肖剛 劉德珠 于穎

摘 要 本文以鯊魚皮為原料進(jìn)行膠原蛋白制備，確定了鯊魚皮為較好膠原蛋白來源，并對(duì)膠原蛋白制備工藝進(jìn)行優(yōu)化。通過正交試驗(yàn)表明，去除雜質(zhì)的較佳工藝是0.1 mol/L NaOH、1∶30料液比，處理4 h，其中NaOH濃度和料液比對(duì)處理結(jié)果有顯著影響；去除脂肪的較佳工藝是10%的乙醇、1∶10的料液比，處理16 h，其中，乙醇濃度和料液比對(duì)處理結(jié)果有極顯著影響，而處理時(shí)間對(duì)脫脂肪有顯著的效果。電泳結(jié)果表明，這些條件下制備的鯊魚皮源膠原蛋白質(zhì)量較高。

關(guān)鍵詞 膠原蛋白 鯊魚皮 提取制備

中圖分類號(hào)：TQ464.7 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1006-1533（2019）01-0066-04

Preparation of collagen from shark skin

XIAO Gang*， LIU Dezhu ，YU Ying**

（Shanghai Haohai Biotechnology Co.， Ltd.， Shanghai 201613， China）

ABSTRACT Shark skin was used as collagen preparation and determined to be a good source of collagen， and the collagen preparation process was optimized. The orthogonal test showed that the preferred process was to use 0.1 mol/L NaOH at 1：30 ratio of material to liquid and treat for 4 hours for impurities removal， and to use 10% ethanol at 1：10 ratio of material to liquid and treated for 16 hours for fat removal， in which the solvent concentrations and their ratio and time for treatment had a significant effect on the treatment results. The results of electrophoresis showed that the quality of collagen protein prepared from shark skin source is high under these conditions.

KEy WORDS collagen； shark skin； extraction preparation

膠原蛋白（collagen）是一類廣泛存在于生物體內(nèi)的一種纖維狀結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)， 根據(jù)分子結(jié)構(gòu)差異分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ等多種類型， 其中Ⅰ型膠原蛋白是生物體中最主要的存在形式， 其結(jié)構(gòu)特征是由兩條a1和一條a2肽鏈形成的三螺旋結(jié)構(gòu)。由于膠原蛋白具有良好的凝膠強(qiáng)度、乳化性、低黏度性[1]、生物相容性[2]及吸水和保濕性[3]等，近年來被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥和生物材料、化妝品等領(lǐng)域，其中膠原蛋白為原料所衍生的生物醫(yī)用材料，已成為醫(yī)用材料領(lǐng)域最快的增長(zhǎng)點(diǎn)之一。隨著膠原蛋白及生物材料臨床應(yīng)用研究的不斷進(jìn)展，膠原蛋白醫(yī)用材料的市場(chǎng)將會(huì)進(jìn)一步擴(kuò)大?，F(xiàn)階段膠原蛋白生物材料的來源主要是從牛跟腱與牛皮中提取，由于瘋牛病、禽流感、口碲疫等問題，國(guó)家對(duì)動(dòng)物組織來源的膠原蛋白產(chǎn)品實(shí)行嚴(yán)格控制，而海洋生物膠原蛋白由于其功能優(yōu)良、安全性好且低廉易得，因而在生物材料領(lǐng)域的開發(fā)和轉(zhuǎn)化前景廣闊。但由于海洋生物膠原蛋白的熱變性溫度較低等因素，限制它的實(shí)際應(yīng)用，需要通過多種方法和技術(shù)進(jìn)行改性處理，才能應(yīng)用于醫(yī)用材料的生產(chǎn)。

近些年已有從草魚、鱘魚、羅非魚等的皮膚及附屬物中制備膠原蛋白的報(bào)道[4-6]，但從鯊魚皮中提取膠原蛋白的報(bào)道較少。大青鯊（Prionace glauca）屬軟骨魚綱真鯊目真鯊科，鯊魚軟骨主要被用作提取硫酸軟骨素，鰭條被用作制備魚翅高附加值產(chǎn)品，而鯊魚皮是生產(chǎn)過程中的副產(chǎn)物，通常被用作飼料加工。本研究以大青鯊魚皮為原料，探索制備鯊魚皮源醫(yī)用膠原蛋白的制作工藝，并通過正交試驗(yàn)對(duì)傳統(tǒng)魚皮膠原蛋白的提取方法進(jìn)行改良和優(yōu)化，以期提高鯊魚皮的附加值，為膠原蛋白原料所衍生的生物醫(yī)用材料提供更可靠、安全的原料來源。

1 材料與實(shí)驗(yàn)方法

1.1 材料與試劑

鯊魚皮購(gòu)自浙江省某有限公司；鱈魚皮購(gòu)自上海市松江區(qū)易初蓮花超市。購(gòu)買后切除鯊魚頭、尾、軀干等部位的皮膚，取背部皮膚，清水反復(fù)沖洗后，置于- 20 ℃冰箱內(nèi)備用。胃蛋白酶（>10 000 U/kg），重慶江峽生化制藥有限公司；乙醇（藥用級(jí)），上海益醇化工有限公司；標(biāo)準(zhǔn)蛋白為Takara公司的Premixed Protein Marker （High）；其余化學(xué)試劑均購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 膠原蛋白制備方法

參考文獻(xiàn)制備膠原蛋白方法[7-8]對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。將鯊魚皮從-20 ℃取出后，用清水漂洗數(shù)次。將魚皮上的殘肉剔除后，剪成小塊，0.1 mol/L NaOH溶液去除雜蛋白，用去離子水漂洗，10%乙醇溶液進(jìn)行脫脂質(zhì)處理，去離子水漂洗；處理結(jié)束后，0.5 mol/L乙酸溶液浸泡30 min左右，粉碎，將粉碎的組織移入燒杯，加入0.5 mol/L乙酸溶液漂洗，混合少量的0.5 mol/L乙酸溶液溶解胃蛋白酶，以1∶1 000（重量比）稀釋，4 ℃攪拌提取3 d；將提取液于4 ℃ 4 000 g離心20 min，取上清，10 mol/L NaOH調(diào)pH至中性， 加固體NaCl至終濃度為2.5 mol/L，進(jìn)行鹽析；鹽析12 h后，4 ℃ 4 000 g離心20 min，取沉淀；用0.5 mol/L乙酸溶液復(fù)溶，復(fù)溶體積比300∶1。 用0.5 mol/L乙酸溶液透析1 d、純化水透析2 d，至透析液中無NaCl為止（滴加硝酸銀試液無沉淀產(chǎn)生），然后真空冷凍干燥，切割成50 mm′50 mm′5 mm的醫(yī)用膠原蛋白海綿。

1.3 正交試驗(yàn)

1.3.1 雜蛋白去除正交試驗(yàn)

同一批次處理的魚皮分成9份，每份2.0 g（按濕重計(jì)），根據(jù)3因素3水平設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)L9（34）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)（表1）。取上清液進(jìn)行蛋白含量測(cè)定。

1.3.2 脂質(zhì)去除正交試驗(yàn)

同上處理并進(jìn)行脂肪測(cè)定（表2）。

1.4 SDS-PAGE分析

參考文獻(xiàn)[9]方法，對(duì)鯊魚皮及鱈魚皮來源的膠原蛋白進(jìn)行分析。

1.5 數(shù)據(jù)分析

參考文獻(xiàn)[10]對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用軟件DPS 7.05 分析進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 正交試驗(yàn)

2.1.1 除雜蛋白

以NaOH濃度（A）、料液比（B）、處理時(shí)間（C）、空列（D）4種因素進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，以洗脫液雜蛋白量為考察指標(biāo)得到各種條件下鯊魚皮脫雜蛋白的最佳條件。正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與方差分析見表3和表4。

由表3和表4結(jié)果分析得，對(duì)鯊魚皮除蛋白最重要的因素依次為，NaOH濃度，料液比，處理時(shí)間，最佳的工藝處理?xiàng)l件為0.1 mol/L NaOH，1∶30料液比，處理時(shí)間為4 h。隨著NaOH濃度的提高，魚皮中的除雜蛋白的效果越好，但是過高的NaOH濃度可能會(huì)導(dǎo)致膠原蛋白降解，因此NaOH的濃度不宜選的太高，本實(shí)驗(yàn)最終選取的NaOH濃度為0.1 mol/L NaOH。楚水晶等[25]在對(duì)馬面魚皮膠原蛋白的制備中得到NaOH 溶液濃度從0～0.1 mol/L，浸出液中蛋白質(zhì)含量增加趨勢(shì)明顯，蛋白質(zhì)含量從 1.56%增加到5.28%，魚皮中大部分非膠原蛋白已經(jīng)溶出。料液比代表的是底物濃度，酶解過程中隨著底物濃度的不斷增大，雜蛋白的去除效果越好。隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，雜蛋白的去除效果越好，但當(dāng)雜蛋白基本完全溶出后，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)效果，效果變得不明顯且會(huì)對(duì)增加生產(chǎn)周期，成本提高，本實(shí)驗(yàn)處理時(shí)間的最優(yōu)結(jié)果為4 h。

應(yīng)用最佳工藝件進(jìn)行穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明在最佳條件下三次實(shí)驗(yàn)鯊魚皮脫雜蛋白量處于較高水平，平均值為（719.31±2.32）mg，這與正交實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果相一致，說明正交試驗(yàn)穩(wěn)定性有效。

2.1.2 除脂質(zhì)結(jié)果

以乙醇濃度（A）、料液比（B）、處理時(shí)間（C）、空列（D） 4種因素進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，以脂質(zhì)殘留量為考察指標(biāo)得到各種條件下鯊魚皮脫雜蛋白的最佳條件。正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與方差分析見表5和表6。

由表5和表6結(jié)果分析得，對(duì)鯊魚皮除蛋白最重要的因素依次為，乙醇濃度，料液比，處理時(shí)間，最佳的工藝處理?xiàng)l件為10%乙醇1∶30的料液比以及16 h處理時(shí)間。

應(yīng)用最佳工藝件進(jìn)行穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明在最佳條件下三次實(shí)驗(yàn)鯊魚皮脫脂質(zhì)量處于較高水平，平均值為（1.32±0.11）mg，優(yōu)于正交實(shí)驗(yàn)各條件下所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果，說明所得條件為去除鯊魚皮脂質(zhì)的最佳工藝參數(shù)。

2.2 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)電泳結(jié)果

電泳結(jié)果表明，鯊魚膠原蛋白包含一條a肽鏈（a1和a2，分子質(zhì)量介于100～120 kD之間）和一條b肽鏈（a肽鏈的二聚體）（圖1A）。該肽鏈組成特征與Ⅰ型膠原蛋白的肽鏈組成高度一致，說明提取所得的膠原蛋白樣品均屬Ⅰ型膠原。但是對(duì)照鱈魚皮膠原蛋白的電泳結(jié)果未見明顯條帶（圖1B），表明該方法對(duì)鱈魚皮膠原蛋白的提取不適用。

2.3 工業(yè)化生產(chǎn)及醫(yī)用膠原蛋白海綿質(zhì)量

將4.5 kg鯊魚皮按照上述處理方法進(jìn)行膠原蛋白的提取，共獲得50 mm′50 mm′5 mm膠原蛋白海綿4 683片，按照中華人民共和國(guó)醫(yī)藥行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)YY/T 1511 2017膠原蛋白海綿對(duì)獲得的鯊魚皮膠原蛋白進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明我們制備的鯊魚皮膠原蛋白質(zhì)量均高于膠原蛋白海綿行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，完全滿足醫(yī)用級(jí)要求（表7）。

3 討論

相對(duì)于傳統(tǒng)的膠原蛋白提取工藝，本研究建立的優(yōu)化鯊魚皮膠原蛋白提取工藝簡(jiǎn)單快捷，便于工業(yè)化放大，所制備的鯊魚皮膠原蛋白質(zhì)量符合醫(yī)用級(jí)使用要求。由于本研究側(cè)重于生產(chǎn)工藝的優(yōu)化，但對(duì)鯊魚皮膠原蛋白的熱穩(wěn)定性研究以及后續(xù)應(yīng)用上略有不足，希望在后續(xù)研究中能對(duì)鯊魚皮膠原蛋白與目前在醫(yī)用領(lǐng)域廣泛應(yīng)用的牛/豬等陸生動(dòng)物來源的膠原蛋白做一個(gè)更全面的對(duì)比研究，以期擴(kuò)大鯊魚皮膠原蛋白在醫(yī)療領(lǐng)域中的應(yīng)用。

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