崔香香，白飛榮，于學(xué)健，白秀彬，許 玲，于盼盼，姚 粟*

（1.中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司 中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，北京 100015；2.山東扳倒井股份有限公司，山東 淄博 256300）

中國白酒是世界著名的六大蒸餾酒之一，是一種以谷物為原料、酒曲為糖化發(fā)酵劑、采用雙邊或固態(tài)糖化發(fā)酵生產(chǎn)的酯香濃郁的蒸餾酒[1]。大曲作為白酒釀造過程中的糖化、發(fā)酵和生香劑，具有豐富的微生物和酶系，對白酒的風(fēng)味和口感起關(guān)鍵性的作用[2]。因此，在我國傳統(tǒng)釀酒行業(yè)一直流傳著“曲乃酒之骨”[3-4]的說法。由于多種微生物富集在大曲里且在制曲過程中自然生長起來，因此整個大曲微生物復(fù)雜而多樣[5]。

散囊菌屬（Eurotium）真菌大量存在于傳統(tǒng)發(fā)酵食品生產(chǎn)過程中，具有產(chǎn)多種生物酶以及吲哚衍生物、二酮哌嗪等活性次級代謝產(chǎn)物的性能[6-7]，可催化發(fā)酵食品中各種相關(guān)物質(zhì)發(fā)生氧化、聚合、降解、轉(zhuǎn)化，是一種重要的功能微生物類群。如茯磚茶中的“金花菌”-“冠突散囊菌（Eurotium cristatum）”，可產(chǎn)生多酚氧化酶、阿魏酸酯酶、酯化酶、纖維素酶、蛋白酶等多種生物酶，并具有降脂、降壓、調(diào)節(jié)糖代謝、抗氧化、抑菌等功能[8-9]。目前，在傳統(tǒng)白酒生產(chǎn)領(lǐng)域有關(guān)散囊菌的研究主要集中在分離鑒定水平，已有文獻(xiàn)顯示[10-12]，冠突散囊菌（E.cristatum）、謝瓦散囊菌（E.cheva lieri）、阿姆斯特丹散囊菌（E.amstelidami）均可分離自白酒大曲，其中謝瓦散囊菌在清香型、濃香型及濃香型大曲中均可分離到，且為濃香型和醬香型大曲中的優(yōu)勢真菌[12-13]，但對這些菌種在白酒大曲中的相關(guān)功能研究較少。

本研究通過多相鑒定和響應(yīng)面方法[14]對該菌種進(jìn)行分類學(xué)研究及培養(yǎng)條件優(yōu)化，旨在提高其生物量，后期該菌種將主要以菌粉或菌劑形式強(qiáng)化于白酒大曲生產(chǎn)中，以達(dá)到提高大曲阿魏酸酯酶活性及改善大曲風(fēng)味特征的效果，從而進(jìn)一步提高酒體品質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗(yàn)菌株

散囊菌（Eurotium）CICC 41584：分離于山東扳倒井股份有限公司中高溫大曲，保藏于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（China Center of Industrial Culture Collection，CICC）。

1.1.2 化學(xué)試劑

蔗糖、葡萄糖、乳糖、麥芽糖、果糖、麥芽糖、纖維二糖、可溶性淀粉：廣東汕頭西隴化工有限公司；酵母浸粉、牛肉浸粉、蛋白胨、大豆蛋白胨、胰蛋白胨：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；硫酸銨、硝酸銨、MgSO4、FeSO4、CaCl2、KCl、NaCl、K2HPO4（均為分析純）：北京化學(xué)試劑公司；真菌脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）基因組提取試劑盒：生工生物工程股份有限公司。試驗(yàn)所用試劑均為分析純或生化試劑。

1.1.3 培養(yǎng)基

察氏瓊脂培養(yǎng)基（Czapek dox agar，CDA）、麥芽浸粉肉湯培養(yǎng)基（malt extract broth，MEB）：北京陸橋技術(shù)股份有限公司；API20C AUX試劑盒：生物梅里埃（中國）公司。

CDA培養(yǎng)基：蔗糖30 g/L，KCl 0.5 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g/L，K2HPO41.0 g/L，NaNO33.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，瓊脂15.0 g/L，自然pH，121℃滅菌15 min。

MEB培養(yǎng)基：麥芽浸粉20g/L，自然pH，121℃滅菌15min。

基礎(chǔ)生長培養(yǎng)基：在MEB培養(yǎng)基中添加蔗糖40 g/L，自然pH，121℃滅菌15 min。

1.2 儀器與設(shè)備

Olympus BH-2光學(xué)顯微鏡：奧林巴斯有限公司；Hitachi SU8010掃描電鏡：日本HITACHI公司；Tprofessional standard 96 Gradient聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀：德國Biometra公司；FE20型pH計(jì)：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；BHG-8082型恒溫培養(yǎng)箱、THZ-98C恒溫振蕩培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；SHB-III循環(huán)水式多用真空泵：鄭州長城科工貿(mào)有限公司；CS101-3D電熱鼓風(fēng)干燥箱：重慶四達(dá)試驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌株CICC 41584多相分類學(xué)鑒定

采用多相分類學(xué)鑒定技術(shù)對菌株CICC 41584的形態(tài)特征觀察、生理生化試驗(yàn)以及分子生物學(xué)進(jìn)行研究。

形態(tài)學(xué)觀察：將菌株CICC 41584接種到察氏瓊脂培養(yǎng)基上，25℃恒溫培養(yǎng)7 d，觀察菌落形態(tài)特征，并使用光學(xué)顯微鏡觀察菌體特征。收集新鮮菌體，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.5%的戊二醛，在4℃條件下固定過夜，離心收集菌體，使用pH 7.2、濃度100 mmol/L的磷酸鹽緩沖液漂洗3次。分別使用體積分?jǐn)?shù)50%、70%、85%、95%的乙醇溶液梯度脫水，無水乙醇脫水3次后使用臨界冷凍干燥儀進(jìn)行二氧化碳臨界點(diǎn)干燥，再通過噴金-離子濺射儀進(jìn)行噴金后，使用Hitachi SU8010掃描電鏡觀察菌絲及其孢子的形態(tài)特征[15]。

生理生化試驗(yàn)：采用API 20 C AUX試劑盒測定菌株CICC 41584對碳源底物的利用能力[16]。具體操作過程：首先將新鮮菌體加到0.85%NaCl緩沖液中，制備成2 McFarland菌懸液，準(zhǔn)確吸取100μL菌懸液加到試劑盒培養(yǎng)基中，混勻后，滴加到API 20 C AUX試劑條中，25℃培養(yǎng)5 d，觀察試驗(yàn)結(jié)果。

分子生物學(xué)鑒定：使用真菌DNA基因組試劑盒提取DNA，具體操作步驟見試劑盒說明書。利用引物Bt2a（5'GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC3'）和Bt2b（5'ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC'）擴(kuò)增β-tubulin基因[17]。PCR反應(yīng)體系：10×PCR Buffer 5μL，脫氧核糖核苷三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphate，dNTPs）（2.5 mmol/L）4 μL，模板2μL，Taq DNA聚合酶1μL，引物各1μL，補(bǔ)充去離子水至50μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性50 s，55℃退火50 s，72 ℃延伸50 s，33個循環(huán)；72 ℃再延伸7 min[18]。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物使用1.0%的瓊脂糖進(jìn)行驗(yàn)證后，送于北京諾賽基因組研究中心有限公司進(jìn)行測序。將測序結(jié)果在美國國家生物技術(shù)信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行相似性比對，采用Blast程序進(jìn)行同源性序列分析，使用MEGA 5.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[19]。

1.3.2 種子液制備

菌種活化：將甘油保藏的菌株CICC 41584接種于CYA察式平板培養(yǎng)基中，待培養(yǎng)物產(chǎn)生大量黃色孢子后連續(xù)轉(zhuǎn)接3次，備用。

種子液制備：挑取一環(huán)活化好的菌株接入裝有200 mL液體的MEB培養(yǎng)基中，于28℃、120 r/min條件下恒溫振蕩培養(yǎng)7 d，制備成種子液。

1.3.3 培養(yǎng)條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

碳源確定：在MEB培養(yǎng)基中分別添加葡萄糖、蔗糖、果糖、麥芽糖、乳糖、纖維二糖、可溶性淀粉（添加量為40 g/L）。接種量2%，裝液量50 mL/250 mL，28℃、120 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)7 d，培養(yǎng)結(jié)束之后用定性濾紙過濾，在80℃干燥箱中烘干至恒質(zhì)量，測定菌絲干質(zhì)量，毎組3個平行試驗(yàn)，考察不同碳源對菌絲干質(zhì)量的影響。

氮源確定：在碳源優(yōu)化的培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，分別添加酵母浸粉、NH4NO3、胰蛋白胨、蛋白胨、大豆蛋白胨、硫酸銨、牛肉浸粉（添加量為10 g/L），其他成分不變。接種量2%，裝液量50 mL/250 mL，28℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)7 d，測定菌絲干質(zhì)量，考察不同氮源對菌絲干質(zhì)量的影響。

無機(jī)鹽確定：在碳源、氮源優(yōu)化的培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，分別添加K2HPO4、MgSO4、FeSO4、CaCl2、KCl、NaCl（添加量為5 g/L），其他成分不變。接種量2%，裝液量50 mL/250 mL，28℃、120 r/min培養(yǎng)7 d，測定菌絲干質(zhì)量，考察不同無機(jī)鹽對菌絲干質(zhì)量的影響。

1.3.4 培養(yǎng)條件優(yōu)化Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在確定碳源、氮源以及無機(jī)鹽種類的基礎(chǔ)上，選取影響菌絲干質(zhì)量的發(fā)酵時間、pH值、接種量、裝液量、轉(zhuǎn)速及溫度共9個因素進(jìn)行Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)2個空項(xiàng)以估計(jì)試驗(yàn)誤差，每個因素選高低2個水平，以（-1，+1）編碼各值[20]，利用Design Expert 10.0軟件對其進(jìn)行N=12的Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以菌絲干質(zhì)量（Y）作為響應(yīng)值，每組試驗(yàn)設(shè)置3個平行[21]。Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因子與水平如表1所示。

1.3.5 培養(yǎng)條件優(yōu)化最陡爬坡試驗(yàn)

根據(jù)表1試驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析結(jié)果，從眾多因素中篩選出對菌絲干質(zhì)量影響較大的3個顯著因素，以此來確定各因素的水平，爬坡方向和步長，能快速、經(jīng)濟(jì)地逼近最佳值區(qū)域，來確定響應(yīng)面分析的中心點(diǎn)[22-23]，進(jìn)而對選出的3個顯著因素進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)[24]。

1.3.6 培養(yǎng)條件優(yōu)化Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)對酵母浸粉、硫酸鎂以及發(fā)酵時間進(jìn)行優(yōu)化，以菌絲干質(zhì)量（g/100 mL）為響應(yīng)值，每個因素的3個水平以（-1，0，+1）編碼，每個試驗(yàn)點(diǎn)進(jìn)行3次平行試驗(yàn)[25]。Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因子與水平見表2。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 2 Factors and levels of Box-Behnken experimental design

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株CICC 41584多相分類學(xué)鑒定

2.1.1 形態(tài)學(xué)鑒定

菌株CICC 41584在察氏瓊脂培養(yǎng)基上25℃培養(yǎng)7 d，菌落形態(tài)鑒定及鏡檢測定結(jié)果如圖1所示。由圖1a可知，菌落直徑30～31 mm，中央黃褐色，周圍蛋黃色；中心凸起；質(zhì)地絲絨狀；反面淺橙黃色；無滲出液產(chǎn)生，無可溶性色素產(chǎn)生；由圖1b和1c可知，菌絲黃色具飾，纏繞、較細(xì)；閉囊殼大量，黃褐色，存在于具飾菌絲網(wǎng)中，直徑150～200μm，成熟后破裂釋放出大量子囊；子囊近球形或橢圓形，長軸直徑10～20μm，內(nèi)含8個子囊孢子；由圖1d可知，子囊孢子雙凸鏡形，中部具雞冠狀凸起，長軸直徑為5.0～7.5μm；未見分生孢子結(jié)構(gòu)。

圖1 菌株CICC 41584的形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果Fig.1 Morphological observation results of strain CICC 41584

2.1.2 生理生化特征分析

表3 菌株CICC 41584的碳源利用結(jié)果Table 3 Carbon source utilization results of strain CICC 41584

由表3可知，菌株CICC 41584能夠很好地利用D-葡萄糖、甘油、L-阿拉伯糖、D-木糖、側(cè)金盞花醇、D-半乳糖、山梨醇、D-蔗糖、D-棉子糖；菌株對木糖醇、肌醇、D-麥芽糖表示弱生長；不能利用2-酮基-葡萄糖酸鹽、α-甲基-D-葡萄糖、N-乙酰葡萄糖胺、纖維二糖、D-乳糖、海藻糖、D-松叁糖。

2.1.3 分子生物學(xué)鑒定

將菌株CICC 41584測序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Nucleotide blast比對，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖2所示。

圖2 基于β-tubulin基因菌株CICC 41584的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain CICC 41584 based onβ-tubulin gene

由圖2可知，菌株CICC 41584與謝瓦散囊菌（Eurotium chevalieri）NRRL78 T處于同一系統(tǒng)發(fā)育支，序列的相似性為100%，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征和生理生化試驗(yàn)結(jié)果，鑒定菌株CICC 41584為謝瓦散囊菌（Eurotium chevalieri），其無性型名稱為謝瓦曲霉（Aspergillus chevalieri）。

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 碳源對菌絲干質(zhì)量的影響

圖3 不同碳源對菌絲干質(zhì)量的影響Fig.3 Effect of different carbon sources on dry mass of mycelium

不同碳源對菌絲干質(zhì)量的影響結(jié)果見圖3。由圖3可知，菌株CICC 41584以蔗糖為碳源時，菌絲干質(zhì)量最高，能達(dá)到0.21 g/100 mL。因此，選擇蔗糖為后續(xù)試驗(yàn)的碳源。

2.2.2 氮源對菌絲干質(zhì)量的影響

不同氮源對菌絲干質(zhì)量的影響結(jié)果見圖4。由圖4可知，不同的氮源對菌絲產(chǎn)生量的影響較大，酵母浸粉作為氮源時菌絲干質(zhì)量最高，能達(dá)到0.97 g/100 mL。因此，選擇酵母浸粉為最佳氮源。

圖4 不同氮源對菌絲干質(zhì)量的影響Fig.4 Effect of different nitrogen sources on dry mass of mycelium

2.2.3 無機(jī)鹽對菌絲干質(zhì)量的影響

不同無機(jī)鹽對菌絲干質(zhì)量影響結(jié)果見圖5。由圖5可知，不同無機(jī)鹽對菌絲干質(zhì)量影響較大，硫酸鎂作為無機(jī)鹽時菌絲干質(zhì)量最高，能達(dá)到1.01 g/100 mL。因此，選擇硫酸鎂為最佳無機(jī)鹽。

圖5 不同無機(jī)鹽對菌絲干質(zhì)量的影響Fig.5 Effect of different inorganic salts on dry mass of mycelium

2.3 Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果

通過Design Expert10.0軟件進(jìn)行N=12的Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)，每組試驗(yàn)設(shè)置3個平行，取平均值，結(jié)果見表4，方差分析結(jié)果見表5。

由表5可知，9個因素中的對響應(yīng)值影響的顯著順序?yàn)榻湍附郏景l(fā)酵時間＞硫酸鎂＞裝液量＞蔗糖＞轉(zhuǎn)速＞接種量＞溫度＞pH值，其中酵母浸粉的影響最為顯著，硫酸鎂、發(fā)酵時間有顯著影響。另外，該試驗(yàn)?zāi)Ｐ偷腜=0.038 4＜0.05，表明該模型是顯著的。決定系數(shù)R2=0.991 3，表明這個方程能解釋變量響應(yīng)值的99.13%。調(diào)整決定系數(shù)R2Adj=0.952 4，表明該方程的擬合度較好。此外，還可以看出其中酵母浸粉、發(fā)酵時間對菌絲量的影響呈正效應(yīng)，硫酸鎂對菌絲量的影響呈負(fù)效應(yīng)。

經(jīng)分析獲得的一次回歸方程為：Y=0.66+0.028A+0.14B-0.073C-5.833E-003D+6.667E-003E+0.076F-0.078G-0.017H+1.000E-002I

表4 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 4 Design and results of Plackett-Burman experiments

表5 Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 5 Variance analysis of Plackett-Burman experiments results

2.4 最陡爬坡試驗(yàn)

根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果選取酵母浸粉、硫酸鎂、發(fā)酵時間3個顯著因素進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表6。由表6可知，隨著酵母浸粉、硫酸鎂以及發(fā)酵時間的變化，菌絲干質(zhì)量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。當(dāng)酵母浸粉25 g/L、硫酸鎂2.5 g/L、發(fā)酵時間10 d時，菌絲干質(zhì)量最大，能達(dá)到1.88 g/100 mL，因此選為中心點(diǎn)，進(jìn)行Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)。

表6 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 6 Design and results of the steepest ascent experiments

2.5 Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果

采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，利用Design Expert 10.0軟件進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析。以酵母浸粉（A）、硫酸鎂（B）、發(fā)酵時間（C）為自變量，菌絲干質(zhì)量（R）為響應(yīng)值，試驗(yàn)結(jié)果見表7，方差分析見表8。

應(yīng)用Design Expert 10.0軟件對表7中的數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到的二次回歸方程為：

由表7和表8可知，回歸模型的決定系數(shù)R2=0.954 5，F(xiàn)值=16.63，P值=0.000 7＜0.01，達(dá)到極顯著水平，失擬項(xiàng)的F值=0.085 1＞0.05，說明失擬項(xiàng)不顯著，方程的擬合程度較好。另外，一次項(xiàng)A的P＜0.01，說明酵母浸粉的影響極顯著。交互項(xiàng)AC、BC的P＜0.05，說明酵母浸粉和發(fā)酵時間及硫酸鎂和發(fā)酵時間之間的交互作用顯著。根據(jù)二次回歸方程得到的響應(yīng)面圖如圖6所示。

表7 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 7 Design and results of Box-Behnken experiments

表8 回歸模型方差分析Table 8 Variance analysis of regression model

由圖6可知，硫酸鎂與發(fā)酵時間對菌絲干質(zhì)量的交互作用極顯著（P＜0.01），酵母浸粉與發(fā)酵時間對菌絲干質(zhì)量的交互作用顯著（P＜0.05），酵母浸粉與硫酸鎂對菌絲干質(zhì)量的交互作用不顯著（P＞0.05）。

圖6 酵母浸粉、硫酸鎂、發(fā)酵時間交互作用對菌絲干質(zhì)量影響的響應(yīng)面及等高線Fig.6 Response surface plots and contour line of effects of interaction between yeast powder,MgSO 4,fermentation time on dry mass of mycelium

根據(jù)上述模型，通過軟件分析得到的最佳培養(yǎng)條件為酵母浸粉27.201 g/L、硫酸鎂2.553 g/L、發(fā)酵時間10 d，預(yù)測得到的菌絲干質(zhì)量為1.945 g/100 mL。為方便實(shí)際操作，修改培養(yǎng)條件為酵母浸粉27.2 g/L、硫酸鎂2.6 g/L、發(fā)酵時間10 d，在最佳培養(yǎng)條件下進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，獲得的菌絲干質(zhì)量的平均值為1.950 g/100 mL，與理論預(yù)測值接近，說明該模型可行。

3 結(jié)論

本研究采用多相鑒定方法確定了分離自白酒大曲中菌株CICC 41584的分類學(xué)地位，并采用單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面法對其培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化。鑒定結(jié)果表明，該菌株為謝瓦散囊菌（Eurotium chevalieri）。采用單因素試驗(yàn)確定了最佳碳源、氮源、無機(jī)鹽分別為蔗糖、酵母浸粉、硫酸鎂；通過Plackett-Burman試驗(yàn)篩選出顯著影響菌絲干質(zhì)量的因素為酵母浸粉、硫酸鎂和發(fā)酵時間，并通過Box-Behnken試驗(yàn)確定了最優(yōu)培養(yǎng)條件為蔗糖添加量40 g/L、酵母浸粉添加量27.2 g/L、硫酸鎂添加量為2.6 g/L、溫度28℃、培養(yǎng)時間10 d、轉(zhuǎn)速120 r/min、接種量2%、裝液量50 mL/250 mL。在此優(yōu)化培養(yǎng)條件下，菌絲干質(zhì)量能達(dá)到1.950 g/100 mL，較優(yōu)化之前提高了8.29倍，將為該菌株的進(jìn)一步生物學(xué)功能研究、及其白酒大曲中的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。