王禾 翟堅學 劉曦光 馮思陽 董曉穎 史曉舜 盧笛 吳華李梅 蔡開燦

南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院胸外科（廣州510515）

在世界范圍內(nèi)，肺癌是威脅人類健康主要的惡性腫瘤之一，發(fā)病率和死亡率均居首位［1］，其起病隱匿，早期缺乏特異性的臨床表現(xiàn)，當患者出現(xiàn)癥狀就診時往往處于局部晚期或已發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移，預后往往較差。非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）的病例約占所有診斷為肺癌病例的85%，NSCLC 主要包括腺癌、鱗狀細胞癌、大細胞癌等類型。目前組織活檢是肺癌診斷的金標準，但組織活檢具有局限性和風險性，特殊部位的腫瘤可能無法進行活檢，可能需要反復活檢并且不能完全避免手術(shù)并發(fā)癥，不能作為常規(guī)篩查方法，不能反映腫瘤的克隆異質(zhì)性［2］。

近年來，液體活檢已成為腫瘤診斷的重要工具，可以通過體液（如唾液、尿液和血液）檢測特異性腫瘤生物標志物。與常規(guī)腫瘤組織活檢相比，分離體液更為簡便、快速、安全，并且便于重復采樣和作為無法取得組織活檢時的診斷替代品。目前在NSCLC 中的應(yīng)用的液體活檢來源有循環(huán)腫瘤細胞（circulating tumor cells，CTCs）、循環(huán)游離DNA（circulating cell-free tumour DNA，ctDNA/cfDNA）、腫瘤血小板（tumor-educated platelets，TEPs）和胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）［3］。2015年BEST等［1］首次提出TEPs的概念［4］，TEPs 是腫瘤患者體內(nèi)與腫瘤相互作用的病理生理過程中受到腫瘤細胞和腫瘤微環(huán)境“教育”的血小板，被認為由癌癥存在時的局部和系統(tǒng)性應(yīng)答轉(zhuǎn)化而來［5］。TEPs 易于分離及檢測，是一種新型的液體活檢來源，多項研究研究表明TEPs 具有在NSCLC 的診斷、疾病監(jiān)測及預后評價上的潛力和優(yōu)勢［4，6-7］。以下將對TEPs 及其在NSCLC 中的研究進展進行綜述。

1 TEPs 概述

1.1 血小板的生物學特征 正常人每毫升血液中含有約2 ～5 億個血小板，血小板在體內(nèi)的平均壽命約為10 d［8］。血小板是來自骨髓巨核細胞的無核循環(huán)細胞片段，通過在損傷部位形成肌動蛋白絲粘附和聚集發(fā)揮止血作用［9］。血小板在其生命周期中可以吸收并攜帶蛋白質(zhì)和核酸［10］，其中包括mRNA、前體信使RNA（pre-messenger RNA，premRNA）、小RNA（microRNA，miRNA）、長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）、環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）和線粒體DNA［11］。

血小板可以分泌影響細胞生長和血管生成的生長因子，還能吸引其他血細胞（如單核細胞和粒細胞），創(chuàng)造一個有助于腫瘤轉(zhuǎn)移的微環(huán)境［12］。并且，血小板也可以在腫瘤組織中浸潤［13］，可能持續(xù)地在腫瘤微環(huán)境中定植和排出。腫瘤細胞生長、侵襲、擴散、遷移、滲出和遠處轉(zhuǎn)移擴散的步驟都有血小板的參與［9，14］，且腫瘤進展使血小板呈現(xiàn)出高反應(yīng)性［15］，可能是腫瘤患者血小板活化和血栓形成風險增高的一個因素［16］。血小板與腫瘤的互相作用一直受到關(guān)注，并且被認為是一種潛在的腫瘤診斷工具。

1.2 TEPs 形成的生物機制 血小板中含有RNA，通過測序的手段定性、定量分析其中RNA 的組成，從而記錄血小板在特定狀態(tài)下的RNA 成員和豐度信息，由此形成的數(shù)據(jù)表為血小板的RNA 譜。在血小板的生命周期中，其RNA 含量逐漸減少［17］，表明巨核細胞提供的RNA 是血小板在血液循環(huán)以及浸潤到腫瘤原發(fā)部位或轉(zhuǎn)移瘤時的活動所必需的［18］，但腫瘤的病理生理狀態(tài)對于骨髓巨核細胞的影響尚不明確。在腫瘤患者體內(nèi)，TEPs 的RNA 譜受到病理生理條件的動態(tài)影響［4］，因此可能作為腫瘤性疾病領(lǐng)域診斷、監(jiān)測或預后評估的生物標志物［19］。

導致TEPs 的RNA 譜改變的生物學機制和由此產(chǎn)生的生物學效應(yīng)尚不明確，目前對這一現(xiàn)象的解釋基于腫瘤及其微環(huán)境引起的血小板內(nèi)pre-mRNA 剪接的假設(shè)基礎(chǔ)［18］。血小板中不含細胞核，所含RNA 的水平變化可能通過轉(zhuǎn)錄后pre-mRNA 的選擇性剪接來實現(xiàn)［20］。當血小板遇到腫瘤細胞釋放的含有腫瘤相關(guān)的生物分子（如腫瘤特異mRNA）的外泌體后，血小板攝取這些外泌體并保護這些分子不被降解［19］。腫瘤細胞和腫瘤微環(huán)境（如基質(zhì)細胞和免疫細胞）釋放的生物分子可能使血小板中發(fā)生剪接事件并轉(zhuǎn)化為TEPs［4］。剪接事件可以部分通過選擇性剪接事件來解釋，并且剪接事件可能部分依賴于RNA 結(jié)合蛋白的活性［7，18］。此外，在TEPs 中對pre-mRNA 的調(diào)節(jié)還可以由miRNA［21］和circRNA［22］來實現(xiàn)。

1.3 TEPs 的檢測 在腫瘤診斷中應(yīng)用TEPs 要保證體外分離的血小板的狀態(tài)與體內(nèi)的血小板相似，以避免生物化學或物理擾動引起血小板活化，導致其形狀改變及內(nèi)容物釋放［4］。目前的檢測方法中，首先使用EDTA 抗凝管采集全血約6 mL 儲存過夜，24 h 后處理，通過臨床檢驗記錄獲取血小板計數(shù)信息［7］，為了保持TEPs 中RNA 的質(zhì)量和特征，全血在室溫下的儲存時間應(yīng)＜48 h［10］。為分離純化血小板，先應(yīng)用120 ×g 離心20 min 將富含血小板的血漿與有核血細胞分離，之后通過360×g離心20 min 分離富含血小板血漿純化得到濃縮的完整血小板［7］。通過結(jié)晶紫染色后在光鏡下驗證血小板的純度，每1 千萬個血小板顯示的有核細胞應(yīng)＜5 個［20］，表明TEPs 的RNA 譜不受有核細胞的污染，滿足進一步檢測的標準［10］。然后提取血小板RNA并擴增進行測序，最后在RNA 水平上進行TEPs 綜合分析。

2 TEPs 與NSCLC

2.1 TEPs 在NSCLC 診斷中的作用 2015年，BEST 等［4］提出了基于TEPs 的新型液體活檢來源及分析方法，通過對283 份血小板樣本的mRNA 測序，應(yīng)用留一交叉驗證的支持向量機算法（leaout -one-out cross-validation support vector machine algorithm，LOOCV SVM），以96%的準確率區(qū)分228例局限性和轉(zhuǎn)移性腫瘤患者和55 例健康受試者，以71%的準確率區(qū)分6 種原發(fā)腫瘤（NSCLC、結(jié)直腸癌、膠質(zhì)母細胞瘤、胰腺癌、肝及膽管癌、乳腺癌）的起源器官，給定分類算法的兩個疑似器官時，準確率最高可達到89%。僅在探討NSCLC 時，該算法在訓練組和驗證組中區(qū)分NSCLC 患者和健康受試者的準確率分別為75%和79%［4］。由于研究納入的NSCLC 患者大部分處于晚期，該算法是否適用于早期NSCLC 的檢測仍需進一步驗證。此外，該研究在TEPs 用于區(qū)分不同類型的腫瘤時主要受腫瘤類型的影響，較少受腫瘤進展和轉(zhuǎn)移的影響（未轉(zhuǎn)移瘤與轉(zhuǎn)移瘤比較差異無統(tǒng)計學意義），可能與每種腫瘤類型的患者數(shù)量較低，不允許對局限性和轉(zhuǎn)移性腫瘤進行有統(tǒng)計學意義的分層有關(guān)［23］。

2017年，BEST 等［7］應(yīng)用TEPs 對NSCLC 進行了后續(xù)研究，該研究納入了不同分期的NSCLC 患者，其中包含了對年齡、吸煙習慣、炎癥狀態(tài)的分析，并且對血小板分離時間進行標準化。為了選擇一個穩(wěn)健的生物標記物集，迭代優(yōu)化生物標記物的粒子群優(yōu)化（particle-swarm optimization，PSO）算法［24］被用于識別最佳的生物標志物，PSO 算法用于區(qū)分245 例Ⅳ期NSCLC 患者和273 例健康受試者的準確率為89%，用于區(qū)分53 例Ⅰ至Ⅲ期NSCLC 患者和53 例健康受試者的準確率為81%，PSO 算法對NSCLC 診斷的準確性隨著樣本的增加而提高，并且不受患者的年齡、吸煙習慣、全血貯存時間和炎癥狀態(tài)影響［7］。BEST 等［7］開發(fā)了基于RNA-seq 檢測TEPs 中生物標記物的檢測平臺thromboSeq，能夠從100 ～500 pg 血小板RNA（相當于一滴血中的血小板）中識別出TEPs 的RNA 譜，PSO 算法驅(qū)動的thromboSeq平臺允許為TEPs 的癌癥診斷提供穩(wěn)健的生物標記物選擇，也可能擴展到其他疾病和液體活檢來源的應(yīng)用。

2.2 TEPs 在NSCLC 療效預測中的作用 表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）突變和肝細胞生長因子受體（hepatocyte growth factor receptor，MET）擴增作為肺腺癌的驅(qū)動基因可預測靶向治療的療效，KRAS 突變可在腫瘤的臨床管理和決策過程納入考慮［25］。BEST等［4］確定了TEPs 中與腫瘤組織分子亞型相關(guān)的剪接RNA 標記，應(yīng)用LOOCV SVM 區(qū) 分NSCLC 患者 中EGFR 突 變、MET 擴增和KRAS 突變的準確率分別為87%、91%和90%，但用于區(qū)分的患者例數(shù)較少（分別為60、23 和60 例），各算法中的標記物數(shù)量分別200，24 和421，因此這些算法存在較高的過擬合風險。

NILSSON 等［6］采用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）對77 例NSCLC 患者的血小板和血漿進行棘皮動物微管相關(guān)蛋白樣4（echinoderm microtubule-associated protein-like 4，EML4）-間變淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase，ALK）融合基因分析，發(fā)現(xiàn)通過TEPs 分離腫瘤來源的RNA 分子檢測EML4-ALK融合基因的準確率為86%；對29例EML4-ALK 融合基因的NSCLC 患者應(yīng)用克唑替尼進行治療，發(fā)現(xiàn)循環(huán)TEPs 中EML4-ALK 轉(zhuǎn)錄本的數(shù)量可降低，同時通過TEPs 檢測EML4-ALK 融合基因的結(jié)果與無進展生存期和總生存期相關(guān)。他們通過TEPs 檢測對一個EML4-ALK 融合基因陽性的患者進行了近3年的監(jiān)測，并在影像學發(fā)現(xiàn)疾病進展前兩個月檢測到腫瘤對克唑替尼的耐藥性［6］。由于正常血小板的生命周期短，腫瘤來源的轉(zhuǎn)錄本可以在TEPs 中積累，并隔離了循環(huán)系統(tǒng)中的核糖核酸酶，因此應(yīng)用TEPs 的RNA 分析可能反應(yīng)了最新、動態(tài)的腫瘤活動信息［18］。

DIEM 等［26］報道了血小板與淋巴細胞比率升高與NSCLC 患者應(yīng)用納武單抗（nivolumab）抗細胞程序性死亡-配體1（programmed death receptor-1，PDL1）免疫治療的應(yīng)答率降低的相關(guān)性，提示了在抗腫瘤免疫反應(yīng)中循環(huán)血小板的促腫瘤效應(yīng)［32］。

2.3 TEPs在NSCLC標志物探索中的作用 SOL等［10］差異分析了TEPs 與正常受試者中的非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNA）識別了差異表達的20 個具有腫瘤特異性的ncRNA，其中有16 個在TEPs 中上調(diào)表達。其中肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1（metastasis associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1）下調(diào)表達［4］，這種ncRNA 在細胞核中調(diào)節(jié)部分基因的轉(zhuǎn)錄，包括一些參與腫瘤轉(zhuǎn)移的基因，其在多種癌組織中上調(diào)表達與腫瘤細胞的增殖轉(zhuǎn)移有關(guān)［28-29］。生長阻滯特異性轉(zhuǎn)錄本5（growth arreth specific transcript 5，GAS5）也是下調(diào)表達的ncRNA，其參與細胞增殖，其下調(diào)表達在黑色素瘤中具有促癌作用［30］。

PUCCI 等［13］發(fā)現(xiàn)在KRAS 驅(qū)動的肺腺癌遺傳模型中，血小板因子4（platelet factor 4，PF4）這種內(nèi)分泌因子的過量產(chǎn)生促進了骨髓巨核細胞造血，增加了血小板在肺部的聚集并且加速了新生腺癌的發(fā)生；并且抗血小板治療可控制小鼠肺癌的進展。這些結(jié)果提示血小板可調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，影響腫瘤的生長，PF4 作為一種促癌內(nèi)分泌信號，可能作為抗癌治療的分子靶點。

薛琳琳等［31］在156 例肺癌患者和58 例健康受試者中檢測到凋亡染色體凝聚誘導因子1（apoptotic chromatin condensation inducer 1，ACIN1）在肺癌患者血小板中的表達水平顯著高于健康受試者，檢測其表達水平對肺癌的診斷有潛在的臨床價值。ACIN1 是剪接依賴的多蛋白外顯子連接復合物的一個組成部分，直接參與剪接相關(guān)的RNA代謝，可能參與了肺癌相關(guān)的TEPs 形成。

3 進展及展望

近年來，關(guān)于液體活檢的研究顯著增加，未來可能利用液體活檢來檢測、診斷和監(jiān)測腫瘤，并為臨床腫瘤患者個體化精準診療提供決策。相較于其他液體活檢來源，TEPs具有豐度高、易分離、易儲存、易檢測的優(yōu)勢，并且其中的RNA 受到血小板的保護［3］。由于無誘因靜脈血栓栓塞患者5%～10%的概率在事件發(fā)生后1年內(nèi)被診斷為腫瘤［10］，目前有一項正在進行的臨床研究（https：//www.clinicaltrials.gov/，NCT02739867），主要目標為評價血小板RNA 圖譜在無誘因靜脈血栓栓塞患者隱匿性癌檢測中的診斷準確性，次要目標包括評價其他腫瘤生物標志物，預測出血和靜脈血栓復發(fā)風險，屆時可以初步驗證出TEPs 是否具有用于腫瘤診斷的能力。

TEPs 的研究進展迅速，也取得了振奮人心的結(jié)果，但是TEPs 在臨床診斷應(yīng)用有以下局限性：無法評估腫瘤的基因組、轉(zhuǎn)錄組及蛋白質(zhì)組學特征；無法檢測腫瘤突變負荷；無法進行細胞功能學實驗。由于特征和標志物的組織特異度，在其他液體活檢來源中發(fā)現(xiàn)的生物標志物不一定能推廣應(yīng)用到TEPs 中，并且同一種生物標志物在不同的液體活檢來源之間的診斷效果也不同，因此穩(wěn)健的應(yīng)用于TEPs 的標志物需要不斷探索及驗證。目前TEPs 在NSCLC領(lǐng)域的研究較為深入，但在臨床上推廣應(yīng)用仍需回答以下問題［32］：（1）其他研究者能否重復研究結(jié)果；（2）能否將分析過程簡化以便應(yīng)用，例如集中于對特定的RNA 子集的分析而不降低準確性；（3）非腫瘤患者的血小板RNA 因年齡或各種非惡性疾病的變化；（4）在TEPs 達到可以檢出腫瘤的閾值時腫瘤細胞的多少；（5）TEPs 能否穩(wěn)健地檢出其他罕見突變。為了解決這些問題，各算法需要進一步驗證及改進，并且需要盡可能地研究探索NSCLC 與血小板、與TEPs 的RNA 譜改變的生物機制和病理生理效應(yīng)的關(guān)系。

目前尚未研究出敏感度高、特異度高、重復性好、檢測快的理想液體活檢方式，各液體活檢來源或方式在臨床應(yīng)用上各有千秋。ctDNA 可用于腫瘤的點突變、結(jié)構(gòu)變異、拷貝數(shù)變異、差異ctDNA 長度和甲基化狀態(tài)的檢測［18］，EVs中儲存著不同長度的蛋白質(zhì)和RNA生物標志物分子，其表面有與腫瘤轉(zhuǎn)移的器官特異性相關(guān)的表面膜蛋白［33］。COHEN等［34］開發(fā)了血液中cfDNA和蛋白質(zhì)特異性標記物組合的檢驗CancerSEEK，其能以69%～98%的敏感度，＞99%的特異度區(qū)分未發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移的癌癥患者（目前不具備篩查檢測卵巢癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、食管癌的功能）和健康受試者，這也提示多種液體活檢來源的聯(lián)合分析可促進腫瘤的早期診斷。

對于NSCLC，使用基于二代測序技術(shù)的液體活檢篩查早期NSCLC，隨著敏感性的增加，假陽性結(jié)果的風險增加［35］，在篩查結(jié)果呈陽性但無影像學異常的情況下，臨床醫(yī)師應(yīng)采取行動還是隨訪，將是未來需要解決的挑戰(zhàn)［36］。目前影像學檢查仍是肺癌早期診斷的主要手段，將低劑量CT 篩查與基于二代測序的液體活檢相結(jié)合，有望更早發(fā)現(xiàn)肺癌。

對各液體活檢來源分析流程標準化，尋找各疾病的新型液體活檢標志物并建立數(shù)據(jù)庫，聯(lián)合不同的液體活檢來源進行分析，以期通過液體活檢早期篩查、發(fā)現(xiàn)肺癌，提供NSCLC 的分期信息、個體治療的靶點及療效預測，以及進行疾病的監(jiān)測和盡早發(fā)現(xiàn)疾病復發(fā)。TEPs 的發(fā)現(xiàn)及研究擴充了液體活檢的途徑，為腫瘤尤其是NSCLC 的診療提供了展望，進一步在臨床的實踐、研究中檢驗不同標志物的適用范圍及效能，對將來疾病診療具有重要價值。