閻紅琳，黃文先，饒潔，袁靜萍

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院，武漢430060)

微小RNA(miRNA)是一類通過(guò)與其靶mRNA的3′-UTR互補(bǔ)結(jié)合促進(jìn)mRNA降解或抑制mRNA翻譯，從而負(fù)性調(diào)控靶蛋白表達(dá)的小RNA[1]。miRNA在多種人類疾病的病理生理過(guò)程中發(fā)揮作用。缺血性腦卒中是由腦供血不足引起的急性腦血管病，具有發(fā)病率高、致殘率高、病死率高的特點(diǎn)[2]。局灶性腦缺血會(huì)引起大量神經(jīng)細(xì)胞凋亡。研究表明，繼發(fā)性神經(jīng)元死亡是腦梗死的主要原因，導(dǎo)致腦卒中后長(zhǎng)期神經(jīng)功能缺損[3]。腦缺血時(shí)神經(jīng)元損傷的確切機(jī)制尚不完全清楚，但最近的研究表明miRNA在缺血性損傷的病理過(guò)程中起重要的調(diào)節(jié)作用[4,5]。miR-21已被證明是一種作用較強(qiáng)的抗凋亡因子，通過(guò)靶向宿主促凋亡基因而發(fā)揮作用[6,7]。miR-21在大多數(shù)實(shí)體瘤組織中表達(dá)上調(diào)[6,8,9]，而關(guān)于miR-21在缺血缺氧引起的神經(jīng)損傷中的作用尚鮮有報(bào)道。p53蛋白是多種細(xì)胞死亡模式中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，其控制轉(zhuǎn)錄依賴性凋亡和壞死的程序以響應(yīng)各種信號(hào)，包括DNA損傷、氧化應(yīng)激和缺血[10]。N2a細(xì)胞是小鼠來(lái)源神經(jīng)瘤母細(xì)胞，多數(shù)成神經(jīng)元樣，具有軸突樣結(jié)構(gòu)。目前主要在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)該細(xì)胞作為體外神經(jīng)細(xì)胞模型,用于研究神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)、神經(jīng)毒性、神經(jīng)退化等。2017年9月～2018年6月，本研究探討miR-21在神經(jīng)細(xì)胞缺氧缺血損傷中的作用及其機(jī)制，為缺血性腦卒中的診斷和治療提供新靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑及儀器 小鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株N2a由本實(shí)驗(yàn)室凍存。DMEM、胎牛血清、胰蛋白酶、Earle′s平衡鹽溶液購(gòu)自GIBCO公司；TUNEL細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)自武漢普健生物科技有限公司；miRNA提取試劑盒購(gòu)自Qiagen公司；TaqMan miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及TaqMan miRNA熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自Applied Biosystems公司；miR-21-mimic、mimic-control均購(gòu)自上海吉瑪有限公司；M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶和逆轉(zhuǎn)錄引物Odigo(dT)購(gòu)自invitrogen公司；引物的設(shè)計(jì)與合成由武漢擎科偉業(yè)生物科技有限公司完成；RIPA裂解液和BCA蛋白檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；鼠抗p53購(gòu)自Santa Cruz公司；鼠抗β-actin 購(gòu)自Proteintech公司；二抗羊抗鼠IgG購(gòu)自Santa Cruz公司；硝酸纖維素膜購(gòu)自Millipore公司。CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱、OGD專用培養(yǎng)箱購(gòu)自上海力康儀器有限公司；細(xì)胞操作超凈工作臺(tái)購(gòu)自蘇州凈化設(shè)備有限公司；離心機(jī)購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；熒光顯微鏡購(gòu)自日本Nickon公司；PCR儀、熒光定量PCR儀及Western blotting所用的電泳槽、電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀均購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)LICOR公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 將N2a細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，在37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，每3天更換1次培養(yǎng)基，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的N2a細(xì)胞按6×105/mL接種于6孔板中(1 500 μL/孔)。隨機(jī)將細(xì)胞分為五組：20、40、60 nmol/L轉(zhuǎn)染組及陰性對(duì)照組、空白對(duì)照組。轉(zhuǎn)染方法：用不含血清培養(yǎng)基的Opti-MEM 250 μL稀釋初始濃度為20 μmol/L的miR-21 mimics(加入細(xì)胞中的RNA終濃度分別為20、40、60 nmol/L)，輕輕混勻，室溫孵育5 min；再用不含血清培養(yǎng)基的Opti-MEM 250 μL稀釋5 mL lipo2000，輕輕混勻并室溫孵育5 min。將以上兩種孵育物輕輕混勻，靜置20 min，然后加入細(xì)胞中，輕輕混勻，放入培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)4～6 h后，更換新鮮培養(yǎng)基。以轉(zhuǎn)染mimic-control的細(xì)胞作為陰性對(duì)照組，以無(wú)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作為空白對(duì)照組。

1.3 神經(jīng)細(xì)胞缺血再灌注損傷方法 將60 nmol/L轉(zhuǎn)染組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組采用氧糖剝奪再灌注法進(jìn)行處理。當(dāng)細(xì)胞密度適當(dāng)時(shí)，以不含葡萄糖的Earle′s平衡鹽溶液代替DMEM培養(yǎng)基，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至含5% CO2和95% N2的氧糖剝奪模型專用培養(yǎng)箱，在37 ℃下培養(yǎng)2 h，然后將培養(yǎng)基更換為含糖含血清的DMEM培養(yǎng)基，并轉(zhuǎn)移至普通CO2培養(yǎng)箱中復(fù)氧24 h，以上過(guò)程用于模擬神經(jīng)元缺血再灌注損傷。

1.4 細(xì)胞凋亡指數(shù)表達(dá)測(cè)算 采用TUNEL染色。N2a細(xì)胞接種于爬片上，OGD處理后用4%甲醛固定20 min，PBS漂洗3次，每次1 min。然后滴加TUNEL反應(yīng)混合物，在37 ℃暗盒內(nèi)避光孵育1 h，DAPI作用5 min，孵育后PBS漂洗3次，每次1 min，封片。標(biāo)記的樣品用熒光顯微鏡觀察，不同組別的細(xì)胞各觀察3張細(xì)胞爬片，每張爬片隨機(jī)選擇6個(gè)視野，對(duì)凋亡細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。凋亡指數(shù)=(凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù))×100%。

1.5 細(xì)胞內(nèi)miR-21及p53 mRNA檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)法。用miRNA提取試劑盒從培養(yǎng)的N2a細(xì)胞中提取總miRNA，按照TaqMan miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及TaqMan miRNA熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒說(shuō)明將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。以U6作為內(nèi)參。mRNA的提取及定量：采用TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA，用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶和逆轉(zhuǎn)錄引物Odigo(dT)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，采用SYBR Premix EX TaqTM試劑盒進(jìn)行qRT-PCR。以GAPDH作為內(nèi)參。采用2-ΔΔCt法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。miR-21逆轉(zhuǎn)錄引物：5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGTCAACATC-3′；miR-21 PCR擴(kuò)增上游引物：5′-ACACTCCAGCTGGCTAGCTTATCAGACTGATG-3′、下游引物：5′-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3′。U6逆轉(zhuǎn)錄引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；U6 PCR擴(kuò)增上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′、下游引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。p53 PCR擴(kuò)增上游引物：5′-GGAAATCTCACCCCATCCCA-3′、下游引物：5′-CAGTAAGCCAAGATCACGCC-3′；GAPDH PCR擴(kuò)增上游引物：5′-GTCAACGGATTTGGTCTGTATT-3′、下游引物：5′-AGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3′。

1.6 細(xì)胞內(nèi)p53蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blotting法。在冰上用RIPA裂解液從細(xì)胞中提取總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，隨后通過(guò)SDS-PAGE凝膠電泳法將蛋白質(zhì)分離并轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，在5%的脫脂牛奶中37 ℃封閉1 h。用一抗鼠抗p53(1∶500)和鼠抗β-actin(1∶4 000)4 ℃孵育過(guò)夜，一抗孵育后TBST溶液洗膜10 min，共2次。用二抗羊抗鼠IgG(1∶1 000)常溫孵育1 h，TBST溶液洗膜10 min，共3次。洗滌后，使用LI-COR Odyssey成像系統(tǒng)對(duì)信號(hào)進(jìn)行可視化及定量分析。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染結(jié)果 20、40、60 nmol/L轉(zhuǎn)染組及陰性對(duì)照組、空白對(duì)照組中miR-21相對(duì)表達(dá)量分別為1.466±0.127、1.729±0.204、2.009±0.182、1.103±0.155、1.004±0.103，與空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染組miR-21相對(duì)表達(dá)量高(P均<0.05)，且60 nmol/L轉(zhuǎn)染組miR-21相對(duì)表達(dá)量最高(P均<0.05)。證明成功將miR-21轉(zhuǎn)染至N2a細(xì)胞內(nèi)。

2.2 miR-21過(guò)表達(dá)對(duì)造模后細(xì)胞凋亡指數(shù)的影響 轉(zhuǎn)染24 h，60 nmol/L轉(zhuǎn)染組、陰性對(duì)照組、空白對(duì)照組凋亡指數(shù)分別為28.8%±0.7%、44.4%±0.5%、47.2%±0.3%，60 nmol/L轉(zhuǎn)染組凋亡指數(shù)低于陰性對(duì)照組、空白對(duì)照組(P均<0.05)。

2.3 miR-21過(guò)表達(dá)對(duì)造模后細(xì)胞內(nèi)p53 mRNA和蛋白表達(dá)的影響 轉(zhuǎn)染24 h，60 nmol/L轉(zhuǎn)染組、陰性對(duì)照組、空白對(duì)照組p53 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.420±0.236、1.102±0.173、1.026±0.011，p53蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.491±0.154、0.937±0.099、1.006±0.021。60 nmol/L轉(zhuǎn)染組p53表達(dá)低于陰性對(duì)照組、空白對(duì)照組(P均<0.05)。

3 討論

與身體其他組織相比，大腦較易發(fā)生缺血性損傷，大約80%的腦卒中患者為缺血性卒中，并且不同于其他組織的即時(shí)缺血性損傷，短暫性腦缺血(約10 min)就可以產(chǎn)生神經(jīng)元損傷。腦缺血后，隨著氧氣和葡萄糖的逐漸耗盡，細(xì)胞所必需的能量依賴過(guò)程受到阻礙，從而引發(fā)一系列生物學(xué)過(guò)程，隨后，大量細(xì)胞由于壞死、凋亡或二者共同作用而死亡[11]。根據(jù)以往研究，缺血后繼發(fā)性神經(jīng)元死亡是導(dǎo)致腦卒中患者死亡或致殘的主要原因，而神經(jīng)細(xì)胞凋亡是繼發(fā)性腦損傷的重要病理改變，是決定患者神經(jīng)功能恢復(fù)的關(guān)鍵。然而，其涉及的信號(hào)通路尚不完全清楚。

近年來(lái)越來(lái)越多的證據(jù)表明，非編碼RNA可能參與腦卒中的發(fā)病，為腦卒中的病理生理學(xué)研究提供了新的思路[12,13]。miR-21位于人類17q23.2號(hào)染色體上，廣泛表達(dá)于哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其表達(dá)上調(diào)與各種實(shí)體瘤發(fā)病機(jī)制相關(guān)[6,8,9,14]。有證據(jù)顯示miR-21在其他器官和不同類型的損傷中有重要作用。Cheng等[15]研究發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)miR-21可減輕心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷中的細(xì)胞凋亡。此外，miR-21在心肌梗死后損傷區(qū)域中的心肌成纖維細(xì)胞中特異性地表達(dá)增加，并且該變化對(duì)損傷起改善作用[16]。對(duì)于缺血性腦卒中，miR-21是一種很強(qiáng)的抗凋亡和促生存的因子，可下調(diào)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。Buller等[17]發(fā)現(xiàn)在體外培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元中過(guò)表達(dá)miR-21可顯著抑制缺氧缺糖誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，而抑制內(nèi)源性miR-21表達(dá)則加重了缺氧缺糖后的細(xì)胞死亡。Han等[18]報(bào)道m(xù)iR-21可以減少TUNEL陽(yáng)性神經(jīng)元的數(shù)量，同時(shí)，miR-21降低了PTEN的表達(dá)水平，顯著增加了AKT的磷酸化，在轉(zhuǎn)染miR-21的神經(jīng)元中，Bcl-2表達(dá)增強(qiáng)，而Caspase-3、Caspase-9和Bax表達(dá)下調(diào)，因此miR-21可以通過(guò)激活PTEN-Akt信號(hào)通路，下調(diào)下游凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)，發(fā)揮減少神經(jīng)元凋亡的作用。本研究以N2a細(xì)胞模擬神經(jīng)細(xì)胞，采用氧糖剝奪模型處理N2a細(xì)胞，建立體外神經(jīng)細(xì)胞缺氧缺血損傷模型，發(fā)現(xiàn)miR-21在氧糖剝奪模型處理后的N2a細(xì)胞中表達(dá)下調(diào);進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)在N2a細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-21可減少缺氧缺血損傷誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。結(jié)合以往研究提示miR-21可能在缺血性神經(jīng)元損傷中發(fā)揮保護(hù)作用。

p53蛋白是多種細(xì)胞死亡信號(hào)通路中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，主要控制轉(zhuǎn)錄依賴的凋亡和壞死程序，如DNA損傷、氧化應(yīng)激和缺血[10,19]。Pei等[10]報(bào)道p53的DNA結(jié)合域通過(guò)直接結(jié)合死亡相關(guān)蛋白激酶1的死亡域介導(dǎo)缺血性神經(jīng)元壞死和凋亡。在細(xì)胞核中，p53誘導(dǎo)凋亡前基因如Bax的表達(dá)，而在線粒體基質(zhì)中，p53通過(guò)與親環(huán)素D相互作用觸發(fā)壞死。本課題組曾發(fā)現(xiàn)腦缺血后長(zhǎng)鏈非編碼RNA母系表達(dá)基因3(MEG3)可招募p53進(jìn)入缺血組織與MEG3結(jié)合形成MEG3-p53復(fù)合體，并介導(dǎo)缺血性神經(jīng)元死亡[20]。在本研究中，p53mRNA和蛋白在氧糖剝奪模型處理后的N2a細(xì)胞中均表達(dá)上調(diào)，提示p53可能參與了N2a細(xì)胞的缺血性損傷。

miRNA通過(guò)結(jié)合mRNA的3′UTRs來(lái)抑制其靶基因。據(jù)報(bào)道，一些miRNA參與p53通路，或受p53調(diào)控，或直接抑制p53或其下游蛋白的表達(dá)，這表明miRNA在p53信號(hào)通路中的重要性[20]。在多種腫瘤細(xì)胞中均存在p53的表達(dá)下調(diào)與miR-21表達(dá)上調(diào)。有研究顯示miR-21可抑制p53通路中多個(gè)基因的表達(dá)。在乳腺癌細(xì)胞中，抑制miR-21的表達(dá)可誘導(dǎo)p53調(diào)控的多個(gè)基因的表達(dá)[21]。miR-21在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，可激活p63和p53通路，導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[22]。本研究在N2a細(xì)胞中過(guò)表達(dá)不同濃度的miR-21后，p53mRNA和蛋白質(zhì)會(huì)隨著miR-21濃度的升高而逐漸減少，提示miR-21可負(fù)向調(diào)控N2a細(xì)胞中p53的表達(dá)，這與眾多腫瘤研究中二者的關(guān)系基本一致。在腫瘤研究中，miR-21的上調(diào)、p53的下調(diào)多與腫瘤細(xì)胞的增殖或凋亡有關(guān)，而本研究發(fā)現(xiàn)，miR-21抑制p53表達(dá)可顯著減少氧糖剝奪模型誘導(dǎo)的N2a細(xì)胞凋亡，提示miR-21抑制p53的表達(dá)在神經(jīng)細(xì)胞缺氧缺血損傷中發(fā)揮一定作用。

綜上所述，在體外培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞N2a中，miR-21過(guò)表達(dá)對(duì)神經(jīng)缺氧缺血損傷細(xì)胞有保護(hù)作用，該作用可能與其負(fù)調(diào)控N2a細(xì)胞中p53表達(dá)有關(guān)。本研究為神經(jīng)細(xì)胞缺氧缺血損傷中的作用機(jī)制提供理論基礎(chǔ)，為缺血性腦卒中的診斷和治療提供新的靶點(diǎn)。