石雪峰，解友邦，茍三玉，蔣慧，顧玉海

(青海省人民醫(yī)院，西寧810007)

高原低壓低氧環(huán)境存在于中國約四分之一的地區(qū)，人類由低海拔地區(qū)進(jìn)入高原，容易因環(huán)境氧分壓變化造成組織缺氧從而引起急性或慢性高原病，嚴(yán)重影響人類健康。低氧及低氧/復(fù)氧可以導(dǎo)致內(nèi)源性活性氧簇(ROS)爆發(fā)性產(chǎn)生，隨之ROS再介導(dǎo)全身組織細(xì)胞反應(yīng)，引起一系列的氧化應(yīng)激反應(yīng)。機(jī)體內(nèi)氧自由基主要包括氧化應(yīng)激所產(chǎn)生的氧簇不完全反應(yīng)產(chǎn)物烷氧自由基(RO·)、超氧陰離子及羥自由基(-OH)等，易失去電子(氧化)或獲得電子(還原)，是一類化學(xué)性質(zhì)很活潑的ROS。生理情況下，ROS的生成與抗氧化體系清除處于動(dòng)態(tài)平衡，ROS在機(jī)體中發(fā)揮著有益作用，如清除衰老細(xì)胞、殺滅病原微生物等。一旦平衡被打破，ROS生成增多，氧化應(yīng)激損傷隨即啟動(dòng)，攻擊DNA、脂質(zhì)及蛋白質(zhì)等造成機(jī)體損傷?；钚匝趸瘜W(xué)性質(zhì)活躍且形狀不穩(wěn)定，一般實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用氧化反應(yīng)的產(chǎn)物間接反映氧化應(yīng)激反應(yīng)水平，常見的標(biāo)志物有丙二醛(MDA)、超氧化歧化酶(SOD)[1]。肺組織作為機(jī)體的核心代謝器官，肺泡氧分壓含量位居其他臟器之首，且富含線粒體，決定了其成為ROS攻擊的主要器官。2014年11月～2018年2月，本研究通過模擬高海拔低氧環(huán)境觀察大鼠血漿及肺組織中SOD活力、MDA含量及肺組織AngⅡ mRNA的表達(dá)變化，并探討了三者之間的相關(guān)性，為探討急性肺損傷的機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、試劑及儀器 6周齡左右的清潔級(jí)雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量110～120 g，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周；SOD、MDA檢測(cè)試劑盒購自南京建成生物公司，TRIzol購自美國Invitrogen公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本TAKARA公司；低壓氧艙室、-80 ℃低溫冰箱、常溫高速離心機(jī)、半自動(dòng)生化分析儀、數(shù)顯恒溫水浴鍋、全自動(dòng)血常規(guī)分析儀、7500 FAST QPCR儀。

1.2 分組及待測(cè)血漿、肺組織的留取 56只Wistar大鼠中，低海拔組(蘭州，海拔1 500 m)8只、中海拔組(西寧,海拔2 260 m) 8只及高海拔組40只(低壓氧艙，模擬海拔5 000 m)。其中低海拔組在蘭州采購當(dāng)日取血樣本及肺組織樣本，中海拔組在西寧采購后飼養(yǎng)30 d取血樣本及肺組織樣本，高海拔組置于低壓氧艙模擬海拔5 000 m，分別飼養(yǎng)1、3、7、15、30 d取肺組織樣本，其中飼養(yǎng)30 d時(shí)同時(shí)取血樣本。均留取肺組織上清和血漿在-80 ℃冰箱內(nèi)保存，統(tǒng)一在西寧檢測(cè)，各組間體質(zhì)量比較，P均>0.05。肺組織上清的留?。簩⒎谓M織清洗、稱重、研磨后收集于Eppendorf中，5 000 r/min離心5 min，留取上清。血漿抽?。撼槿∠虑混o脈血約5 mL置于抗凝管內(nèi)，3 000 r/min離心10 min，分離血漿，置于Eppendorf管內(nèi),均儲(chǔ)存于-80 ℃冰箱內(nèi)。

1.3 血漿及肺組織SOD活力、MDA含量的檢測(cè) 采用水溶性四氮唑(WST-1)法檢測(cè)各組血漿SOD活力，低海拔組及高海拔組飼養(yǎng)1、3、7、15、30 d大鼠肺組織SOD活力。采用硫代巴比妥(TBA)比色法檢測(cè)各組血漿MDA含量，低海拔組及高海拔組飼養(yǎng)1、3、7、15、30 d大鼠肺組織MDA含量。

1.4 肺組織AngⅡ mRNA表達(dá)檢測(cè) 采用qRT-PCR法。液氮研磨肺組織后加入TRIzol，按照產(chǎn)品說明書提取組織總RNA，并通過紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的純度及濃度。按照日本TAKARA公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，以逆轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板，以β-actin為內(nèi)參，用SYBR法檢測(cè)AngⅡ mRNA的表達(dá)，AngⅡ引物：上游：5′-GGGAAGGGAATGAGGCTTAC-3′;下游：5′-GGTTGGCTGATGCTGCTTAT-3′;β-actin引物:上游：5′-GCGGGAAATCGTGCGTGAC-3′;下游：5′-GGAAGGAAGGCTGGAAGAG-3′，循環(huán)數(shù)為40個(gè)循環(huán)，以2-△△CT法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 不同海拔組大鼠血漿SOD活力、MDA含量比較 低、中、高海拔組血漿SOD活力分別為(19.98±1.57)、(19.06±1.24)、(10.34±1.19)U/mL，MDA含量分別為(2.28±0.68)、(2.76±0.34)、(10.34±1.19)nmol/mL，血漿SOD活力比較：低海拔組>中海拔組>高海拔組(P均<0.01)；血漿MDA含量比較，低海拔組<中海拔組<高海拔組(P均<0.01)。

2.2 不同海拔組大鼠肺組織MDA含量、SOD活力、AngⅡ mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 低海拔組，高海拔組飼養(yǎng)1、3、7、15、30 d血漿SOD活力分別為(439.85±33.80)、(554.07±24.59)、(486.78±18.78)、(403.71±16.57)、(341.98±17.89)、(295.98±11.08)U/mg prot，MDA含量分別為(1.81±0.24)、(2.39±0.35)、(2.99±0.34)、(3.44±0.30)、(4.03±0.88)、(4.66±0.74)nmol/mg prot，AngⅡ mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.39±0.12、0.51±0.27、0.98±0.18、1.21±0.38、1.54±0.24、1.89±0.87。高海拔組飼養(yǎng)1 d肺組織SOD活力及MDA含量高于低海拔組(P均<0.05)；SOD活力在高海拔組飼養(yǎng)1 d升高，隨高海拔暴露時(shí)間的延長其活力呈逐漸降低趨勢(shì)(P均<0.05)；與高海拔組飼養(yǎng)1 d相比，飼養(yǎng)3、7、15、30 d MDA含量升高，且隨高海拔暴露時(shí)間延長，MDA含量呈逐漸升高趨勢(shì)(P均<0.05)；與低海拔組相比，高海拔組飼養(yǎng)3、7、15、30 d AngⅡ mRNA表達(dá)升高(P均<0.05)，且AngⅡ mRNA的表達(dá)隨暴露于高海拔環(huán)境時(shí)間的延長呈逐漸升高趨勢(shì)(P均<0.05)。

2.3 高海拔組大鼠肺組織AngⅡ mRNA與MDA、SOD的相關(guān)性 高海拔組大鼠肺組織AngⅡ mRNA表達(dá)與SOD活力呈負(fù)相關(guān)(r=-0.729，P<0.01)，與MDA含量呈正相關(guān)(r=0.952，P<0.01)。

3 討論

高海拔低壓低氧環(huán)境存在于中國約四分之一的地區(qū)，人類由低海拔地區(qū)進(jìn)入高原，容易因環(huán)境氧分壓變化造成組織缺氧從而引起急性或慢性高原病，嚴(yán)重影響人類健康。目前關(guān)于高海拔低氧環(huán)境所致急慢性高原病發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚，推測(cè)可能與炎性反應(yīng)、肺內(nèi)血管收縮、內(nèi)皮功能紊亂、交感神經(jīng)的激活等機(jī)制有關(guān)。本研究旨在通過研究高海拔環(huán)境下大鼠血漿及肺組織氧化應(yīng)激反應(yīng)及肺組織AngⅡ mRNA表達(dá)的變化，探索高海拔環(huán)境對(duì)肺組織的損傷機(jī)制。

氧化應(yīng)激是指機(jī)體受到多種因素刺激后產(chǎn)生活性氧，從而導(dǎo)致機(jī)體氧化、抗氧化體系失衡。ROS是一系列化學(xué)性質(zhì)活潑的含氧功能集團(tuán)化合物，包括氧自由基和各種非自由基含氧物。一旦ROS相對(duì)或絕對(duì)增多就會(huì)造成氧化應(yīng)激損傷，自由基積累和脂質(zhì)過氧化反應(yīng)增強(qiáng)使細(xì)胞膜蛋白的巰基受到了攻擊，脂質(zhì)微環(huán)境發(fā)生變化，蛋白質(zhì)交聯(lián)，從而破壞了膜的完整性和通透性，引起全身各個(gè)器官廣泛性損傷。ROS作為細(xì)胞間的信使，可以活化多條信號(hào)通路，間接引起人體正常細(xì)胞的功能失調(diào)和結(jié)構(gòu)破壞，從而引起全身多處器官功能損害。缺氧刺激產(chǎn)生的氧自由基來源于機(jī)體的各個(gè)細(xì)胞、溶酶體及線粒體等，可釋放氧自由基進(jìn)入血液循環(huán)。研究發(fā)現(xiàn)，通過給予氧自由基清除劑能夠清除因缺血缺氧而產(chǎn)生的過多的氧自由基，減輕其對(duì)機(jī)體的損傷。

MDA是由氧自由基攻擊細(xì)胞膜中的多聚不飽和脂肪酸引起脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生的，為氧化應(yīng)激毒性中間產(chǎn)物，反映組織中自由基的含量和自由基引發(fā)的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)程度、可以間接反映組織中ROS水平。SOD是體內(nèi)重要的抗氧化酶，普遍分布于自然界中各個(gè)生物體內(nèi)，可以催化超氧化物轉(zhuǎn)化為氧氣和H2O2。其作為主要氧自由基清除劑之一，功能是移除細(xì)胞中的超氧陰離子，當(dāng)體內(nèi)自由基生成增多時(shí)，它與O2-反應(yīng)生成H2O2。機(jī)體內(nèi)自由基通過線粒體或者細(xì)胞中SOD等抗氧化作用降低H2O2毒性，從而使自由基清除，保護(hù)細(xì)胞免受損傷。有研究顯示,低氧條件下SOD的生成是降低的。至目前為止，多項(xiàng)研究[2,3]表明MDA、SOD參與了人類多種疾病的發(fā)生發(fā)展過程，研究者們也試圖尋找通過減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)達(dá)到治療相關(guān)疾病的目的。

本研究結(jié)果顯示，高海拔組MDA含量高于低海拔組及中海拔組，與既往報(bào)道[4]一致。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)暴露于高海拔低壓低氧環(huán)境中，隨著低氧暴露時(shí)間的延長，大鼠肺組織中的MDA逐漸升高，可能與長期低氧環(huán)境下過多的自由基發(fā)生脂質(zhì)過氧化作用有關(guān)，說明海拔越高大鼠肺組織中的細(xì)胞受自由基攻擊的程度越嚴(yán)重。本研究還發(fā)現(xiàn)，隨著海拔升高及暴露時(shí)間延長，高海拔組大鼠血漿MDA呈逐漸增高趨勢(shì)，提示隨海拔升高及暴露時(shí)間的延長，大鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)，機(jī)體損傷加重。本研究結(jié)果顯示，高海拔組飼養(yǎng)1 d SOD活力高于低海拔組，但隨著高海拔暴露時(shí)間的延長高海拔組SOD活力呈逐漸降低趨勢(shì)，這可能由于大鼠剛進(jìn)入高海拔環(huán)境時(shí)由于低氧的急性應(yīng)激使得肺組織SOD活力反應(yīng)性增高，從而起到保護(hù)組織細(xì)胞免受氧化損傷的作用；隨著模擬高海拔暴露時(shí)間的延長，SOD活力呈逐漸降低趨勢(shì)，這可能與機(jī)體內(nèi)自由基不斷積累增多、清除自由基的系統(tǒng)不斷消耗、抗氧化系統(tǒng)能力下降有關(guān)。

AngⅡ是一種可以在心血管系統(tǒng)中調(diào)控血壓的肽類激素，是腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)的一部分，可以引起血管收縮及血壓升高。AngⅡ可以促進(jìn)平滑肌細(xì)胞的增殖及遷移功能，其不僅在維持正常血管功能方面發(fā)揮重要作用，在很多疾病的病理生理學(xué)進(jìn)程中亦發(fā)揮了重要調(diào)控作用，如睡眠呼吸暫停低通氣綜合征、心力衰竭等。有研究[7]發(fā)現(xiàn),低氧可以損傷線粒體膜結(jié)構(gòu)從而導(dǎo)致線粒體功能紊亂，并且可能通過調(diào)控AngⅡ的表達(dá)調(diào)控內(nèi)皮組織功能。近年，多項(xiàng)研究[8,9]表明，AngⅡ可能參與了呼吸系統(tǒng)疾病發(fā)病的病理生理學(xué)過程，如參與了肺間質(zhì)纖維化、急性肺損傷的細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)過程。研究[10]還表明，間歇性低氧時(shí)，Ca2+超載誘導(dǎo)AngⅡ表達(dá)升高從而使細(xì)胞損傷，并且有研究[11]顯示，AngⅡ可能通過參與氧化應(yīng)激反應(yīng)、誘導(dǎo)肺上皮細(xì)胞凋亡等機(jī)制參與肺損傷的發(fā)生發(fā)展。本研究結(jié)果顯示，高海拔組飼養(yǎng)3、7、15、30 d,大鼠肺組織中AngⅡ表達(dá)高于低海拔組，且隨模擬高海拔暴露時(shí)間延長大鼠肺組織AngⅡ表達(dá)逐漸升高；高海拔組中，大鼠肺組織AngⅡ表達(dá)與SOD表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，與MDA表達(dá)呈正相關(guān)，推測(cè)低氧可能通過促進(jìn)AngⅡ表達(dá)及氧化應(yīng)激反應(yīng)參與了肺組織損傷過程，并且隨低氧程度加重，肺組織AngⅡ mRNA表達(dá)增加及氧化應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)，從而進(jìn)一步加重肺組織損傷程度。

總之，高海拔環(huán)境下，大鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)，肺組織AngⅡ mRNA表達(dá)增加，低氧可能通過促進(jìn)AngⅡ表達(dá)及氧化應(yīng)激反應(yīng)參與肺組織損傷過程，但由于本實(shí)驗(yàn)動(dòng)物偏少，觀察時(shí)間偏短，缺乏長期的觀察比較，且大鼠與人類之間存在一定的差異，所得出的結(jié)論僅是初步的，不能完全代表不同海拔高度對(duì)人體的影響。下一步的研究應(yīng)該擴(kuò)大實(shí)驗(yàn)動(dòng)物樣本含量，增加實(shí)驗(yàn)動(dòng)物造模類型，研究動(dòng)物在不同時(shí)間段下不同組織器官的變化規(guī)律，并招募合適的人群進(jìn)行相關(guān)分析研究。