游 樂，姜舟婷

(中國計(jì)量大學(xué) 理學(xué)院，浙江 杭州 310018)

生物體系是一個(gè)復(fù)雜開放的體系，與環(huán)境進(jìn)行著物質(zhì)交換，其中包括納米顆粒通過呼吸系統(tǒng)、消化道、皮膚等組織，進(jìn)入到人體血液循環(huán)系統(tǒng)，從而到達(dá)全身[1]。當(dāng)納米顆粒與蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用后，不僅可以誘導(dǎo)蛋白質(zhì)的構(gòu)象以及功能的改變[2-3]，也可以引起納米材料的電荷性質(zhì)、表面親疏水性等物理化學(xué)性質(zhì)的變化，影響納米粒子在機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生的生物效應(yīng)[4-5]。因此深入研究分子水平下納米顆粒與蛋白質(zhì)的相互作用以及納米顆粒作用下蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)特征和動(dòng)力學(xué)行為，對于充分認(rèn)識(shí)生命現(xiàn)象，控制生物過程乃至發(fā)明新型藥物和診療方法，都具有重要的意義。

金屬型納米顆粒是極其重要的一類納米材料，它具有較大的比表面積，較高的表面能和表面晶體缺陷等特點(diǎn)，體現(xiàn)出金屬材料和納米材料的雙重特性，這些特性使得金屬型納米顆粒在分子造影、生物靶向、磁性分離、藥物輸運(yùn)等諸多生物醫(yī)藥領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用[4-6]。譬如金納米顆粒能夠引起包含蛋白質(zhì)在內(nèi)的生物分子的彈性、形態(tài)、運(yùn)動(dòng)、黏附及入侵等性能的改變，并對干細(xì)胞的增殖分化產(chǎn)生影響[7]。將金納米粒子作為藥物的載體，可以提高藥物局部濃度[8-9]。但無論通過何種途徑進(jìn)入血液中的納米顆粒表面會(huì)迅速被血液蛋白包裹，形成納米顆粒-蛋白質(zhì)冠，它是納米顆粒在生命體內(nèi)的真實(shí)身份，因此對納米顆粒-蛋白質(zhì)復(fù)合體的整體研究顯得尤為重要。

計(jì)算機(jī)模擬方法直接基于原子水平對納米顆粒與蛋白質(zhì)相互作用方式進(jìn)行研究，已被越來越多的科學(xué)家所采納。如CHARCHAR等[10]用模擬的方法研究納米Au顆粒和生物表面的相互影響。LIN等[11]采用Monte Carlo模擬納米Au顆粒在輻射醫(yī)療過程中作為放射致敏劑與輻射源的關(guān)系。國內(nèi)相關(guān)領(lǐng)域的研究工作也有所進(jìn)展。南京大學(xué)的馬余強(qiáng)教授帶領(lǐng)的課題組模擬細(xì)胞膜上納米顆粒輸運(yùn)蛋白質(zhì)過程[12]。南京大學(xué)王煒教授課題組利用粗?；腿幽Ｐ脱芯苛说鞍踪|(zhì)吸附在納米顆粒上的構(gòu)型相變及去折疊過程[13-14]。復(fù)旦大學(xué)的左光宏采用分子動(dòng)力學(xué)模擬研究納米顆粒對于蛋白質(zhì)構(gòu)象與功能的影響以及由此帶來的生物納米毒性[15]。這些工作加深了對生物分子與納米顆粒結(jié)合、解離過程的理解，也推動(dòng)了整個(gè)研究的進(jìn)展。但同時(shí)我們也看到該領(lǐng)域還存在許多爭議的問題，如蛋白質(zhì)和納米顆粒之間存在廣泛的能量交換和幾何影響，這些因素是如何相互競爭最終獲得穩(wěn)定的構(gòu)型，蛋白質(zhì)與金屬型納米顆粒的結(jié)合和解離過程與自然拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的異質(zhì)度有很大的統(tǒng)計(jì)相關(guān)，但組態(tài)系綜的物理圖景并不清晰，因此對蛋白質(zhì)和納米顆粒的相互作用體系，金屬型納米顆粒涉及的轉(zhuǎn)化機(jī)制和影響因素有待進(jìn)一步研究。

在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的研究中，往往根據(jù)其基本組成單位氨基酸的排列順序和空間結(jié)構(gòu)，將蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)分為四個(gè)層次：一級(jí)結(jié)構(gòu)、二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)、四級(jí)結(jié)構(gòu)。其中α螺旋結(jié)構(gòu)(α-helix)、β折疊結(jié)構(gòu)(β-sheet)、轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)(turn)和無規(guī)線團(tuán)結(jié)構(gòu)(coil)是蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的最基本形式[16]。在本研究中，我們采用分子動(dòng)力學(xué)模擬的方法研究全α型蛋白質(zhì)1 BBL在不同粒徑的金納米顆粒影響下，其結(jié)構(gòu)特征及構(gòu)象轉(zhuǎn)變的動(dòng)力學(xué)過程，探索納米顆粒與蛋白質(zhì)的結(jié)合方式和作用機(jī)理，從分子水平了解納米顆粒與生命體系的相互影響，為拓寬納米顆粒在醫(yī)學(xué)診斷、藥物輸運(yùn)、基因治療、生物仿生等方面的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 模型及計(jì)算方法

以大腸桿菌二氫脂酰胺脫氫酶(E3)為蛋白質(zhì)樣品(PDB code:1 BBL)，它由37個(gè)氨基酸組成，二級(jí)結(jié)構(gòu)中存在2個(gè)α螺旋片段(No.15-23氨基酸和No.41-47氨基酸)。模擬盒子大小約為5.3 nm×5.3 nm×5.3 nm，添加4 413個(gè)TIP3P水分子體現(xiàn)溶劑效應(yīng)。1 BBL本身帶有一個(gè)單位正電荷，需在水盒子中加入1個(gè)氯離子使系統(tǒng)呈中性。金納米顆粒的構(gòu)建在金晶胞的基礎(chǔ)上擴(kuò)展，采用4種不同大小的納米顆粒和1 BBL蛋白質(zhì)進(jìn)行相互作用，用NP4、NP32、NP108、NP256來表示不同尺寸的納米顆粒，其中下標(biāo)數(shù)字表示組成納米顆粒的金原子數(shù)目。采用CHARMM27力場并利用NAMD2.6軟件對蛋白質(zhì)-納米顆粒復(fù)合體系執(zhí)行分子動(dòng)力學(xué)模擬[17]。整個(gè)體系首先進(jìn)行能量最小化，然后在恒溫恒壓下(壓強(qiáng)和溫度分別為1 atm(1 atm=101.3 kPa)和310 K)進(jìn)行12 ns的分子動(dòng)力學(xué)模擬。非鍵相互作用的截?cái)喟霃骄嚯x為1.2 nm。為了比較納米顆粒對蛋白質(zhì)的作用，我們也模擬了不加納米顆粒情況下蛋白質(zhì)的動(dòng)力學(xué)過程。模擬采用周期性邊界條件，并用Langevin算法控制溫度和壓強(qiáng)[18-19]。

蛋白質(zhì)的均方根偏差(root mean square deviation, RMSD)通常被用來描述其結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，其定義為

(1)

其中，N為組成蛋白質(zhì)的原子數(shù)目，rfinal(i)和rinitial(i)分別是第i個(gè)原子在模擬過程中的當(dāng)前結(jié)構(gòu)和初始結(jié)構(gòu)坐標(biāo)。均方根偏差體現(xiàn)了蛋白質(zhì)構(gòu)象相對變化程度，它可以作為衡量體系是否達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡的重要指標(biāo)。

結(jié)構(gòu)參量回轉(zhuǎn)半徑(radius of gyration,Rg)描述蛋白質(zhì)分子的整體尺寸，標(biāo)志著蛋白質(zhì)分子的疏松程度?；剞D(zhuǎn)半徑值越大說明體系越松散?；剞D(zhuǎn)半徑Rg的定義為

(2)

其中N是體系中蛋白質(zhì)原子的數(shù)量，r(i)和rcenter分別是第i原子的坐標(biāo)和質(zhì)心的坐標(biāo)。

(3)

其中，ttotal為總模擬時(shí)間。在本文中主要研究蛋白質(zhì)骨架碳原子的漲落情況，由此判斷蛋白質(zhì)分子運(yùn)動(dòng)的自由程度。

本文中，我們將對蛋白質(zhì)1 BBL在不同大小的金納米顆粒作用下的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、松散程度和蛋白質(zhì)骨架碳原子的自由程度進(jìn)行分析。采用STRIDE算法研究蛋白質(zhì)1 BBL的二級(jí)結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變過程。除了結(jié)構(gòu)參數(shù)以外，蛋白質(zhì)體系的各部分能量及蛋白質(zhì)內(nèi)部、蛋白質(zhì)和水分子的氫鍵數(shù)目也將作統(tǒng)計(jì)分析。這些研究結(jié)果將為理解蛋白質(zhì)在納米顆粒作用下的結(jié)構(gòu)特征和動(dòng)力學(xué)行為提供了理論支持。

2 結(jié)果與討論

2.1 體系能量分析

本文選取了五個(gè)不同的模擬體系研究納米顆粒的大小對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響。在分子動(dòng)力學(xué)模擬中，勢能部分包含了所有分子內(nèi)和分子間相互作用的全部信息。這里構(gòu)成蛋白質(zhì)體系的勢能包括鍵能和非鍵能。其中鍵能包括鍵伸縮能、鍵彎曲能、二面角扭轉(zhuǎn)能等，非鍵能包括范德華能和靜電能。計(jì)算各個(gè)原子的勢能梯度，即可得出該原子在分子力場中所受到的力，進(jìn)一步分析出原子的運(yùn)動(dòng)行為。表1為不同的模擬體系在平衡后的各部分能量數(shù)據(jù)。

表1 蛋白質(zhì)-金納米顆粒相互作用體系平衡態(tài)各部分能量

從表1中的數(shù)據(jù)，我們看到不同大小的納米顆粒與蛋白質(zhì)1 BBL作用，蛋白質(zhì)的鍵能隨著納米顆粒尺寸的增加而增加，這主要來源于鍵扭轉(zhuǎn)能的貢獻(xiàn)。納米顆粒大小的改變對蛋白質(zhì)分子鍵伸縮能和鍵彎曲能的影響相對較小。鍵扭轉(zhuǎn)能的增加，說明蛋白質(zhì)分子形成更為松散的結(jié)構(gòu)。納米顆粒大小的改變對蛋白質(zhì)能量影響最大的是范德華能，隨著原子數(shù)目的增加，更多的原子—原子對之間形成兩兩相互作用，使得范德華能隨著納米顆粒尺寸增加而顯著下降。而這部分能量是影響體系總勢能下降的根本原因，這說明非鍵相互作用對穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)起到關(guān)鍵的因素。

2.2 結(jié)構(gòu)參數(shù)分析

對于全原子的分子動(dòng)力學(xué)模擬，在體系能量達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡后，對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)進(jìn)行采集分析。其中均方根偏差(RMSD)用于衡量原子振動(dòng)幅度的大小，從而體現(xiàn)蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。圖1為不同的模擬體系的均方根偏差值隨模擬時(shí)間的變化。從圖1中，我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)小納米顆粒和蛋白質(zhì)相互作用時(shí)，蛋白質(zhì)的RMSD值稍稍減小，但隨著組成納米顆粒的金原子數(shù)目增加，RMSD的值略微增加。當(dāng)組成納米顆粒的金原子數(shù)目小于32，即納米顆粒的尺寸在0.61 nm以下時(shí)，納米顆粒的大小對蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性影響不大，RMSD的平均值大小為0.26 nm。隨著組成納米顆粒的原子數(shù)目進(jìn)一步增加，納米顆粒尺寸增大，RMSD也急劇增大，在NP256金納米顆粒的作用下，蛋白質(zhì)1 BBL的RMSD增加到0.59 nm。此外，在較大金納米顆粒的作用下，RMSD達(dá)到穩(wěn)定值所需的特征時(shí)間更短。

圖1 不同大小的金納米顆粒作用下蛋白質(zhì)1 BBL的均方根偏差(RMSD)隨模擬時(shí)間的變化

我們同時(shí)研究了蛋白質(zhì)的回轉(zhuǎn)半徑隨模擬時(shí)間的變化，見圖2(a)。回轉(zhuǎn)半徑體現(xiàn)了蛋白質(zhì)分子的松散程度。從圖中我們得到與RMSD變化趨勢接近的規(guī)律。在蛋白質(zhì)體系中加入小納米顆粒NP4，蛋白質(zhì)的回轉(zhuǎn)半徑基本不變；隨著納米顆粒尺寸的增加，蛋白質(zhì)回轉(zhuǎn)半徑明顯增加。當(dāng)納米顆粒NP256和蛋白質(zhì)相互作用體系中，蛋白質(zhì)的回轉(zhuǎn)半徑從不加納米顆粒的0.93 nm增加到1.33 nm。氫鍵對穩(wěn)定蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)的起了重要的作用。圖2(b)給出了不同模擬體系中的氫鍵數(shù)目的平均值，包括蛋白質(zhì)分子內(nèi)的氫鍵數(shù)目，蛋白質(zhì)分子和水分子間的氫鍵數(shù)目以及體系總的氫鍵數(shù)目，并和蛋白質(zhì)的回轉(zhuǎn)半徑平均值進(jìn)行比較。從圖2(b)中我們看出，蛋白質(zhì)和水分子之間的氫鍵數(shù)目大約是蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的氫鍵數(shù)目的6～10倍。隨著納米顆粒尺寸的增加，不管是蛋白質(zhì)內(nèi)部的氫鍵還是蛋白質(zhì)與水分子之間的氫鍵數(shù)目都在下降，其中蛋白質(zhì)內(nèi)部氫鍵數(shù)目的下降更為明顯，在NP256納米顆粒的作用下，蛋白質(zhì)內(nèi)部的氫鍵數(shù)目僅為不加納米顆粒時(shí)的1/3。這和蛋白質(zhì)回轉(zhuǎn)半徑的大小隨納米顆粒尺寸的變化規(guī)律恰恰相反，即隨著體系中納米顆粒的增加，蛋白質(zhì)變得更松散，同時(shí)，起到穩(wěn)定結(jié)構(gòu)作用的氫鍵數(shù)目在減少，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)也變得更不穩(wěn)定。圖2(b)中還同時(shí)給出了蛋白質(zhì)1BBL在不加納米顆粒以及與納米顆粒NP32和NP256相互作用時(shí)平衡態(tài)的典型構(gòu)型圖。圖2(b)中，我們發(fā)現(xiàn)在不加納米顆粒時(shí)，蛋白質(zhì)2個(gè)雙螺旋結(jié)構(gòu)保持得很好；加了小納米顆粒時(shí)，一個(gè)雙螺旋結(jié)構(gòu)比較明顯，蛋白質(zhì)回轉(zhuǎn)半徑在增加；當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)和大納米顆粒作用時(shí)，回轉(zhuǎn)半徑進(jìn)一步增大，2個(gè)雙螺旋結(jié)構(gòu)都被破壞。

圖2 不同大小的金納米顆粒作用下蛋白質(zhì)1BBL的回轉(zhuǎn)半徑(Rg)隨模擬時(shí)間的變化以及平均氫鍵數(shù)目與平均回轉(zhuǎn)半徑的比較

蛋白質(zhì)在不同大小的納米顆粒作用下，其均方根偏差和回轉(zhuǎn)半徑的變化規(guī)律說明納米顆粒的大小對體系的結(jié)構(gòu)及穩(wěn)定性有影響。這種影響在大尺寸的納米顆粒中更明顯，原因在于隨著組成大納米顆粒的原子數(shù)目增加，更多的原子-原子對參與到和蛋白質(zhì)分子的兩兩相互作用，范德華勢能對穩(wěn)定體系起到關(guān)鍵因素。也正因?yàn)榧{米顆粒外層原子對蛋白質(zhì)的吸引作用，使得蛋白質(zhì)的回轉(zhuǎn)半徑隨著納米顆粒尺寸的增加而增加，形成更為松散的結(jié)構(gòu)。此外，從均方根漲落的數(shù)據(jù)中，我們還能發(fā)現(xiàn)是哪幾個(gè)氨基酸殘基最容易受到納米顆粒的影響(見圖3)。在圖3中，蛋白質(zhì)1BBL在NP32納米顆粒的作用下，氨基酸序列為21-31片段的均方根漲落值有增加，其他片段和不加納米顆粒的情況下基本相同，甚至更低。但在NP256納米顆粒的影響下，幾乎組成整條蛋白質(zhì)鏈的氨基酸殘基的方根漲落值都比體系不存在納米顆粒的情況下要大。氨基酸序列15-23及31-44片段增加得特別明顯，這基本對應(yīng)了蛋白質(zhì)1BBL的兩個(gè)α螺旋片段，說明其二級(jí)結(jié)構(gòu)受到納米顆粒的影響，發(fā)生轉(zhuǎn)變。下面將對蛋白質(zhì)1BBL在不同納米顆粒作用下的二級(jí)結(jié)構(gòu)演變作一詳細(xì)討論。

圖3 組成蛋白質(zhì)的不同氨基酸中心碳原子的均方根波動(dòng)值

2.3 二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

蛋白質(zhì)1 BBL的初始結(jié)構(gòu)中包括2個(gè)α螺旋片段，分別是氨基酸序列號(hào)No.15-23和No.41-47的氨基酸殘基構(gòu)成。蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)分析可以用來監(jiān)測蛋白質(zhì)的折疊過程與突變造成蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化以及配體的結(jié)合對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響等。利用VMD軟件中STRIDE算法可以得出蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，這是一個(gè)基于知識(shí)學(xué)習(xí)法則，它考慮氫鍵能量并統(tǒng)計(jì)蛋白質(zhì)扭轉(zhuǎn)角，把蛋白質(zhì)的三維空間結(jié)構(gòu)信息歸納到氨基酸序列的不同二級(jí)結(jié)構(gòu)。為了便于比較，我們選取NP0、NP32、NP256三種納米顆粒作用下蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)隨模擬時(shí)間的演變過程，如圖4。在沒有加入納米顆粒的單鏈蛋白質(zhì)1BBL模擬體系中，整個(gè)模擬時(shí)間內(nèi)，兩個(gè)α螺旋二級(jí)結(jié)構(gòu)還被保持得很好，沒有解旋的現(xiàn)象。當(dāng)模擬體系中加入納米顆粒NP32之后，氨基酸序列No.15-23片段的α螺旋二級(jí)結(jié)構(gòu)基本還能保持，僅僅偶爾出現(xiàn)螺旋結(jié)構(gòu)長度減小的情況；但是總體螺旋結(jié)構(gòu)沒有破壞，而氨基酸序列No.41-47片段原本的α螺旋結(jié)構(gòu)會(huì)演變成轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)，并在轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)和α螺旋結(jié)構(gòu)之間反復(fù)變換。因此相比較而言后者的螺旋結(jié)構(gòu)更不穩(wěn)定，容易受到納米顆粒的影響。當(dāng)納米顆粒的尺寸進(jìn)一步增加，蛋白質(zhì)1BBL在NP256的作用下，2個(gè)螺旋結(jié)構(gòu)都被解旋，形成轉(zhuǎn)角或者無規(guī)線團(tuán)的松散結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性將大大降低。因此，從二級(jí)結(jié)構(gòu)演變的角度，我們也可以得到相同的結(jié)論，即納米顆粒尺寸越大，對蛋白質(zhì)的相互作用越明顯，蛋白質(zhì)形成更為松散的結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性進(jìn)一步減弱。

圖4 蛋白質(zhì)1 BBL二級(jí)結(jié)構(gòu)在NP0和NP32以及NP256三種納米顆粒作用下隨模擬時(shí)間的變化

3 結(jié) 語

文中采用分子動(dòng)力學(xué)模擬的方法研究不同尺寸的金納米顆粒對蛋白質(zhì)1BBL的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、整體尺寸及骨架碳原子的運(yùn)動(dòng)自由程度的影響，以及其二級(jí)構(gòu)象在納米顆粒作用下的轉(zhuǎn)變過程，并結(jié)合體系的勢能(特別是范德華能)和氫鍵數(shù)目的變化，從能量角度分析結(jié)構(gòu)變化的原因。結(jié)果表明，組成納米顆粒的原子數(shù)目增加，會(huì)使得模擬體系中的原子-原子相互作用對增多，范德華能量銳減，這是體系總勢能減少的根本原因。此外，納米顆粒尺寸的增加，會(huì)使蛋白質(zhì)形成更為松散的結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性減弱。氫鍵數(shù)目隨著納米顆粒尺寸的增加而呈下降的趨勢，特別是蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的氫鍵數(shù)目下降明顯，這同樣說明了在納米顆粒的作用下，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性在降低，納米顆粒的尺寸越大，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性越差。從蛋白質(zhì)1BBL的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析中，我們還發(fā)現(xiàn)氨基酸序列No.41-47片段的α螺旋結(jié)構(gòu)比No.15-23的α螺旋結(jié)構(gòu)更容易受到外部納米顆粒的影響解旋為轉(zhuǎn)角或者無規(guī)線團(tuán)的結(jié)構(gòu)，這個(gè)結(jié)論在蛋白質(zhì)骨架碳原子的均方根漲落規(guī)律中同樣獲得體現(xiàn)。這些研究結(jié)果為理解全α型蛋白質(zhì)在納米顆粒作用下結(jié)構(gòu)特征和動(dòng)力學(xué)行為提供了基本的解釋。接下來，我們還會(huì)繼續(xù)研究其他類型的蛋白質(zhì)在納米顆粒作用下的結(jié)構(gòu)變化情況，希望這些從分子水平的研究結(jié)果能為人們利用納米顆粒在生物醫(yī)藥方面的應(yīng)用提供理論支持。