賀富強(qiáng)，楊慧敏，李 周，曾禮蘭，胡 承*

（四川大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610064）

細(xì)菌纖維素（bacterial cellulose，BC）是由木葡糖醋桿菌（Gluconacetobacter xylinus）等微生物發(fā)酵產(chǎn)生的纖維素，其與木質(zhì)纖維素的化學(xué)組成相同，均由D-葡萄糖分子通過β-1,4-糖苷鍵聚合而成。細(xì)菌纖維素具有高持水性、高機(jī)械強(qiáng)度、超精細(xì)（納米級）、高純度（不含有半纖維素和木質(zhì)素等雜質(zhì)）和良好的生物相容性及可降解性等獨(dú)特性質(zhì)[1]。因此，BC在各個(gè)領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注與應(yīng)用，包括生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域（用于組織工程支架、傷口敷料、人造皮膚與血管等）、食品領(lǐng)域、污水凈化領(lǐng)域、造紙領(lǐng)域以及光學(xué)、電磁等領(lǐng)域[2-5]。但BC高昂的生產(chǎn)成本和較低的產(chǎn)量，極大的制約了細(xì)菌纖維素的工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用。因此，尋找適宜、廉價(jià)的培養(yǎng)底物以降低生產(chǎn)成本且提高BC產(chǎn)量仍是細(xì)菌纖維素研究的重點(diǎn)。

近些年，國內(nèi)外報(bào)道了許多利用廉價(jià)原料生產(chǎn)細(xì)菌纖維素的研究。這些原料大多數(shù)為工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的副產(chǎn)物（如酒糟浸出液、黃水、油脂廢棄物、各類果汁、棉花以及玉米和小麥秸稈等[6-9]）。酒糟是釀酒行業(yè)產(chǎn)生的最大的副產(chǎn)物，其中含有豐富的淀粉、蛋白質(zhì)、纖維素、脂肪等營養(yǎng)物質(zhì)。若不能合理利用，不僅會對資源造成浪費(fèi)，還會造成環(huán)境污染。因此，本研究將濃香型白酒丟糟酶解液按不同添加量加到HS培養(yǎng)基中，探究酒糟酶解液對木葡糖醋桿菌產(chǎn)BC的影響，以實(shí)現(xiàn)廉價(jià)酒糟向具有高附加值的BC的轉(zhuǎn)化，并降低BC的生產(chǎn)成本。同時(shí)，以酶解液為對照，研究玉米漿、乙醇、MgSO4、Na2HPO4、黃水和檸檬酸分別對木葡糖醋桿菌發(fā)酵酒糟酶解液生產(chǎn)BC的影響，篩選具有促進(jìn)作用的物質(zhì)，更好地利用白酒丟糟，進(jìn)一步提高BC產(chǎn)量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

木葡糖醋桿菌（Gluconacetobacter xylinu s）G29：由本實(shí)驗(yàn)室篩選和保藏；酒糟：水井坊公司提供；黃水：采樣于水井坊公司水井街基地窖池，4℃冰箱保存。玉米漿：魯洲生物科技四川有限公司。

乙醇、葡萄糖、蛋白胨、酵母粉、檸檬酸、氫氧化鈉、Na2HPO4·12H2O、瓊脂、鹽酸（均為分析純或生化試劑）：成都市科隆化學(xué)品有限公司；對羥基苯甲酸酰肼（p-hydroxybenzoic acid hydrazide，HBAH）（分析純）：上海麥克林生化科技有限公司；淀粉酶（酶活100 000 U/g）：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；纖維素酶（酶活200 000 U/g）：山東隆大生物工程有限公司。

Herstin-Schramm（HS）培養(yǎng)基[10]：葡萄糖20 g/L，蛋白胨5 g/L，酵母粉5 g/L，檸檬酸1 g/L，Na2HPO45 g/L，pH 5.8，115℃滅菌30 min。

固體培養(yǎng)基：HS培養(yǎng)基內(nèi)加入20 g/L的瓊脂，115℃滅菌30 min。

1.2 儀器與設(shè)備

SQPPRACTUM224-ICN電子天平：賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；PHS-2C筆式pH計(jì)：上海康儀儀器有限公司；101型電熱鼓風(fēng)干燥箱、HWS-150恒溫恒濕培養(yǎng)箱：北京中興偉業(yè)儀器有限公司；Synergy H1全功能酶標(biāo)儀：美國BioTek公司。

1.3 方法

1.3.1 木葡糖醋桿菌種子液的制備

將保藏于4℃冰箱的木葡糖醋桿菌接種到新的固體培養(yǎng)基上，在28℃的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h。然后，挑取固體培養(yǎng)基中的單菌落轉(zhuǎn)接到HS培養(yǎng)基中，在28℃、150 r/min條件下，搖床振蕩培養(yǎng)24 h。

1.3.2 酒糟酶解液的制備

將酒糟與去離子水按照1∶4的體積比混合，在28℃條件下攪拌3 h后于4 000 r/min條件下離心10 min，抽濾將酒糟浸出液（還原糖含量為1.13 g/L）與酒糟濾渣分離，并于4℃保存。將酒糟濾渣放入80℃的烘箱中干燥48 h后粉碎，過60目篩，加入少許去離子水?dāng)嚢柚梁隣?，放入高壓蒸汽滅菌鍋?nèi)，120 ℃預(yù)處理15 min。再按照固液比為1∶10（g∶mL）加入酒糟浸出液，以60 000 U/g纖維素的含量添加纖維素酶，在pH 4.8、55℃條件下酶解8 h，獲得酶解液1（還原糖含量為9.23 g/L），冷卻至室溫后，以2 000 U/g淀粉的含量添加糖化酶，在pH 4.0、60℃條件下酶解3 h，反應(yīng)結(jié)束后，100℃滅酶10 min，抽濾獲得終酶解液（還原糖含量為21.29 g/L），并置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 不同酶解液添加比例對木葡糖醋桿菌發(fā)酵產(chǎn)BC的影響

將酶解液按培養(yǎng)液總體積的0、25%、50%、75%、100%的體積比與HS培養(yǎng)基混合，配制50 mL酶解液-HS發(fā)酵培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)pH值為5.8，裝入250 mL錐形瓶中，115℃滅菌30 min。以HS培養(yǎng)基為對照，按10%的接種量分別接入木葡糖醋桿菌種子液，28℃條件下靜置培養(yǎng)7 d，測定發(fā)酵終止后發(fā)酵液的還原糖含量、還原糖轉(zhuǎn)換率、pH值和BC產(chǎn)量。

1.3.4 不同效應(yīng)因子對酶解液發(fā)酵生產(chǎn)BC的影響

在酶解液中分別添加一定量的單一效應(yīng)因子，配制成50 mL體系的發(fā)酵培養(yǎng)基，115℃滅菌30 min，效應(yīng)因子與添加量如表1所示，以10%的接種量接入木葡糖醋桿菌種子液，28℃靜置培養(yǎng)7 d，測定BC產(chǎn)量。

表1 效應(yīng)因子與添加水平Table 1 Effect factors and addition levels

1.3.5 分析檢測

還原糖的測定：采用對羥基苯甲酸酰肼（HBAH）法[11]；總酸的測定：參考GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》；pH的測定：參考GB 5009.237—2016《食品pH值的測定》。

細(xì)菌纖維素產(chǎn)量測定：將發(fā)酵產(chǎn)生的BC膜，用清水反復(fù)沖洗、浸泡至色素不再溶出，再將膜放入0.5 mol/L的NaOH溶液中，80℃浸泡2 h，以除去菌體蛋白和殘留的培養(yǎng)基，然后置于80℃蒸餾水中反復(fù)洗滌至中性，該過程重復(fù)兩次。將洗滌后的BC膜置于烘箱中80℃烘干至恒質(zhì)量。BC產(chǎn)量及還原糖轉(zhuǎn)化率計(jì)算公式如下：

1.3.6 數(shù)據(jù)分析

每組實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3個(gè)平行，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用SPSS22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 酒糟酶解液成分分析

測定酒糟酶解液總酸、還原糖含量和pH值，結(jié)果見表2。

表2 酒糟酶解液理化指標(biāo)測定結(jié)果Table 2 Determination results of physical and chemical indexes of vinasse enzymatic hydrolysate

由表2可知，酒糟酶解液中含有21.29 g/L的還原糖，與HS培養(yǎng)基中還原糖的含量（20 g/L）大致相同。此外，酶解液的總酸含量為13.48 g/L，含有大量的有機(jī)酸，這些成分可以作為葡糖醋桿菌發(fā)酵的能量物質(zhì)，減少還原糖的消耗，更有利于BC的合成[12]。

2.2 不同酶解液添加量對發(fā)酵產(chǎn)BC的影響

以HS培養(yǎng)基為對照，不同酶解液添加量對BC產(chǎn)量、還原糖轉(zhuǎn)換率和發(fā)酵液pH的影響結(jié)果見表3。

表3 酶解液添加量對細(xì)菌纖維素產(chǎn)量、還原糖轉(zhuǎn)化率和發(fā)酵液p H的影響Table 3 Effect of enzymatic hydrolysate addition on bacterial cellulose yield,reducing sugar conversion and pH of fermentation broth

由表3可知，隨著酶解液添加量的增加，BC產(chǎn)量和還原糖轉(zhuǎn)化率均呈現(xiàn)持續(xù)上升的趨勢，并在酶解液添加量為100%時(shí)，BC產(chǎn)量和還原糖轉(zhuǎn)化率均達(dá)到最高，分別為4.84 g/L和31.54%，與對照組的BC產(chǎn)量（2.06 g/L）和還原糖轉(zhuǎn)化率（13.48%）相比，分別提高了135.3%和134.0%。這可能是因?yàn)槊附庖褐泻械挠袡C(jī)酸等物質(zhì)作為能源物質(zhì)，為菌體提供了生存繁殖的能量，減少了還原糖的消耗，促進(jìn)還原糖轉(zhuǎn)化為細(xì)菌纖維素[13]。發(fā)酵液pH值隨著酶解液添加比的增加呈現(xiàn)先升后降的趨勢，當(dāng)完全由酶解液發(fā)酵產(chǎn)細(xì)菌纖維素時(shí)，pH值為4.64，與對照組的pH（3.60）相比，顯著提高（P＜0.05）。葡糖醋桿菌發(fā)酵生產(chǎn)細(xì)菌纖維素的最適pH值為4.0～6.0。酶解液為葡糖醋桿菌發(fā)酵產(chǎn)細(xì)菌纖維素提供了良好的pH條件。這是因?yàn)槠咸烟亲鳛樘荚窗l(fā)酵生產(chǎn)BC時(shí)會產(chǎn)生大量的葡萄糖酸，使培養(yǎng)基pH值降低，不利于發(fā)酵后期BC的產(chǎn)生[14]，而酶解液中含有的有機(jī)酸不僅可以作為能源物質(zhì)供菌體生長繁殖，進(jìn)而促進(jìn)更多的葡萄糖轉(zhuǎn)化為BC，還可以為發(fā)酵液提供有效的緩沖作用，使發(fā)酵液的pH保持穩(wěn)定。結(jié)果表明，酶解液可提高BC產(chǎn)量和還原糖轉(zhuǎn)化率，并使發(fā)酵液pH穩(wěn)定在利于BC合成的范圍內(nèi)。因此，酶解液可作為發(fā)酵培養(yǎng)基直接用于細(xì)菌纖維素的生產(chǎn)。

2.3 效應(yīng)因子對酶解液發(fā)酵產(chǎn)BC的影響

2.3.1 玉米漿添加量對酶解液發(fā)酵產(chǎn)BC的影響

以不添加玉米漿的酶解液為對照，分別添加2%、4%、6%、8%和10%的玉米漿，28℃靜置培養(yǎng)7 d，不同玉米漿添加量對BC產(chǎn)量的影響如圖1所示。

圖1 玉米漿添加量對細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的影響Fig.1 Effect of corn syrup addition on bacterial cellulose yield

由圖1可知，隨著玉米漿添加量的升高，BC產(chǎn)量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，當(dāng)玉米漿添加量為4%時(shí)，BC產(chǎn)量最高，為5.91 g/L，比對照組酶解液的BC產(chǎn)量（4.84 g/L）提高了22.1%。這可能是因?yàn)橛衩诐{中含有大量的蛋白質(zhì)和乳酸，不僅可以為葡糖醋桿菌的生長繁殖提供氮源，而且乳酸還可以作為碳源物質(zhì)，減少菌體繁殖時(shí)還原糖的消耗，進(jìn)而提高還原糖的轉(zhuǎn)化率與BC的產(chǎn)量。同時(shí)，玉米漿具有較強(qiáng)的緩沖效應(yīng)，有利于發(fā)酵液pH的穩(wěn)定，促進(jìn)BC的產(chǎn)生[15]。當(dāng)玉米漿添加量＞8%之后，BC的產(chǎn)量開始受到抑制，產(chǎn)量逐漸低于對照組。當(dāng)玉米漿添加量達(dá)到10%時(shí)，BC產(chǎn)量已減少為4.5 g/L?？赡苁怯捎谶^量的玉米漿導(dǎo)致發(fā)酵液內(nèi)不利于BC產(chǎn)生的物質(zhì)增加，從而抑制了BC的合成[16]。因此，酶解液中玉米漿的最佳添加量為4%。

2.3.2 黃水添加量對酶解液發(fā)酵產(chǎn)BC的影響

以不添加黃水的酶解液為對照，分別添加5%、10%、15%、20%、25%的黃水，28℃靜置培養(yǎng)7 d，不同黃水添加量對BC產(chǎn)量的影響如圖2所示。

圖2 黃水添加量對細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的影響Fig.2 Effect of yellow water addition on bacterial cellulose yield

由圖2可知，細(xì)菌纖維素的產(chǎn)量隨黃水添加量的增加，呈現(xiàn)先快速增加后又急速下降的趨勢。當(dāng)黃水添加量為10%時(shí)，BC產(chǎn)量達(dá)到最大為7.05 g/L，是對照組BC產(chǎn)量（4.99 g/L）的1.41倍。但隨著黃水添加量的繼續(xù)升高，BC產(chǎn)量開始急速下降，當(dāng)黃水添加量為25%時(shí)，BC產(chǎn)量僅為3.33 g/L，只有對照組BC產(chǎn)量的66.7%。黃水是釀酒過程中產(chǎn)生的另一副產(chǎn)物，含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，其中乳酸、乙酸等物質(zhì)的含量較高，它們均可以被葡糖醋桿菌利用，提高BC的產(chǎn)量[17]。但黃水添加量的增加也會使黃水中不利于菌體生存繁殖的物質(zhì)（如糠醛）積累，從而減少BC的產(chǎn)量[18]。因此，黃水的最適添加量為10%。

2.3.3 硫酸鎂對酶解液發(fā)酵產(chǎn)BC的影響

以不添加MgSO4的酶解液為對照，探究MgSO4添加量（0.2 g/L、0.4 g/L、0.6 g/L、0.8 g/L、1.0 g/L）對酶解液發(fā)酵產(chǎn)BC的影響。

如圖3所示，隨著硫酸鎂添加量的增加，細(xì)菌纖維素的產(chǎn)量先上升后逐漸趨于平緩。當(dāng)硫酸鎂添加量在0～0.6 g/L范圍增加時(shí)，BC產(chǎn)量也從4.84 g/L提高至5.51 g/L。硫酸鎂的增效作用主要可能是由于Mg2+是微生物生長繁殖的重要酶激活劑，參與糖酵解、三羧酸循環(huán)等重要代謝途徑。在葡糖醋桿菌的合成代謝中，Mg2+能夠激活鳥苷酸環(huán)化酶，生成環(huán)狀鳥苷酸，以激活纖維素合成酶的活性，從而能夠有效的提高BC的產(chǎn)量[19]。但當(dāng)硫酸鎂添加量＞0.6 g/L之后，BC產(chǎn)量趨于平緩，沒有明顯的提高。因此，酶解液中硫酸鎂的最適添加量為0.6 g/L。

2.3.4 檸檬酸對酶解液發(fā)酵產(chǎn)BC的影響

以不添加檸檬酸的酶解液為對照，探究檸檬酸添加量（0.5 g/L、1.0 g/L、1.5 g/L、2.0 g/L、2.5 g/L）對酶解液發(fā)酵產(chǎn)BC的影響，結(jié)果見圖4。

如圖4所示，BC產(chǎn)量隨檸檬酸添加量的增加，呈現(xiàn)先上升后略有下降的趨勢。當(dāng)檸檬酸添加量為1.5 g/L時(shí)，BC產(chǎn)量最大為6.08 g/L，與對照組酶解液的BC產(chǎn)量相比，提高了25.6%。隨著檸檬酸添加量的繼續(xù)增加，BC產(chǎn)量緩慢降低。在培養(yǎng)基內(nèi)加入有機(jī)酸，主要是作為能源物質(zhì)，促進(jìn)菌體生長繁殖。檸檬酸可參與三羧酸循環(huán)，產(chǎn)生更多能量，加速菌體生長，可減少還原糖的消耗，提高還原糖的轉(zhuǎn)化率，從而提高BC的產(chǎn)量[20]。因此，檸檬酸的最適添加量為1.5 g/L。

圖4 檸檬酸添加量對細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of citric acid addition on bacterial cellulose yield

2.3.5 乙醇對酶解液發(fā)酵產(chǎn)BC的影響

以不添加乙醇的酶解液為對照，分別添加0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%的用0.22μm過濾除菌的乙醇，28℃靜置培養(yǎng)7 d。不同乙醇添加量對BC產(chǎn)量的影響如圖5所示。

圖5 乙醇添加量對細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的影響Fig.5 Effect of ethanol addition on bacterial cellulose yield

研究證明在培養(yǎng)基中加入少量的乙醇能夠顯著的提高BC產(chǎn)量，主要是因?yàn)橐掖疾粌H能夠作為能源物質(zhì)，在培養(yǎng)前期提供大量的能量，加速菌體生長繁殖，而且還可以減少不產(chǎn)細(xì)菌纖維素的陰性菌的產(chǎn)生，進(jìn)而提高BC的產(chǎn)量[17]。由圖5可知，隨著乙醇添加量在0.2%～1.0%范圍內(nèi)的增加，BC產(chǎn)量呈現(xiàn)先增加后急劇降低的趨勢，且在乙醇添加量為0.8%時(shí)，BC產(chǎn)量最大為5.83 g/L；乙醇添加量＞0.8%之后，BC產(chǎn)量有所下降。因此，乙醇的最適添加量為0.8%。

2.3.6 磷酸氫二鈉對酶解液發(fā)酵產(chǎn)BC的影響

以不添加磷酸氫二鈉的酶解液為對照，探究磷酸氫二鈉添加量（1 g/L、2 g/L、3 g/L、4 g/L、5 g/L）對酶解液發(fā)酵生產(chǎn)BC產(chǎn)量的影響，結(jié)果見圖6。

如圖6所示，隨著Na2HPO4·12H2O添加量在1～5 g/L范圍內(nèi)的增加，BC產(chǎn)量呈現(xiàn)先升高后緩慢降低的趨勢；當(dāng)Na2HPO4·12H2O添加量為2 g/L時(shí)，BC產(chǎn)量最高為6.56 g/L，是對照組酶解液BC產(chǎn)量的1.32倍；因此，Na2HPO4·12H2O的最佳添加量為2 g/L。

圖6 Na2HPO4·12H2O添加量對細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的影響Fig.6 Effect of Na2HPO4·12H2O addition on bacterial cellulose yield

3 結(jié)論

由于傳統(tǒng)培養(yǎng)基生產(chǎn)細(xì)菌纖維素的低效性和高成本，因此將酒糟酶解液按不同體積比添加到HS培養(yǎng)基中發(fā)酵合成細(xì)菌纖維素。結(jié)果表明，酶解液完全替代HS培養(yǎng)基時(shí)，細(xì)菌纖維素產(chǎn)量最大為4.84 g/L，與HS培養(yǎng)基相比提高了135.3%；還原糖轉(zhuǎn)化率為31.54%，比HS培養(yǎng)基提高了134.0%。HS培養(yǎng)基中加入酒糟酶解液后，可有效維持發(fā)酵液pH值的穩(wěn)定。因此，酒糟酶解液可直接作為發(fā)酵培養(yǎng)基，用于細(xì)菌纖維素的合成。

玉米漿、黃水、MgSO4、檸檬酸、乙醇和Na2HPO4對酶解液發(fā)酵葡糖醋桿菌合成細(xì)菌纖維素均有促進(jìn)作用，最適添加量分別為4%、10%、0.6 g/L、1.5 g/L、0.8%和2 g/L，細(xì)菌纖維素最大產(chǎn)量分別為5.91 g/L、7.05 g/L、5.51 g/L、6.08 g/L、5.83 g/L和6.56 g/L，其中黃水的增效作用最為顯著，BC產(chǎn)量是HS培養(yǎng)基的3.4倍。

酒糟中含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，僅僅利用酒糟浸出液不能完全發(fā)揮出酒糟用于BC生產(chǎn)的潛力，而酒糟酶解液直接用于發(fā)酵生產(chǎn)細(xì)菌纖維素，不需添加其他營養(yǎng)物質(zhì)也能獲得較高的BC產(chǎn)量，并且添加另一種釀酒副產(chǎn)物黃水后，能夠進(jìn)一步的提高BC產(chǎn)量。這表明，釀酒過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物在BC低成本生產(chǎn)中具有極大的潛力。