黃丹輝 何靜 董航明 蔡紹曦

南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科，慢性氣道疾病研究所（廣州510515）

在我國，肺癌死亡人數(shù)居所有惡性腫瘤的第一位［1］。2015年我國肺癌的發(fā)病數(shù)及死亡數(shù)分別達到733 300 例和610 200 例［1］。如何早期診斷以及治療肺癌是目前臨床關注的熱點。人體微生態(tài)是指在一定空間范圍內，細菌、真菌、病毒形成的微生物群落以其宿主的組織和細胞及其代謝產物為環(huán)境而形成的能獨立進行物質、能量及基因相互交換的統(tǒng)一生物系統(tǒng)［2］。既往研究［3］表明肺部是無菌的，但隨著二代測序技術的發(fā)展，研究證實在健康狀態(tài)下肺部也存在豐富的細菌微生物群落。肺部微生態(tài)與呼吸系統(tǒng)疾病的研究為目前研究熱點。然而目前研究方向主要集中與肺部細菌微生態(tài)與慢性氣道疾病，如慢性阻塞性肺疾病、哮喘。關于肺部細菌微生態(tài)與肺癌的相關研究相對較少。目前研究初步探討了肺部細菌微生態(tài)與肺癌相關性以及可能的機制。研究證實與健康人相比，肺癌患者的肺部微生態(tài)會發(fā)生結構以及個別菌屬相對豐度的改變。肺部微生物可能通過菌群失調、炎癥反應、代謝產物、基因毒性、免疫反應等方面影響肺癌發(fā)生發(fā)展。這些研究從肺部微生物與肺癌相互作用角度研究肺癌的機制，為臨床上診斷與治療肺癌提供新的思路?，F(xiàn)將目前關于肺部細菌微生態(tài)與肺癌相關研究進行綜述，并對今后的研究提出展望。

1 健康人肺部微生態(tài)

雖然肺部與外界空氣相通，但在過去很長一段時間健康人的肺部卻被看做一個無菌環(huán)境。在二十一世紀的第一個十年中，隨著非培養(yǎng)的微生物鑒定技術的出現(xiàn)，人類對人體各器官的微生物組探索與日俱增［4］。2010年，HILTY 等［3］利用16S rRNA 測序技術對健康人、慢性阻塞性病例、哮喘病例的支氣管鏡刷檢樣本進行測序，結果證實健康人呼吸道含有豐富菌群。此外該研究還發(fā)現(xiàn)慢性氣道疾病的肺部菌群有所改變。此后幾年越來越多的研究利用二代測序技術證實了健康人肺部微生態(tài)的存在［4］。多項研究顯示肺部菌群主要來源于上呼吸道［5-7］。兒童的肺部菌群主要來源于口咽部及鼻咽部［5］，而成人肺部菌群則主要來源于口咽部［6］。肺部菌群來源在成人及兒童存在差異的原因可能是兒童及成人上呼吸道解剖結構存在差異以及兒童鼻咽部較多的分泌物有關［8］。成人呼吸道菌群主要由包括鏈球菌屬和韋永氏球菌屬在內的厚壁菌門以及包括普氏菌屬在內的擬桿菌門組成［9-11］。雖然從主氣管到各級支氣管存在氧分壓、溫度、pH 等一系列環(huán)境梯度變化，但是研究顯示微生態(tài)菌群結構在健康人肺部的不同區(qū)域間是相對均勻的［11］?；诖?，DICKSON 等［11］提出了改進的肺部生物地理島嶼模型。該模型提出，在健康肺中，呼吸道是從上呼吸道到肺泡延伸的相對均勻的單一生態(tài)系統(tǒng)，肺部某一區(qū)域的微生態(tài)群落主要由上呼吸道細菌的遷入速度以及肺部對細菌的清除速度兩個因素決定，而細菌的繁殖率影響較小。綜上所述，健康人肺部細菌微生態(tài)主要由口咽部常見菌群構成，細菌相對豐度主要受到遷入速度及清除速度兩大因素影響。未來需要更大樣本量的研究，明確健康人細菌微生態(tài)各個菌屬的構成，以及年齡、性別、吸煙等因素是否會影響細菌微生態(tài)結構。

2 肺部微生態(tài)與肺癌相關性研究

研究顯示在肺癌患者存在相似的肺部微生態(tài)。對216 例肺癌患者的支氣管肺泡灌洗液樣本的回顧性分析發(fā)現(xiàn)流感嗜血桿菌、腸桿菌屬和埃希氏桿菌屬等革蘭氏陰性菌在肺癌患者中定植［12］。APOPA 等［13］對肺活檢組織的微生態(tài)構成進行研究，發(fā)現(xiàn)肺癌患者有相似的微生態(tài)構成，以擬桿菌門和變形菌門為主，包括無色菌屬、不動桿菌屬、放線菌屬、伊麗莎白菌屬、羅氏菌屬和鞘氨醇桿菌屬等；同時，庫克菌屬、假單胞菌屬、鏈球菌屬和葡萄球菌屬等機會致病菌也在肺癌患者中廣泛存在。但與健康人群對比，肺癌人群的肺部微生態(tài)結構有顯著差異。通過對比健康人群和肺癌組織的微生態(tài)組成，研究［14-16］發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤組織菌群的α多樣性明顯低于對照組。一項納入143 例肺癌患者肺癌組織、144 例肺癌鄰近正常肺組織以及33 例無肺部疾病的尸體活檢標本的研究顯示肺癌組織與肺癌鄰近組織、健康人肺組織相比，肺癌患者的肺部微生態(tài)結構存在顯著差異［17］。小樣本的研究也顯示與健康人相比，肺癌患者痰液中的菌群結構均存在顯著差異［16］。因此，目前研究說明肺癌患者肺部細菌群落結構會出現(xiàn)改變。但未來需要更大樣本量的研究進一步證實。

許多研究在肺癌患者中檢測到多個相對豐度顯著改變的氣道菌屬，說明可能存在參與肺癌發(fā)生發(fā)展的關鍵菌屬。LIU 等［18］采集了24 例肺癌患者病變部位和病變對側健康部位的支氣管鏡刷檢樣本，結果顯示健康人-肺癌非病變部位-肺癌病變部位中鏈球菌屬和奈瑟菌屬豐度呈升高趨勢，而葡萄球菌屬和小桿菌屬則呈現(xiàn)降低趨勢。在中國燃煤暴露地區(qū)不吸煙女性肺癌患者中，肺癌患者痰液中顆粒鏈球菌屬、營養(yǎng)缺陷菌屬和鏈球菌屬豐度較健康對照人群明顯增高［16］。一項小型基于宏基因組技術的對照研究發(fā)現(xiàn)肺癌患者較非肺癌患者痰液中草綠色鏈球菌、毗鄰顆粒鏈球菌、結核分枝桿菌豐度升高［14］。而另一項以肺癌支氣管刷檢組織為樣本的小型研究發(fā)現(xiàn)鏈球菌屬、韋永氏球菌屬和乳酸桿菌屬在肺癌樣本中豐度升高［15］。綜上所述，肺癌患者中會出現(xiàn)多個菌屬相對豐度的改變。由于目前大多數(shù)研究的樣本量較少，而且肺癌本身異質性的存在，使得目前各個研究得到的一致性結論不多。但結合目前的研究，鏈球菌屬可能是肺癌的關鍵菌屬之一。目前已有4 項微生態(tài)研究發(fā)現(xiàn)鏈球菌屬在肺癌患者呼吸道中顯著升高［14-16，18］。大型回顧性研究證實肺炎鏈球菌感染可能是肺癌的危險因素［19］?；A實驗證實肺炎鏈球菌可通過Toll 樣受體2上調IL-6的表達，進而促進肺癌細胞轉移［20］。但由于目前有關肺部微生態(tài)與肺癌相關性的研究均為橫斷面研究，無法明確肺癌與肺炎鏈球菌的因果關系。如肺癌患者常合并阻塞性肺炎，而研究發(fā)現(xiàn)肺炎鏈球菌是阻塞性肺炎的常見病原菌［21］?？紤]肺炎鏈球菌是社區(qū)獲得性肺炎最常見病原菌，因此迫切需要更多的研究炎癥肺炎鏈球菌與肺癌的相關性。除了肺炎鏈球菌外，顆粒鏈球菌也可能是肺癌的關鍵菌屬之一。顆粒鏈球菌與肺炎鏈球菌同屬于乳酸桿菌目，為厭氧菌［22］。目前研究證實顆粒鏈球菌屬在肺癌患者呼吸道中顯著升高［14，16］，其中顆粒鏈球菌可能通過參與腐胺及聚胺的代謝途徑影響肺癌［14］。

此外氣道細菌微生態(tài)差異還存在于不同病理類型、不同分期以及不同突變基因的肺癌，然而目前相關研究較少。研究發(fā)現(xiàn)與肺鱗癌組織相比，肺腺癌組織棲熱菌屬相對豐度更高，羅爾通菌屬相對豐度降低，并有更豐富的α多樣性［23］。GREATHOUSE等［17］發(fā)現(xiàn)肺鱗癌患者與肺腺癌患者擁有相似的菌群結構，但肺鱗癌患者有更高豐度的食酸菌屬、克雷伯菌屬、單胞菌屬、紅育菌屬。鱗癌與腺癌之間的差異可能與吸煙因素有關，與從未吸煙的肺癌患者相比，食酸菌屬在吸煙患者的相對豐度更高［17］。不同分期的肺癌也存在肺部細菌差異。研究分析了癌旁組織的微生態(tài)構成，發(fā)現(xiàn)不同分期的肺癌β多樣性（群落間的物種多樣性）有顯著差異，其中ⅢB 期及Ⅳ期患者棲熱菌屬相對豐度增高［23］。此外基礎實驗研究發(fā)現(xiàn)肺部副流感嗜血桿菌以及肺部菌群失衡可促進小鼠癌細胞轉移到肺部［24-25］。這間接說明了肺部細菌可能參與了肺癌的轉移。TP53 是肺癌最常見的突變基因［26］。TP53 突變可以造成氣道上皮屏障的破壞［27］，進而可能對肺部菌群造成影響，更利于細菌侵入與繁殖。GREATHOUSE 等［17］發(fā)現(xiàn)，食酸菌屬在具有TP53 突變的肺鱗癌組織中的豐度較TP53 野生型肺鱗癌顯著升高。因此，肺部細菌與宿主之間可能存在復雜的相互作用。肺部細菌既可能可以促進肺癌發(fā)生發(fā)展，而宿主因素例如吸煙狀態(tài)、基因突變又可能反過來影響肺部細菌，交織成復雜的關系網絡。

3 肺部微生態(tài)影響肺癌發(fā)生發(fā)展的機制

目前關于細菌微生態(tài)與癌癥相關機制的研究主要集中于腸道菌群與結腸癌領域。GAO 等［28］總結歸納了發(fā)表的關于消化道菌群與結腸癌機制研究的結果，指出消化道菌群主要通過菌群失調、炎癥反應、代謝產物、基因毒性、免疫反應等方面影響結腸癌的發(fā)生發(fā)展。而關于肺部菌群與肺癌相關的機制研究較少。

一項大型的病例對照研究提示反復使用青霉素類藥物、頭孢類藥物、大環(huán)內酯類藥物會增加肺癌患病風險［29］，提示肺部菌群失衡可能與肺癌相關。而一項基礎研究顯示，在給小鼠霧化吸入萬古霉素/新霉素后，小鼠B16 黑色素瘤細胞肺轉移減少。而在將抗生素處理后的小鼠肺泡灌洗液移植到未處理小鼠，也能觀察到B16 細胞肺轉移減少的現(xiàn)象［30］。菌群失衡表示某些致病細菌豐度的失調，進而可能通過產生過多的毒性物質、介導炎癥反應而促進肺癌發(fā)生發(fā)展。

肺部細菌的代謝產物可能參與了肺癌的發(fā)生發(fā)展。顆粒鏈菌屬在CAMERON 等［14］的研究中被發(fā)現(xiàn)與肺癌相關，而功能分析發(fā)現(xiàn)顆粒鏈球菌屬參與了腐胺及聚胺的代謝途徑。而腐胺及聚胺的降解可以影響細胞周期，并被證實與包括肺癌在內的多種癌癥相關［31］。APOPA 等［13］發(fā)現(xiàn)與肺鱗癌及癌旁正常組織相比，肺腺癌患者中藍藻菌屬相對豐度顯著升高，而功能分析提示藍藻菌屬分泌的微囊澡素可能與聚腺苷酸二磷酸核糖轉移酶-1（PARP1）的升高相關；進一步的細胞實驗證實微囊澡素刺激A427 細胞系會引起PARP1 的升高。PARP1 的表達被證實與細胞的分化及致癌作用相關［32］。

炎癥、癌癥、細菌有著千絲萬縷的聯(lián)系。近來越來越多分子機制研究顯示慢性炎癥在癌癥發(fā)生方面發(fā)揮了重要的作用［33］。肺部細菌在招募肺泡巨噬細胞、調節(jié)T 細胞、PD-L1 介導的耐受性樹突狀細胞發(fā)揮作用［34］。DICKSON 等［35］研究顯示相比于腸道菌群，健康小鼠的肺部菌群更能反應小鼠的肺部免疫狀態(tài)。這提示肺部菌群可以通過炎癥反應促進肺癌發(fā)生發(fā)展，而最近的研究支持了這一猜想。JUNGNICKEL 等［36］研究發(fā)現(xiàn)將注射LCC 細胞的小鼠先后暴露與煙草及副流感嗜血桿菌后，暴露于副流感嗜血桿菌組的小鼠的肺轉移結節(jié)數(shù)量及體積均較未暴露組小鼠增多及增大；進一步研究顯示副流感嗜血桿菌通過Toll 樣受體2/4 上調IL-17C 的表達，進而誘導腫瘤周圍中性粒細胞的浸潤，從而促進腫瘤發(fā)展。另一篇類似的研究顯示煙霧暴露導致小鼠的氣道上皮完整性受損，而在氣道上皮屏障受損基礎上副流感嗜血桿菌易由氣道上皮移位至肺癌組織，進而通過上調IL-17A 的表達量促進腫瘤周圍中性粒細胞的浸潤［37］。以上兩個研究均說明在上皮屏障破壞的基礎上，副流感嗜血桿菌通過調節(jié)炎癥反應促進肺癌發(fā)生發(fā)展。眾所周知，慢阻肺是肺癌公認的危險因素，而許多研究認為慢阻肺可通過氣道炎癥反應促進肺癌發(fā)生［38］。副流感嗜血桿菌作為慢性阻塞性肺疾病患者常見致病菌，可能起到了慢性阻塞性肺疾病與肺癌之間聯(lián)系的橋梁作用。GOWING 等［20］的研究顯示肺炎鏈球菌通過Toll 樣受體2 上調IL-6 的表達，進而增強H59 和A549 非小細胞肺癌細胞的基質粘附性以及增加肺癌細胞對C57BL/6 小鼠肝竇粘附性。SUN 等［39］的研究發(fā)現(xiàn)肺癌合并陰性桿菌感染通常預示著肺癌術后短時間內復發(fā)；進一步研究顯示將人源性非小細胞肺癌細胞給予大腸埃希菌刺激后，細胞CD133、CD44、CD166 以及ALDH1A1 等腫瘤干細胞相關標記物的表達上調，而這一作用依賴于Toll 樣受體4/IL-33 信號通路。以上研究初步說明肺部細菌可通過作用于細菌模式識別受體上調炎癥介質的表達，進而影響肺癌發(fā)生發(fā)展。但是細菌代謝產物、免疫系統(tǒng)在其中發(fā)揮的作用仍有待發(fā)掘。因此未來需要從免疫系統(tǒng)、細菌代謝產物、宿主基因等多角度深入立體地探討肺部細菌與肺癌相互作用機制。

4 肺部微生態(tài)與肺癌研究展望

肺部微生態(tài)與肺癌的相關研究目前仍處于初步階段，仍面臨許多機遇和挑戰(zhàn)。

第一，目前缺乏足夠樣本量的關于肺部微生態(tài)與肺癌的研究?？紤]肺癌本身的異質性，以及研究中存在的種族、年齡、性別、吸煙狀態(tài)、抗生素使用情況、合并的呼吸系統(tǒng)疾病等眾多混雜因素，需要更大樣本量的研究才能有足夠的統(tǒng)計檢驗力說明肺部微生態(tài)與肺癌的相關性［40］。

第二，目前的研究利用不同的樣本（痰液、肺泡灌洗液、支氣管刷檢組織、外科手術切除組織）研究肺癌病人的肺部微生態(tài)，但不同樣本之間的異質性大。一項比較囊性纖維化病人自發(fā)痰液與移植肺組織微生態(tài)的研究顯示痰液內的主要菌屬的相對豐度與移植肺組織相似，但少見菌屬的相對豐度明顯與移植肺組織不同，而且多樣性水平更高［41］。另一項研究比較了慢性阻塞性肺疾病患者的誘導痰液、支氣管鏡抽吸痰、支氣管灌洗液、支氣管刷檢組織以及口腔標本，結果顯示誘導痰、支氣管鏡抽吸痰、支氣管灌洗液、支氣管刷組織的微生態(tài)結構與口腔標本顯著不同，誘導痰與支氣管抽吸痰菌群結構類似，而支氣管灌洗液與支氣管刷組織的菌群結構類似［42］。而目前沒有研究結果表明肺癌患者不同標本類型的區(qū)別以及哪些標本符合肺癌患者肺部真實微生態(tài)結構，因此無法有效整合不同標本得到的結果。將來需要在肺癌患者及健康人中開展比較不同標本類型的菌群結構的研究。除了標本類型存在異質性，樣本的采集方法、核酸提取方法、測序平臺及技術、生物信息學方法均存在異質性，而未來需要建立統(tǒng)一的標準［43］。

第三，健康人肺部菌群負荷量小，而下呼吸道與上呼吸道相通，除了手術切除肺部組織不受到上呼吸道菌群污染外，痰液、支氣管灌洗液及支氣管刷檢產物不可避免地受到上呼吸道菌群污染，影響到結果的準確性。但是目前缺乏統(tǒng)一的統(tǒng)計學及生物信息學方法排除上呼吸道的污染［43］。

第四，將來的研究方向需要更快速準確地挖掘氣道菌群與宿主之間的作用機制，而多組學的整合將帶來更豐富更準確的信息。例如TSAY等［15］將微生態(tài)組學與轉錄組學的結果相整合，發(fā)現(xiàn)鏈球菌屬與韋榮氏球菌屬在肺癌人群中相對豐度較高且與ERK 和PI3K 信號通路相關，并且在細胞實驗上進行了驗證。ZHAO 等［44］描述了將微生物組學與轉錄組學整合的算法框架，并期望將來能有更多的研究利用多組學整合方法。

第五，未來需要更多的研究證實肺部微生態(tài)與肺癌的因果關系。一方面，目前開展的臨床研究均為橫斷面研究，未來還需進一步開展前瞻性隊列研究，以此證明肺部微生態(tài)與肺癌的因果關系。另一方面，將來的研究需證明干預肺部微生態(tài)可以治療或預防肺癌的發(fā)生發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)利用抗生素干擾小鼠腸道菌群會影響小鼠肺部γδ17細胞，進而促進小鼠肺轉移癌的生長［45］。但文章沒有揭示肺部微生態(tài)的變化是否影響肺部免疫狀態(tài)。目前糞菌移植是臨床上治療腸易激綜合征、克羅恩病的新興技術，且已顯示出一定的療效［46］。借鑒于糞菌移植概念，YADAVA 等［47］通過經鼻向小鼠氣道內滴入脂多糖及彈性蛋白酶造成氣道慢性炎癥，發(fā)現(xiàn)小鼠肺部菌群結構的變化與氣道炎癥反應相關；而將病鼠的肺泡灌洗液經鼻滴入經過抗生素處理的小鼠氣道內后小鼠氣道IL-17A 水平增高。目前并沒有直接通過肺部菌群移植干預肺部菌群，進而影響肺癌發(fā)生、發(fā)展的研究。

5 結語

肺癌疾病負擔嚴重，而肺部微生態(tài)的研究從新的角度認識肺癌。目前不少研究已證實與健康人相比，肺癌患者存在肺部微生態(tài)的改變，并且肺癌患者肺部存在許多差異菌屬，而這些差異菌可能通過炎癥反應、產生毒性代謝產物等機制影響肺癌的發(fā)生發(fā)展。這些研究提示肺部細菌微生態(tài)很有可能參與了肺癌的發(fā)生發(fā)展。正如幽門螺旋桿菌與胃癌，乙肝病毒與肝癌的關系，筆者希望通過微生態(tài)的研究在未來能發(fā)現(xiàn)與肺癌相關的微生物。為實現(xiàn)這一目標，未來需要更多大樣本、更加深入的研究探討肺部微生態(tài)與肺癌相關性，證明肺部微生態(tài)與肺癌發(fā)生發(fā)展的因果關系；同時也需要對從標本采集、測序、數(shù)據分析等一系列過程進行標準化。最終為臨床上診斷與治療肺癌提供新的思路。