粗提物表現(xiàn)出相對(duì)較高的除草活性。采用多種色譜分離技術(shù)，對(duì)NO6菌株代謝產(chǎn)物進(jìn)行分離獲得1個(gè)除草活性組分。上述研究結(jié)果提示鹽堿土壤真菌代謝產(chǎn)物具有很好的除草生物活性，可能具有以往農(nóng)用藥劑不同的作用靶點(diǎn)，是開發(fā)新穎生物除草劑的重要資源之一，值得進(jìn)一步研究。