薛海玲，曾昭偉，孫蘭菊，常艷敏

(天津市南開醫(yī)院,天津300100)

丙肝病毒(HCV)屬于黃病毒科(flaviviridae)肝炎病毒屬(hepacivirusgenus)，其基因組由約9.6×103個(gè)核苷酸的單股正鏈RNA構(gòu)成。HCV感染引起的丙型肝炎呈全球性流行，據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，全球HCV的感染率約為2.8%，約1.85億人感染HCV，每年因HCV感染導(dǎo)致的死亡病例約35萬例[1～3]。我國年齡≤59歲的一般人群HCV-Ab陽性率為0.43%。血液透析患者、HIV感染者、靜脈藥癮者等特殊和高危人群HCV-Ab陽性率分別為20%～50%、60%～90%和70%～90%，故我國約有1 000萬例丙肝患者。丙肝感染具有隱匿性，因此大量HCV感染者未被發(fā)現(xiàn)，同時(shí)丙肝慢性化率為55%～85%，病程20年出現(xiàn)肝硬化的比例為5%～15%，肝硬化失代償年發(fā)生率為3%～4%，肝癌年發(fā)生率為2%～4%[4，5]。早期診斷已成為預(yù)防和控制丙肝傳播的關(guān)鍵手段之一。目前常用的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法有HCV抗原檢測(cè)、抗HCV血清學(xué)檢測(cè)以及HCV RNA檢測(cè)。其中抗HCV血清學(xué)檢測(cè)是應(yīng)用比較廣泛的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法，包括常用的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、化學(xué)發(fā)光試驗(yàn)(CLIA)、膠體金快速實(shí)驗(yàn)以及重組免疫印記試驗(yàn)(RIBA)。第3代ELISA檢測(cè)試劑增加了NS5區(qū)蛋白抗原，聯(lián)合HCV核心抗原、NS3和NS4抗原，明顯提高了抗體的覆蓋率，同時(shí)也提高了檢測(cè)的敏感度和特異度[6]。RIBA具有較高的特異度，但靈敏度不及化學(xué)發(fā)光法高，同時(shí)操作繁瑣且價(jià)格昂貴，國內(nèi)臨床開展得較少。HCV RNA可作為HCV復(fù)制的直接指標(biāo)，是檢測(cè)HCV感染后確診和評(píng)估病毒復(fù)制水平及抗病毒治療效果的主要手段，檢測(cè)窗口期1～3周，而第三代ELISA、化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)的HCV感染窗口期分別為60 d和20～25 d[7,8]，相比之下，RNA檢測(cè)窗口期明顯提前。但HCV RNA檢測(cè)操作繁瑣、成本高，難以作為篩選試驗(yàn)在常規(guī)實(shí)驗(yàn)室普及[9]。美國疾控中心推薦使用RIBA和HCV RNA檢測(cè)作為補(bǔ)充和確認(rèn)試驗(yàn)[10]。在條件容許的情況下，應(yīng)首選HCV RNA定量檢測(cè)，避免RIBA檢測(cè)陽性后因治療原因須進(jìn)一步檢測(cè)病毒載量[11]。目前，CLIA中的化學(xué)發(fā)光微粒子免疫分析(CMIA)也開始應(yīng)用于抗HCV檢測(cè)，其精密度和準(zhǔn)確度高、高通量、可隨機(jī)進(jìn)樣、操作簡(jiǎn)單[12，13]。ELISA、CMIA用于HCV篩查的靈敏度和特異度均較高，但究竟哪種方法更適合作為現(xiàn)階段臨床HCV-Ab的初篩試驗(yàn)，相關(guān)報(bào)道較少。我們綜合對(duì)比了ELISA、CMIA兩種初篩方法測(cè)定HCV-Ab的效果，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 選擇南開醫(yī)院2018年7～12月收治的190例疑似HCV感染者，臨床癥狀符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)、中華醫(yī)學(xué)會(huì)感染病學(xué)分會(huì)聯(lián)合修訂的《丙型肝炎防治指南2015年更新版》的HCV癥狀[4]。190例均留取血清，收集無菌EDTA抗凝血，留取血漿，-80 ℃?zhèn)溆?。收?29例健康查體者的空腹促凝血標(biāo)本529份。本試驗(yàn)已經(jīng)通過醫(yī)院倫理委員會(huì)審查。

1.2 試劑與儀器 HCV質(zhì)控品(康徹思坦的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),批號(hào)為201710003)；HCV抗體診斷試劑、HCV校準(zhǔn)品； ELISA HCV抗體診斷試劑盒(北京萬泰生物工程股份有限公司)； i2000微粒子化學(xué)發(fā)光全自動(dòng)免疫分析儀(美國雅培);酶標(biāo)儀(日本,B IOIADMODEL-680型)；DEMⅢ型洗板儀(北京拓普分析儀器有限公司)；酶標(biāo)儀EXL800(美國Bio-Tek公司)；實(shí)時(shí)熒光PCR儀(ABI7500)。

1.3 HCV-Ab檢測(cè)方法 分別采用CMIA法、ELISA法檢測(cè)190例份疑似HCV感染、529例份健康查體者空腹促凝血HCV-Ab。

1.3.1 CMIA法的操作及結(jié)果判斷 CMIA法測(cè)HCV-Ab采用雅培i2000全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀進(jìn)行檢測(cè)，試劑盒為抗-HCV的CMIA檢測(cè)試劑盒，采用雙抗原夾心法，以順磁性微珠作為包被載體包被抗-HCV后，與標(biāo)本中的抗-HCV結(jié)合，加入吖啶酯標(biāo)記的抗-HCV后，在特定的磁場(chǎng)區(qū)發(fā)生沉積，經(jīng)反復(fù)洗滌使游離抗原或抗體與抗原抗體復(fù)合物分離，加入預(yù)激發(fā)液與激發(fā)液后，可以測(cè)定其激發(fā)光強(qiáng)度。S/CO>1.0為陽性。

1.3.2 ELISA法的操作及結(jié)果判斷 取血液標(biāo)本，設(shè)置陰性對(duì)照3孔、陽性對(duì)照2孔和空白對(duì)照1孔，每孔加樣本稀釋液100 μL，待測(cè)樣本10 μL，37 ℃孵育60 min，洗板后加酶結(jié)合物100 μL，37 ℃孵育30 min，洗板后加顯色液100 μL，37 ℃孵育30 min洗板后加終止液50 μL，ELISA法以主波長(zhǎng)450 nm，副波長(zhǎng)630 nm進(jìn)行比色。Cutoff值=陰性對(duì)照孔平均值+0.12。S/CO>1.0為陽性。

1.4 HCV RNA確認(rèn)試驗(yàn) 對(duì)190例份疑似HCV感染者空腹抗凝血血標(biāo)本進(jìn)行確認(rèn)試驗(yàn)，采用RFQ-RT-PCR檢測(cè)HCV RNA。檢測(cè)靈敏度為10～50 IU/mL，結(jié)果判斷：>5.0E+2 IU/mL為陽性。

1.5 ELISA、CMIA法檢測(cè) HCV-Ab的效能分析 ①精密度[13～15]分析:依照CLSI EP15-A2文件[16]，對(duì)兩種方法的批內(nèi)和批間精密度進(jìn)行評(píng)價(jià)比較。批內(nèi)精密度試驗(yàn)，選取高、低2個(gè)濃度水平，充分混勻，對(duì)每個(gè)水平重復(fù)測(cè)定20次；批間精密度試驗(yàn)，選取高、低2個(gè)濃度水平，充分混勻重復(fù)10 d，每天每個(gè)水平重復(fù)測(cè)定2次，共20次。②靈敏度分析:繪制濃度與S/CO曲線分析CMIA法、ELISA法檢測(cè)HCV-Ab的靈敏度。將衛(wèi)生部室間質(zhì)評(píng)血清進(jìn)行倍比稀釋，每個(gè)稀釋度樣本分別用ELISA和CMIA重復(fù)檢測(cè)10次，結(jié)果取平均值。以抗體濃度為橫坐標(biāo)，S/CO值為縱坐標(biāo)，繪制濃度與S/CO的曲線。③特異度分析:根據(jù)529例健康查體者(已與臨床確認(rèn)無HCV感染)ELISA、CMIA法檢測(cè)結(jié)果，采用特異度實(shí)驗(yàn)分析CMIA法、ELISA法檢測(cè)HCV-Ab的特異度。④一致率比較: 跟據(jù)190例份疑似HCV感染、529例份健康查體者ELISA、CMIA法檢測(cè)結(jié)果，計(jì)算陰性、陽性一致率及總一致率。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPASS19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以M表示，比較采用Mann-Whitney檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料以百分比表示，比較采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

190例份疑似HCV感染者標(biāo)本中CMIA法檢測(cè)陽性、陰性分別為190、0例，ELISA法分別為145、45例；529例份健康查體者標(biāo)本中CMIA法陽性、陰性分別為0、529例，ELISA法分別為156、563例。

CMIA法、ELISA法檢測(cè)HCV-Ab的批內(nèi)精密度水平1分別為4.70%±0.27%、7.11%±0.90%(t=11.495，P<0.05)，水平2分別為19.10%±0.59%、22.08%±2.22%(t=5.844，P<0.05)，CMIA法、ELISA法檢測(cè)HCV-Ab的批間精密度水平1分別為4.64%±0.16%、6.71%±0.81%(t=10.910，P<0.05)，水平2分別為19.11%±0.48%、21.39%±1.67%(t=5.968，P<0.05)。

將質(zhì)控物倍比稀釋到1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128時(shí)，ELISA法檢測(cè)HCV-Ab所得S/CO均值分別為3.89、1.05、0.31、0.06、0、0、0、0，CMIA法檢測(cè)HCV-Ab所得S/CO均值分別為5.24、3.87、1.78、0.97、0.66、0.43、0.20、0.18。CMIA法、ELISA法檢測(cè)HCV-Ab的S/CO比較，U=13.08，P<0.05。ELISA在稀釋度為1∶4時(shí)，測(cè)得S/CO為0.31<1.0，判定結(jié)果為陰性，而CMIA在稀釋度為1∶4時(shí)，測(cè)得S/CO為1.78>1.0，判定結(jié)果為陽性。

529例份健康查體者空腹促凝血標(biāo)本中CMIA法、ELISA法分別檢出陰性為529、518例，臨床特異性分別為100%、97.92%(χ2=9.186，P<0.05)。兩種方法陰性一致率為97.92%，陽性一致率為76.32%，總一致率為92.21%(χ2=4.400，P<0.05)。

190例份疑似標(biāo)本中HCV RNA陽性檢測(cè)率為59.47%(113/190)。CMIA法檢測(cè)HCV-Ab：0

3 討論

本研究通過靈敏度試驗(yàn)比較，當(dāng)質(zhì)控血清稀釋比例為1∶4時(shí)，CMIA法檢測(cè)HCV-Ab的S/CO為1.78>1.0，結(jié)果判定為陽性；而ELISA法的S/CO為0.31<1.0，判定結(jié)果為陰性。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，CMIA法的靈敏度高于ELISA法，較高的靈敏度大大減少了臨床檢測(cè)HCV-Ab的漏檢率。據(jù)報(bào)道[17～19]，雅培公司生產(chǎn)的CMIA法檢測(cè)HCV-Ab試劑盒靈敏度為94.44%～100%，高于國產(chǎn)ELISA試劑盒。本研究?jī)煞N方法檢測(cè)HCV-Ab的特異度均大于96%，與相關(guān)報(bào)道[20]一致，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，CMIA法檢測(cè)HCV-Ab的特異度高于ELISA法。精密度試驗(yàn)比較中，我們可以看出CMIA法檢測(cè)HCV-Ab的批內(nèi)和批間精密度均高于ELISA法，可見CMIA法檢測(cè)HCV-Ab的結(jié)果更穩(wěn)定，重復(fù)性更好。

兩種方法檢測(cè)HCV-Ab的陰性一致率為97.92%，陽性一致率為76.32%，總一致率為92.21%，陽性一致率略低于相關(guān)報(bào)道，但總一致率比較接近[21]。CMIA法檢測(cè)HCV-Ab，當(dāng)1.0≤S/CO<5.0時(shí)，與ELISA檢測(cè)的陽性符合率僅為58.33%(63/108)，此范圍內(nèi)的45例陽性標(biāo)本用ELISA檢測(cè)時(shí)為陰性，且全部集中在1.0≤S/CO<2.0的范圍內(nèi)，可見ELISA的靈敏度不如CMIA，ELISA更容易造成一定的漏檢率，出現(xiàn)這種情況的可能原因：ELISA包被的多肽結(jié)構(gòu)片段抗原非高度特異性；ELISA試劑盒包被抗原不純或酶標(biāo)二抗純度低。在此范圍外的陽性結(jié)果，即S/CO>5.0時(shí)，與ELISA的陽性符合率為100%，由此可見當(dāng)S/CO<5.0，即為弱陽性范圍內(nèi)時(shí)，兩種方法的陽性符合率低，S/CO>5.0時(shí)，兩種方法的陽性符合率升高，達(dá)到100.00%。

CMIA檢測(cè)HCV-Ab的靈敏度較高，不易造成漏檢，但也可能存在一定的假陽性，尤其是S/CO<5.0的弱陽性標(biāo)本假陽性率更高。因此對(duì)于假陽性的標(biāo)本美國疾控中心推薦使用RIBA或HCV RNA檢測(cè)作為補(bǔ)充和確認(rèn)試驗(yàn)。本試驗(yàn)使用HCV RNA檢測(cè)進(jìn)行補(bǔ)充試驗(yàn)。

對(duì)190例疑似標(biāo)本檢測(cè)HCV RNA后發(fā)現(xiàn)，CMIA總符合率為54.21%，隨著S/CO比值的升高，RNA檢測(cè)的陽性率呈上升趨勢(shì)。本研究中190例份疑似標(biāo)本中，S/CO<5.0的弱陽性標(biāo)本中假陽性率81.97%，相關(guān)報(bào)道[21]中提到，CMIA弱陽性標(biāo)本中有42%～71%的樣本經(jīng)確證為假陽性，本試驗(yàn)結(jié)果假陽性率略高，造成這種情況的可能原因：患者處于窗口期或恢復(fù)期，RNA水平低于檢測(cè)范圍；RNA檢測(cè)過程中被空氣中的RNA酶降解；RNA檢測(cè)試劑盒靈敏度較低。在61例弱陽性標(biāo)本中，經(jīng)RNA確認(rèn)為陰性的50例標(biāo)本集中在S/CO<3.0 范圍內(nèi)。由此可見S/CO<3.0時(shí)，CMIA的假陽性率最高。

ELISA的檢測(cè)結(jié)果中，隨著S/CO比值的升高，RNA檢測(cè)HCV-Ab的陽性率也呈上升趨勢(shì)。190例份疑似標(biāo)本中，ELISA檢測(cè)出45例陰性，經(jīng)RNA確證試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)17例為陰性，28例為陽性，假陰性率為62.22%。造成較高假陰性的原因可能有：ELISA手工操作中溫育時(shí)間短；包被的多肽結(jié)構(gòu)片段抗原的非高度特異性；試劑盒包被抗原不純或酶標(biāo)二抗純度低。ELISA法陽性標(biāo)本中，S/CO<3.8的弱陽性標(biāo)本假陽性率為89.29%。

對(duì)比兩種檢測(cè)方法，CMIA法HCV RNA陽性檢出率高于ELISA(P<0.05)，即兩種方法在整體陽性預(yù)測(cè)上具有顯著差異。由此可見，CMIA法檢測(cè)HCV-Ab的陽性預(yù)測(cè)值高于ELISA法，有更高的可信度。

與確證試驗(yàn)比較，隨著S/CO比值的增加，兩種方法陽性的標(biāo)本RNA檢測(cè)陽性率相應(yīng)升高。美國CDC[11]曾經(jīng)指出，應(yīng)用三代EIA試劑盒和CMIA試劑盒檢測(cè)HCV-Ab，當(dāng)S/CO分別≥3.8和S/CO≥5.0時(shí)，真陽性預(yù)測(cè)值均≥95%，上述S/CO值可被用于預(yù)測(cè)更高特異性的補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。本研究發(fā)現(xiàn)，ELISA法、CMIA法的S/CO分別≥5.0和≥8.0，有較高的真陽性預(yù)測(cè)值，由此可見S/CO比值在上述范圍內(nèi)，對(duì)丙肝陽性的預(yù)測(cè)有一定的參考意義。S/CO比值越高，補(bǔ)充試驗(yàn)陽性的可能性越大；反之假陽性的可能性越高。綜合本研究結(jié)果以及我院儀器水平和綜合環(huán)境等因素，我們推薦使用S/CO比值1.0～8.0作為CMIA的灰區(qū)范圍，推薦使用S/CO比值1.0～5.0作為ELISA的灰區(qū)范圍。對(duì)于灰區(qū)范圍內(nèi)的陽性結(jié)果，對(duì)于復(fù)查仍在灰區(qū)者，首先要除外標(biāo)本因素如是否溶血、黃疸、乳糜和離心不足等干擾因素的存在；也要除外人為的操作因素等假陽性因素。有條件的實(shí)驗(yàn)室，建議做RIBA和HCV RNA檢測(cè)作為補(bǔ)充和確認(rèn)試驗(yàn)，再進(jìn)行報(bào)告。

本試驗(yàn)中，HCV RNA檢測(cè)的陽性率為54.21%，低于本試驗(yàn)的CMIA、ELISA法檢測(cè)的HCV-Ab陽性率，同時(shí)也低于相關(guān)文獻(xiàn)[22]報(bào)道，推測(cè)可能的因素：有些患者處在HCV感染的急性期與慢性期轉(zhuǎn)換中或者HCV感染恢復(fù)期時(shí)無法檢測(cè)到[18]；有些患者經(jīng)長(zhǎng)期治療，病毒含量較低；PCR操作過程中，自然界廣泛存在的RNA酶導(dǎo)致RNA降解等影響因素，使擴(kuò)增效率降低。因此，僅憑借RNA檢測(cè)來確認(rèn)HCV-Ab篩查陽性與否可能存在一定誤判風(fēng)險(xiǎn)。我們認(rèn)為，有能力的實(shí)驗(yàn)室除使用RNA檢測(cè)外，還可使用RIBA等補(bǔ)充血清學(xué)檢測(cè)，幾種方法聯(lián)合使用，以提高臨床丙型肝炎診斷的準(zhǔn)確率。除了HCV RNA檢測(cè)，HCV-Ab檢測(cè)外，血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)和白蛋白等生化檢測(cè)結(jié)果的變化也與HCV的存在相關(guān)[4]，可以輔助判斷抗體篩查結(jié)果。

與ELISA法相比，CMIA法檢測(cè)HCV-Ab的優(yōu)點(diǎn)有：精密度CV變化小，重復(fù)性較好，測(cè)定結(jié)果較穩(wěn)定；有較高的靈敏度和特異度；較低漏檢率；假陽性率和假陰性率較低；有更高的陽性預(yù)測(cè)值。除此之外，CMIA法可全自動(dòng)化操作、操作簡(jiǎn)便、可進(jìn)行單份標(biāo)本檢測(cè)，反應(yīng)時(shí)間短(17 min)、可定量檢測(cè)、脫磁清洗、干擾物影響少、降低了操作人員感染的風(fēng)險(xiǎn)；可進(jìn)行定量測(cè)定，最小可測(cè)值達(dá)pg水平，檢測(cè)窗口期短，也使抗病毒治療的監(jiān)測(cè)成為可能。

綜上所述，作為實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)HCV-Ab的初篩方法，CMIA法比ELISA法有更多優(yōu)勢(shì)，值得進(jìn)行推廣，必要時(shí)采用多種方法聯(lián)合檢測(cè)，同時(shí)選擇特異度更高的補(bǔ)充試驗(yàn)進(jìn)行確證，以期為臨床醫(yī)生提供更準(zhǔn)確的結(jié)果，有利于HCV感染的早期診斷和治療。