段 玲，周 毅

（1.渠縣畜牧技術(shù)推廣站，四川 達(dá)州 635200；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，成都 611130）

天然免疫應(yīng)答是機(jī)體抵御微生物感染的第一道屏障，在動(dòng)物腸道內(nèi)微生物數(shù)量多達(dá)1 014種，腸道微生物被稱之為動(dòng)物體最大的“免疫器官”[1]。在整個(gè)過(guò)程中Toll樣受體家族蛋白（TLRs）具有重要的作用[2-3]。TLRs通過(guò)識(shí)別腸道內(nèi)容物中各種異物分子啟動(dòng)信號(hào)傳遞過(guò)程。這些異物分子可能是病原微生物，也可能是其他蛋白，主要來(lái)自腸道中各種微生物或者食源性物質(zhì)，結(jié)構(gòu)通常是高度保守的和非特異性的病原體相關(guān)分子模式（PAMPs）。TLRs完成胞外信號(hào)向胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)后，啟動(dòng)宿主多種細(xì)胞產(chǎn)生各種細(xì)胞因子，通過(guò)一系列炎癥反應(yīng)抵抗微生物的侵襲[1]。腸道微生態(tài)平衡對(duì)宿主健康有著密切的聯(lián)系，一個(gè)平衡的微生態(tài)在調(diào)節(jié)機(jī)體免疫、協(xié)同宿主代謝等方面具有重要的作用。益生菌通過(guò)黏附作用阻斷致病菌的入侵，提供適當(dāng)?shù)呐潴w和刺激因子影響免疫系統(tǒng)及腸道組織的發(fā)育，通過(guò)代謝產(chǎn)生揮發(fā)性脂肪酸、氨基酸等為宿主提供能量，通過(guò)多種多樣的信號(hào)傳導(dǎo)方式調(diào)節(jié)宿主免疫力[4-8]。

益生菌發(fā)揮功能是多途徑、多方面的。益生菌通過(guò)自身的各種代謝產(chǎn)物調(diào)控腸道菌群，達(dá)到抑制有害微生物生長(zhǎng)，促進(jìn)有益微生物定植。益生菌還可通過(guò)與宿主各個(gè)功能細(xì)胞相互作用，達(dá)到調(diào)控宿主生長(zhǎng)、代謝和免疫等過(guò)程。在宿主識(shí)別胞外信號(hào)途徑中，包括TLRs在內(nèi)的各個(gè)受體發(fā)揮著十分關(guān)鍵的作用。TLRs作為益生菌發(fā)揮功能過(guò)程中重要的一個(gè)方面，其變化對(duì)宿主健康狀態(tài)有著十分重要的影響。所以研究益生菌與腸道TLR2和TLR4之間的關(guān)系意義重大。

1 益生菌概述

益生菌簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)就是有益的活性微生物，具體是指一類對(duì)宿主具有有益功能的活的微生物，其定植于宿主腸道、口腔、生殖系統(tǒng)及皮膚表面，能夠產(chǎn)生一定的有益功效，包括改善宿主微生態(tài)平衡、抑制害細(xì)菌增殖、協(xié)助宿主代謝營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、調(diào)控宿主免疫系統(tǒng)等功能[9]。因此，益生菌在維持宿主健康狀態(tài)，疾病防治等方面發(fā)揮著十分重要的作用[10-11]。乳酸桿菌（Lactobacillus）、雙歧桿菌（Bifidobacterium）以及部分芽孢桿菌（Bacillus）芽孢桿菌是目前公認(rèn)的益生菌菌屬。其通過(guò)自身或者分泌酶類協(xié)同宿主消化，代謝產(chǎn)物有的可以直接所謂宿主營(yíng)養(yǎng)和能量來(lái)源（揮發(fā)性脂肪酸，維生素等），通過(guò)抑制病原微生物，促進(jìn)黏膜修復(fù)，參與細(xì)胞免疫應(yīng)答等途徑促進(jìn)宿主健康。特別是在維持機(jī)體腸黏膜屏障功能的完整性方面起重要作用，能夠通過(guò)刺激免疫細(xì)胞，參與免疫調(diào)控過(guò)程，并且能夠增強(qiáng)消化道防御屏障，發(fā)揮抗炎癥、抗感染的作用[12]。

2 Toll樣受體的發(fā)現(xiàn)

TLRs是Lemaitre在研究果蠅胚胎發(fā)育時(shí)發(fā)現(xiàn)的一種跨膜蛋白受體，進(jìn)一步研究表明，該受體具有細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能，在感染和免疫應(yīng)答過(guò)程中具有關(guān)鍵作用[13]。1997年Janeway等首次發(fā)現(xiàn)與Lemaitre發(fā)現(xiàn)的果蠅Toll樣受體同源蛋白受體，并將其命名為T(mén)oll樣受體4（TLR4）[14]。此后，其他的Toll樣受體被陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)，目前在哺乳動(dòng)物中已有12個(gè)Toll樣受體家族成員被發(fā)現(xiàn)。Toll樣受體在進(jìn)化上十分保守，從線蟲(chóng)到哺乳動(dòng)物體內(nèi)均有表達(dá)，其中TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR6和TLR10主要分布在細(xì)胞表面，其主要識(shí)別微生物表面膜上的組分，包括脂多糖、磷壁酸、鞭毛蛋白等；而TLR3、TLR7、TLR8和TLR9在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，主要識(shí)別微生物核酸[15-17]。

3 Toll樣受體蛋白結(jié)構(gòu)

TLRs屬于Ⅰ型跨膜蛋白，整個(gè)胞外區(qū)呈馬蹄形結(jié)構(gòu)，在胞外區(qū)結(jié)構(gòu)中富含亮氨酸重復(fù)序列（LRR）每個(gè)重復(fù)序列由24～29個(gè)氨基酸組成，能夠特異性的識(shí)別PAMPs[18-19]。TLRs跨膜蛋白胞內(nèi)區(qū)域與IL-1 Receptor（IL-1R）家族成員高度同源，因此該區(qū)稱為T(mén)oll-IL-1受體結(jié)構(gòu)域。TIR結(jié)構(gòu)域含有多個(gè)高度保守區(qū)域其主要是在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中發(fā)揮作用，TIR總共有5種銜接蛋白，包括MyD88、TIR結(jié)構(gòu)域銜接蛋白、誘導(dǎo)IFN-β的TIR結(jié)構(gòu)域銜接蛋白、TRIF相關(guān)銜接蛋白和含sterilea與HEAT-Arma dillo的銜接蛋白。TLRs在識(shí)別PAMPs過(guò)程中，可以利用不同的轉(zhuǎn)導(dǎo)銜接蛋白，目前已經(jīng)確定TLR4可以使用所有的銜接蛋白進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[20]。

4 TLR-2和TLR-4對(duì)應(yīng)的配體

在TLRs家族中，能夠廣泛識(shí)別多種配體，其主要來(lái)源于各種病原微生物的組成成分，即病原相關(guān)分子模式PAMPs，如脂多糖（LPS）、肽聚糖、胞壁酸、多種細(xì)菌和病毒核酸等[21]。目前，因?yàn)門(mén)LR2和TLR4能夠廣泛識(shí)來(lái)源于細(xì)菌的各種PAMPs，其相關(guān)識(shí)別和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程研究比較深入。TLR2與配體結(jié)合通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)促進(jìn)腫瘤壞死因子α生成，但是這一過(guò)程又會(huì)受到TLR6的抑制。TLR2在識(shí)別阿拉伯甘露糖、脂蛋白等配體時(shí)只有和TLR1或TLR6形成異二聚體才能完成信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程，而產(chǎn)生的細(xì)胞因子反過(guò)來(lái)會(huì)促使TLR2具有更廣泛的識(shí)別PAMPs能力[22]。

TLR4可以識(shí)別革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的主要成分脂多糖（LPS）和壞死細(xì)胞釋放的熱休克蛋白（HSP）。腸道中致病性大腸桿菌宿主（革蘭氏陰性菌）或通過(guò)其他途徑入侵到血液中時(shí)，TLR4將會(huì)被激活并識(shí)別LPS，LPS不是直接和TLR4結(jié)合而是首先與LPS結(jié)合蛋白（LBP）形成復(fù)合物。隨后，LPSLBP復(fù)合物與CD14相互作用后再與細(xì)胞表面的TLR4結(jié)合，將微生物入侵信號(hào)導(dǎo)入胞內(nèi)。因此，此途徑由LPS、LBP和CD14共同完成TLR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程[23]。除此之外，TLR4還需要髓樣分化蛋白2（MD-2）才能被激活，只有當(dāng)位于細(xì)胞膜上的MD-2與TLR4胞外區(qū)連接時(shí)，TLR4才能啟動(dòng)識(shí)別LPS復(fù)合物[24]。

5 TLR2和TLR4的分布

Takeda等證實(shí)，TLRs廣泛分布于動(dòng)物的各個(gè)組織和器官中，但其表達(dá)水平各不相同。動(dòng)物肝、脾、肺、心、腎、腦及胸腺中均有表達(dá)，而TLR2、TLR4只在髓源性細(xì)胞中表達(dá)，如單核巨噬細(xì)胞[25]。TLR4分布廣泛，如心肌細(xì)胞和微血管內(nèi)皮細(xì)胞、氣道上皮細(xì)胞、肺巨噬細(xì)胞、腹膜巨噬細(xì)胞、庫(kù)普弗細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和腸上皮細(xì)胞；TLR2分布在細(xì)胞表面，如成纖維細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞[26]。聶奎等采用熒光定量的方法研究日本大耳白兔時(shí)發(fā)現(xiàn)TLR2和TLR4在十二指腸、盲腸、胸腺、脾臟等15個(gè)不同組織部位均檢測(cè)到TLR2和TLR4，但在骨細(xì)胞中未檢測(cè)到表達(dá)[27]。

6 益生菌與TLR2、TLR4表達(dá)

6.1 乳酸桿菌與TLR2、TLR4表達(dá)

乳酸桿菌作為一種十分重要的益生菌，其自身代謝產(chǎn)物能夠抑制病原微生物生長(zhǎng)。同時(shí)，其還可以通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)搶占腸黏膜位點(diǎn)，進(jìn)一步抑制有害微生物的生長(zhǎng)[28-29]。Lactobacillus plantarum NDC 75017與Caco-2細(xì)胞共培養(yǎng)能夠通過(guò)TLR2途徑激活NF-κB信號(hào)通路，誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞因子達(dá)到增強(qiáng)機(jī)體免疫作用[30]。Lee等在研究乳酸菌對(duì)結(jié)腸炎的治療效果時(shí)發(fā)現(xiàn)，乳酸桿菌可以降低TLR4的表達(dá)，降低腸道炎癥反應(yīng)[31]。研究三硝基苯磺酸（TNBS）誘導(dǎo)的大鼠結(jié)腸炎模型時(shí)，大鼠出現(xiàn)結(jié)腸變短，細(xì)胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α表達(dá)水平顯著增加。但是給予結(jié)腸炎模型大鼠Lactobacillus suntoryeus HY7801干預(yù)后，結(jié)腸中NF-κB和TLR4表達(dá)受到抑制，細(xì)胞因子IL-β、IL-6、TNF-α的表達(dá)量均出現(xiàn)明顯下調(diào)。張琳等使用抗生素構(gòu)建腹瀉大鼠模型，發(fā)現(xiàn)腹瀉發(fā)生早期大鼠腸黏膜、脾臟、肝臟中TLR2和TLR4表達(dá)顯著降低，腸道微生態(tài)系統(tǒng)發(fā)生紊亂并導(dǎo)致菌群向其他組織易位，而乳酸桿菌的干預(yù)治療可以降低TLR2和TLR4 mRNA轉(zhuǎn)錄抑制情況的同時(shí)減輕細(xì)菌易位的程度[32]。反之，給腹瀉小鼠使用大腸桿菌，TLR2和TLR4基因表達(dá)量顯著上調(diào)，細(xì)菌易位程度則會(huì)加劇。Lactobacillus casei CRL 431（副干酪乳桿菌CRL431）在保護(hù)宿主免受沙門(mén)氏菌入侵時(shí)，在感染沙門(mén)前和感染后補(bǔ)充Lactobacillus casei CRL 431發(fā)現(xiàn)TLR2和TLR4表達(dá)均上調(diào)，感染后停止口服副干酪乳桿菌CRL431也出現(xiàn)表達(dá)上調(diào)，然而10 d后這兩組TLRs基因表達(dá)水平均與對(duì)照組相似[33]。由此可見(jiàn)，乳酸桿菌在調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡，維持宿主腸道健康方面扮演著十分重要的角色，當(dāng)腸道微生態(tài)失調(diào)時(shí)TLR2和TLR4表達(dá)受到影響，乳酸桿菌干預(yù)后腸道微生態(tài)朝著有利于宿主健康方向發(fā)展，TLR2和TLR4表達(dá)相應(yīng)的也恢復(fù)到平衡狀態(tài)。因此乳酸菌能夠使TLRs表達(dá)、腸道菌群平衡及宿主健康三者之間處于最佳平衡狀態(tài)。

6.2 雙歧桿菌與TLR2、TLR4表達(dá)

雙歧桿菌有著“長(zhǎng)壽菌”之稱，是一種重要的益生菌，目前市售的大多數(shù)益生菌飲品及其他產(chǎn)品，都添加了不同菌株的雙歧桿菌。雙歧桿菌參與了宿主的消化、營(yíng)養(yǎng)、代謝、吸收、免疫及抗感染過(guò)程。雙歧桿菌的免疫調(diào)節(jié)功能尤為突出，尤其在維持機(jī)體腸黏膜屏障的完整性方面起重要作用，能夠通過(guò)免疫調(diào)節(jié)、免疫排斥和免疫清除，加強(qiáng)消化道防御屏障，發(fā)揮抗炎癥、抗感染的作用[12]。周國(guó)華等在研究雙歧桿菌對(duì)大鼠末端回腸炎的影響時(shí)，發(fā)現(xiàn)無(wú)論高低劑量都可以引起TLR2和TLR4表達(dá)量的下降，從而降低末端回腸炎癥的炎癥反應(yīng)[34]。王海昆等研究也發(fā)現(xiàn)這一現(xiàn)象，非酒精性脂肪肝家兔腸道內(nèi)大腸桿菌數(shù)量與腸黏膜TLR4表達(dá)呈正相關(guān)性，而雙歧桿菌數(shù)量與腸黏膜TLR4表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)[35]。研究顯示，給仔豬給予不同劑量的雙歧桿菌后其腸腸道細(xì)胞中TLR2表達(dá)上調(diào)，Khailova以IEC-6（Intestinal Epithelial Cells 6）為模型，在細(xì)胞培養(yǎng)液中添加TNF-α和IFN-γ模擬NEC，發(fā)現(xiàn)無(wú)論是否添加TNF-α或IFN-γ只要與雙歧桿菌共培養(yǎng)在熒光顯微鏡下就能觀察到TLR2的表達(dá)，COX-2的表達(dá)也隨之增加[36]。而其他未添加雙歧桿菌組則不能觀察到TLR2的表達(dá)。這說(shuō)明TLR2能夠識(shí)別革蘭氏陽(yáng)性菌，也說(shuō)明雙歧桿菌能夠激活TLR2傳遞相關(guān)信息促進(jìn)COX-2表達(dá)，進(jìn)一步參與炎癥反應(yīng)。由此可見(jiàn)，雙歧桿菌可以通過(guò)與TLRs（主要是TLR2）的相互作用，調(diào)動(dòng)宿主免疫反應(yīng)為防止病原微生物的入侵，并且利用自身的益生作用維持宿主健康狀態(tài)發(fā)揮這巨大作用。

6.3 其他益生菌與TLR2、TLR4表達(dá)

研究顯示，大腸埃希菌益生菌株Nissle 1917可通過(guò)TLR2和TLR4依賴的途徑改善葡聚糖硫酸鈉（DSS）誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎，丁酸梭菌則可以通過(guò)激活TLR2調(diào)節(jié)的骨髓分化因子88（MyD88）的非依賴性途徑，引起NF-κB、IL-8、IL-6及TNF-α的分泌，以抵抗病原菌的感染同時(shí)防止自身免疫紊亂[37-38]。給斷奶仔豬分別灌胃益生菌不拉氏酵母和枯草芽孢桿菌B10，益生菌組腸道發(fā)育狀況優(yōu)于對(duì)照組，TLR2、TLR4相關(guān)信號(hào)蛋白以及信號(hào)末端相關(guān)細(xì)胞因子都出現(xiàn)明顯上調(diào)[39]。

7 小 結(jié)

益生菌作為腸道正常微生物中重要的組成部分，其與TLRs蛋白家族有著十分緊密的聯(lián)系，這是研究益生菌發(fā)揮其益生效果的相關(guān)分子機(jī)制具有十分重要的途徑。近年來(lái)更有通過(guò)應(yīng)用雙歧桿菌與TLR2之間的關(guān)系來(lái)尋找新的炎性因子的報(bào)道[40]。因此，研究益生菌與TLRs蛋白家族的關(guān)系十分重要。