田程 許新華

1 三峽大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院（湖北宜昌443003）；2三峽大學(xué)腫瘤研究所/宜昌市中心人民醫(yī)院腫瘤科（湖北宜昌443003）

循環(huán)腫瘤細胞（circulating tumor cells，CTCs）指自發(fā)或因診療操作脫離原發(fā)灶或者轉(zhuǎn)移灶的具有高活力、高轉(zhuǎn)移潛能，進入外周血液循環(huán)的一類腫瘤細胞［1］。有研究表明［2］，CTCs 是腫瘤轉(zhuǎn)移的主要途徑，也是腫瘤篩查、診斷、預(yù)后、療效評估的重要標(biāo)志物。此外，也有學(xué)者表明［2-3］，CTCs 可以反映腫瘤細胞在特定疾病階段的異質(zhì)性，CTCs的基因型和分子特征有助于分析與治療相關(guān)的靶基因，識別具有潛在治療意義的新靶點分子，或發(fā)現(xiàn)潛在治療耐藥機制［4］。目前非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）仍然是全世界發(fā)病率及病死率最高的惡性腫瘤［5］，同時也是免疫治療及靶向治療靶點基因最多的惡性腫瘤［6］。因此，可將CTCs作為腫瘤組織標(biāo)本之外的實時樣本進行生物學(xué)特性研究，為NSCLC精準(zhǔn)個體治療提供指導(dǎo)。

1 CTCs 的捕獲方法研究

CTCs 檢測涉及兩方面的技術(shù)問題［7］，一是如何識別CTCs，二是如何從外周血中分離出來，目前在臨床運用的CTCs 捕獲技術(shù)大致有如下幾種。

1.1 Cellsearch 系 統(tǒng) 根 據(jù)HAYES 等［8］、DANILA 等［9］、COHEN 等［10］的試驗證實CTC 計數(shù)與乳腺癌、前列腺癌及結(jié)直腸癌患者預(yù)后相關(guān)，揭示CTC 的潛力后，F(xiàn)DA 批準(zhǔn)CellSearch 系統(tǒng)作為唯一用于臨床檢測CTCs 的技術(shù)。Cellsearch系統(tǒng)是一種基于磁免疫和染色的免疫細胞化學(xué)法，首先用上皮細胞黏附分子（epithelial cell adhesionmolecule，Ep-CAM）抗體磁珠富集CTCs，并在強力磁場下從血液中提取細胞，將分離的腫瘤細胞固定并用熒光抗體染色的角蛋白鑒定，然后用半自動四色熒光顯微鏡細胞檢測分析儀進行分析，最后把CKs 陽性和CD45陰性的有腫瘤細胞學(xué)特征的上皮細胞被定義為CTCs［11］。由于起源于上皮細胞的絕大多數(shù)肺癌都表達EpCAM，因此可以使用CTC、CXC和Profile試劑盒，利用與鐵水結(jié)合的抗EpCAM 抗體來檢測CTC，這種方法優(yōu)于單純使用EpCAM抗原富集CTC的技術(shù)［12］。

ONSTENK 等［13］將黑素瘤細胞黏附分子（melanoma cell adhesion molecule，MCAM）聯(lián)合EpCAM 作為細胞搜索富集標(biāo)記物以提高CTC 檢測率，研究顯示單純使用Ep-CAM 標(biāo)記物的CTC 檢出率為18%，MCAM 聯(lián)合EpCAM 檢測CTC 的檢出率則為25%，證實在Cellsearch 系統(tǒng)中使用MCAM 聯(lián)合EpCAM 作為富集標(biāo)記提高了CTCs 的檢測水平，但MCAM 陽性CTCs 在局限性或轉(zhuǎn)移性惡性腫瘤治療過程中的變化是否與臨床結(jié)果相關(guān)，需要進一步研究。此外，SOLER 等［14］指出，雖然Cellsearch 系統(tǒng)被認為是目前較標(biāo)準(zhǔn)的檢測方法，但其靈敏性仍有待提高，同時需要進一步開展臨床研究以證實其在NSCLC 中的臨床應(yīng)用價值。

1.2 PT-PCR 檢測法 PT-PCR 檢測法通過檢測外周血中特異mRNA 來間接檢測CTCs，因為CTCs 中存在某些只表達或高表達于腫瘤細胞而不表達于正常外周血細胞的特異性mRNA，因此可以作為特異性標(biāo)記物識別CTCs［15］。TEWES 等［16］及AKTAS 等［17］等研究證實利用RT-PCR 技術(shù)可高靈敏檢測出CTCs 并評估轉(zhuǎn)移性乳腺癌和卵巢癌的患者預(yù)后。與CellSearch 系統(tǒng)等利用免疫抗原的檢測方法相比，PT-PCR 檢測CTC 的敏感性相對較高。除了篩查CTCs，PT-PCR 法還能進一步將特異性的RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，隨后通過PCR 擴增，以進一步進行基因表型分析。因此PTPCR 檢測法具有高特異性、定量的優(yōu)點，而且需要的樣本量較少，但該方法的不足之處是干擾基因過多、假陽性率高及難以保持反應(yīng)的穩(wěn)定性。

1.3 ISET 檢測法 該方法在2000年由VONA 等［18］提 出，其利用CTCs 與正常細胞大小的差異，用8 μm 孔徑的濾膜篩出預(yù)先固定的外周血后，再將循環(huán)腫瘤細胞免疫染色后進行CTCs 計數(shù)及觀察分析細胞的形態(tài)特征［19］。LECHARPENTIER 等［20］采用ISET 富集CTCs，首次在非小細胞肺癌患者外周血中發(fā)現(xiàn)同時具有上皮和間質(zhì)表型的混合CTC，進一步揭示EMT 的意義以及轉(zhuǎn)移的機制。MAZZINI 等［21］通過ISET 對31 例葡萄膜黑色素瘤患者進行CTCs 檢測，并在17 例患者中檢測出單個CTC 或CTC 細胞簇，證實CTC 有作為葡萄膜黑色素瘤患者預(yù)后不良標(biāo)志物的作用。ISET優(yōu)點是它能在不破壞細胞形態(tài)的情況下分離上皮細胞，這一特性與它的高敏感性有關(guān)。因此ISET廣泛適用于許多人類癌癥循環(huán)腫瘤細胞的檢測。但與其他方法相比，ISET 法或許會漏檢部分體積較小的腫瘤細胞，需要對更多的細胞株和各種類型的腫瘤患者進一步研究以確定ISET 應(yīng)用的范圍及大小閾值［22］。

1.4 其他檢測方法 CTCs 的數(shù)量在血液中處于極低水平，被數(shù)十億外周血細胞所掩蓋，因此CTC 檢測技術(shù)需要較高的敏感性，以捕獲稀少的CTC，同時也需要較高特異性，以排除血液中正常細胞［23］。檢測方法必須是可重復(fù)、快速、經(jīng)濟、有效，并且可以進一步開展CTC 的單細胞基因表型的分析。

ZHANG 等［24］通過鐵磁抗體可以篩選高表達c-MET的循環(huán)腫瘤細胞原理開發(fā)了一種快速、無創(chuàng)、靈敏、特異的檢測MET 擴增型腫瘤細胞的方法。該方法對c-MET 高表達細胞的敏感度40%～80%，對c-MET 陰性細胞特異度100%。鑒于c-MET CTCs 與MET 擴增的相關(guān)性，c-MET CTCs 可能作為高表達cMET 的胃癌、結(jié)直腸癌和腎癌患者個體化治療的預(yù)測生物標(biāo)志物，但需要進一步研究以確定其臨床可靠性。MURLIDHAR 等［25］報道了OncoBean 芯片技術(shù)，它利用不同的剪切系數(shù)使CTC 在高流率下通過不同的親和性篩選出來，從乳腺癌、胰腺癌和肺癌患者的血液標(biāo)本中檢測的結(jié)果發(fā)現(xiàn)該技術(shù)的檢測CTC 的平均效率＞80%，其潛在的臨床應(yīng)用價值值得進一步研究。

2 CTCs 在NSCLC 中的臨床應(yīng)用價值

目前臨床應(yīng)用的血清腫瘤學(xué)標(biāo)志物以及高分辨率的影像學(xué)（增強CT、PETCT 或者MRI 等）檢查無法準(zhǔn)確的預(yù)判肺癌患者的進展、轉(zhuǎn)移以及復(fù)發(fā)［26］。而CTCs 不僅可以反映NSCLC 患者手術(shù)后亞臨床病灶的情況，還可以通過提取血液中的CTCs 進行基因表型分析，為個體化治療決策提供依據(jù)［27］。

2.1 CTCs 捕獲在診斷中的應(yīng)用 CTCs 檢測對于肺癌的早期診斷有一定優(yōu)勢。有研究表明，當(dāng)影像學(xué)可探測的結(jié)節(jié)性病變癌癥病灶直徑＞1 cm時［28］，肺癌患者外周血液中已經(jīng)可以檢測到CTCs［29］。肺癌的診斷及分期對治療至關(guān)重要，是提高總體生存率的關(guān)鍵，而精準(zhǔn)診斷則為個體化治療提供了基礎(chǔ)。目前臨床主要通過組織活檢明確腫瘤的基因突變類型，但有研究顯示，CTCs 有助于明確肺癌原發(fā)病灶的基因表型狀況，有利于提高肺癌診斷的精準(zhǔn)性［4，30］。MARCHETTI 等［31］等對EGFR 基因在晚期肺癌組織及其外周血CTCs 上表達水平分析比較，發(fā)現(xiàn)EGFR 基因在活檢組織與CTCs 表達水平具有一致性。因此，隨著近年CTCs 檢測技術(shù)的不斷優(yōu)化，敏感度和特異性不斷提高，其有望成為肺癌早期分子診斷的有益方法及技術(shù)［32］。

2.2 CTCs 檢測在肺癌療效評價中的應(yīng)用 手術(shù)、化療、靶向治療、免疫治療是目前肺癌主要的治療手段，在疾病進展或出現(xiàn)轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)之前能否進行有效評價是至關(guān)重要的。BAYARRI-LARA等［33］等前瞻性地分析了56 例NSCLC患者手術(shù)前和術(shù)后1 個月的CTCs 計數(shù)，術(shù)前每10 mL 外周血中平均有3.16 個CTCs，術(shù)后降低至0.66 個，且發(fā)現(xiàn)術(shù)后持續(xù)存在的CTCs 提示著腫瘤的早期復(fù)發(fā)（P=0.018）和較短的無進展生存期（P=0.008），反映了CTCs 評估肺癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險的價值。此外，CTCs 在實時監(jiān)測腫瘤耐藥方向也有一定的作用。有研究發(fā)現(xiàn)［34-36］，當(dāng)EGFR基因20號外顯子（T790M）突變時，對TKIs治療有效的腫瘤即會發(fā)生耐藥，導(dǎo)致非小細胞肺癌患者病情進展。因此，CTCs不僅可以評估治療效果，制定個體化的治療方案，甚至可以動態(tài)監(jiān)測腫瘤的耐藥狀態(tài)，進而分析腫瘤耐藥機制。

2.3 CTCs 檢查在肺癌靶向及免疫治療中的應(yīng)用 迄今為止在非小細胞肺癌中發(fā)現(xiàn)的靶點包括EGFR、BRAF、HER2、PI3K、ALK、ROS1 和MET 等［5，37］。如今，在超過50%的肺癌患者腫瘤組織中都可以檢測到特定的驅(qū)動基因作為治療的靶點，包括KRAS、EGFR 的點突變，F(xiàn)GFR1 高表達和ALK 重組。NI 等［38］等通過Cellsearch 系統(tǒng)檢測了7 個肺腺癌患者的循環(huán)腫瘤細胞，并進行全基因測序，該研究結(jié)果表明，在CTCs 中檢測到的單核酸變異（SNVs）都具有高度特異性，提示EGFR、PIK3CA、TP53 及RB1 等突變基因都可以通過CTCs 分析。因此，CTCs 捕獲聯(lián)合單細胞測序技術(shù)可以有效的評估患者的治療效果及早期監(jiān)測腫瘤耐藥情況［39］，但CTCs 中的基因突變能否能代表NSCLC 原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移灶的基因表型尚需要更多數(shù)據(jù)驗證。

MENG 等［40］等結(jié)合熒光原位雜交（Fish）技術(shù)檢測乳腺癌患者CTCs 中Her2 致癌基因的擴增情況，他們發(fā)現(xiàn)通過原發(fā)性腫瘤分析確定的Her2 狀態(tài)與他們的檢測的CTCs 之間有不一致性。其他研究［41-42］通 過IF 和RT-PCR 分 析CTCs 及腫瘤組織上Her2 基因同樣證實了這一現(xiàn)象。這表明最初Her2 陰性的患者可能在進展過程中發(fā)展為Her2 陽性的CTCs，同樣也可能證明了腫瘤的轉(zhuǎn)移伴隨者基因型的變化。

目前，采用Cellsearch系統(tǒng)與ISETVR技術(shù)相結(jié)合的CTC分析作為非小細胞肺癌患者靶向治療的預(yù)測性生物標(biāo)志物的臨床試驗（如NCT02372448、NCT02827344、NCT02554448）預(yù)計在2年內(nèi)可能得出結(jié)論［43］。此外，有WANG 等［44］利用晚期NSCLC 患者中CTCs 表面的PD-L1 狀態(tài)，作為免疫治療的療效預(yù)測指標(biāo)。ILIE 等［43］等利用自動免疫染色法從106 例NSCLC 患者外周血中檢測CTCs，在80 例（75%）患者檢測出CTCs。在71 個可評價的樣本中比較腫瘤活檢組織與CTCs，發(fā)現(xiàn)CTCs 的PD-L1 狀態(tài)與腫瘤組織中的PD-L1狀態(tài)一致，提示CTCs 作為一種有效的液體活檢方法有評估晚期NSCLC 免疫治療的價值。

3 結(jié)論

在過去的20年中，循環(huán)腫瘤細胞在基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用方面均取得了不少成果，其異質(zhì)性強、標(biāo)本獲取簡便、無創(chuàng)傷及可重復(fù)性等優(yōu)勢越來越被人們認可，且CTCs 對肺癌診斷、預(yù)后評價、個體化治療有重要意義。如今基于CTCs 物理及生物特性的檢測技術(shù)呈多樣化發(fā)展，捕獲CTCs 的效率越來越高，從而促進了單細胞基因測序及驅(qū)動基因相關(guān)研究，加快了CTCs 應(yīng)用于臨床的進程。但是，目前循環(huán)腫瘤細胞檢測仍無法取代組織活檢在肺癌中金標(biāo)準(zhǔn)的地位，主要是檢測時機及cut off 值的判定、技術(shù)方法的規(guī)范性、CTCs 與原發(fā)腫瘤的生物學(xué)特征的一致性等諸多問題還需要更深入的研究來回答。但作為一種簡便可行的液體活檢技術(shù)在肺癌個體化治療中有很好的運用價值前景。