，，，

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源科學(xué)與工程研究中心、嶺南中藥資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、國(guó)家中成藥工程技術(shù)研究中心南藥研發(fā)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510006)

物理農(nóng)業(yè)中γ射線和離子注入等方法常用于誘變育種[1-2]。而低溫等離子體(low temperature plasma)能量較低，農(nóng)業(yè)上常應(yīng)用于提高種子活力、促進(jìn)萌發(fā)及種子表面消毒等方面[3-4]。相對(duì)于化學(xué)試劑處理，低溫等離子體處理具有方便、快捷、無殘留等優(yōu)點(diǎn)[3-4]。研究表明，多種方式激發(fā)的等離子體處理均可達(dá)到提高種子萌發(fā)率或萌發(fā)速度的作用，包括：電暈放電(corona discharge)[5-6]、射頻放電(radiofrequency discharge)[7-10]、低頻輝光放電(low frequency glow discharge)[11]、滑動(dòng)弧光放電(gliding arc discharge)[12]、介質(zhì)阻擋放電(dielectric barrier discharge)[13-14]、高壓納秒脈沖放電(high voltage nanosecond pulsed plasma)[15-16]、擴(kuò)散共面表面阻擋放電(diffuse coplanar surface barrier discharge)等[17]。在多種作物種子研究中得到證實(shí)，包括：油菜(Brassicanapus)[5,10]、蘿卜(Raphanussativus)[6]、兵豆(Lensculinaris)[7]、菜豆(Phaseolusvulgaris)[7-8]、大豆(Glycinemax)[14]、豌豆(Pisumsativum)[17]、小麥(Triticumaestivum)[7,11,13]、菠菜(Spinaciaoleracea)[15]、芥菜(Brassicajuncea)[16]、刺菜薊(Cynaracardunculus)[9]、歐亞花葵(Lavaterathuringiaca)等種子[12]。Gómez-Ramírez等采用介質(zhì)阻擋和射頻放電等離子體，均能提高昆諾藜(Chenopodiumquinoa)種子的萌發(fā)率[18]。

前期實(shí)驗(yàn)采用大氣壓下介質(zhì)阻擋放電激發(fā)的空氣等離子體處理種皮具有蠟質(zhì)層的穿心蓮(Andrographispaniculata)種子，結(jié)果表明能夠刻蝕種皮，提高發(fā)芽指數(shù)和田間出苗率，并且增強(qiáng)幼苗的抗氧化能力；但過高的電壓或太長(zhǎng)的處理時(shí)間卻會(huì)傷害種子[21]。進(jìn)一步研究重新從3個(gè)激發(fā)電壓和3個(gè)處理時(shí)間組合共9個(gè)處理組中優(yōu)選了適當(dāng)處理劑量，可以提高穿心蓮種子發(fā)芽勢(shì)，促進(jìn)植株生物量的積累[22]。然而，在實(shí)驗(yàn)過程中觀察發(fā)現(xiàn)，大氣壓下敞開式放電環(huán)境的空氣濕度會(huì)影響等離子體的激發(fā)效果，空氣濕度越大需要激發(fā)的能量越高。環(huán)境的濕度相對(duì)容易調(diào)節(jié)，但是種子不同的含水量是否會(huì)影響等離子體的激發(fā)，從而對(duì)處理效應(yīng)產(chǎn)生影響。以往的文獻(xiàn)大多沒有標(biāo)明種子的含水量，說明前人的研究沒有考慮到環(huán)境濕度和種子含水量對(duì)處理效果的影響。為此，本研究調(diào)節(jié)穿心蓮種子到不同含水量，再進(jìn)行等離子體處理和發(fā)芽試驗(yàn)，考察不同含水量下處理對(duì)萌發(fā)和幼苗參數(shù)的影響，為播種前處理和進(jìn)一步研究等離子體技術(shù)在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

穿心蓮(Andrographispaniculata(Burm.f.) Nees)種子于2014年12月10日收購于廣西貴港，批號(hào)為GX 20141210 DX-1，經(jīng)人工凈選，含水量為12.9%，試驗(yàn)前保存于4 ℃冰箱內(nèi)備用。

1.2 儀器與設(shè)備

DBD-50低溫等離子體放電設(shè)備，配CTP-2000 K型電源，南京蘇曼等離子體科技有限公司；Sartorius BSA 2245分析天平，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；ZRX-1000 EC智能人工氣候培養(yǎng)箱，杭州錢江儀器設(shè)備有限公司；DGX-9073烘箱，上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 種子初始含水量的測(cè)定

參照《農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程》[23](下文簡(jiǎn)稱《規(guī)程》)及《<規(guī)程>實(shí)施指南》[24](下文簡(jiǎn)稱《指南》)，采用高溫法測(cè)定種子初始含水量。

1.3.2 種子水分的調(diào)節(jié)

十字分樣法扦樣，取穿心蓮種子，裝于尼龍網(wǎng)袋內(nèi)，參考硅膠干燥法[25]，在4 ℃冰箱中的密封盒內(nèi)脫水處理3 h和24 h?；蝻柡退羝鰸穹訚?，24，72 h(裝種子的尼龍網(wǎng)袋置于4 ℃冰箱內(nèi)的密封盒上層，下層為滅菌蒸餾水)[26]。取出種子，迅速精密稱重，計(jì)算干燥或加濕后含水量。每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1.5～1.7 g種子。

1.3.3 種子的等離子體處理

采用空調(diào)調(diào)節(jié)室溫為25 ℃，相對(duì)濕度約70%。調(diào)整低溫大氣壓介質(zhì)阻擋放電(DBD)等離子體裝置的石英介質(zhì)間距(氣隙)為8 mm，連接定時(shí)插座，調(diào)整電壓為30 V，把電源頻率調(diào)整到10 KHz。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)的種子置于下介質(zhì)板上，開啟定時(shí)插座放電處理3 s。處理后密封放置4 d后置種，以未處理種子作對(duì)照組[22]。每組設(shè)置4個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)100粒種子。

1.3.4 發(fā)芽試驗(yàn)

按照穿心蓮種子發(fā)芽試驗(yàn)規(guī)程，室溫條件純水浸種20 h，0.3%雙氧水消毒5 min，置種，紙上法(TP)發(fā)芽，在溫度(27.5±1)℃光照培養(yǎng)。以胚根突破種皮達(dá)種子長(zhǎng)度一半(約1 mm)計(jì)為發(fā)芽，每天進(jìn)行發(fā)芽計(jì)數(shù)，置種后第7天結(jié)束發(fā)芽，并測(cè)量胚根長(zhǎng)度[27]。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析

參照《規(guī)程》及《指南》要求[23-24]按下式計(jì)算發(fā)芽率、第2天發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)等參數(shù)。數(shù)據(jù)組間差異采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行方差分析，兩兩比較采用Duncan檢驗(yàn)。

發(fā)芽率(%)=(試驗(yàn)中所有發(fā)芽種子數(shù)/供試種子總數(shù))×100%;

發(fā)芽勢(shì)(%)=(規(guī)定天數(shù)內(nèi)(2 d)發(fā)芽種子數(shù)/供試種子總數(shù))×100%;

發(fā)芽指數(shù)(GI)=∑(Gt/Dt)(式中，Gt為置種后第t天的發(fā)芽數(shù)，Dt為不同的發(fā)芽試驗(yàn)天數(shù));

日均發(fā)芽數(shù)=∑(Gt×Dt)/∑Gt;

活力指數(shù)(VI)=發(fā)芽指數(shù)(GI)×胚根長(zhǎng)；

霉變率(%)=(試驗(yàn)中所有霉變種子數(shù)/供試種子總數(shù))×100%；

正常幼苗百分比(%)=(第7天所有健康的正常幼苗數(shù)/供試種子總數(shù))×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 穿心蓮種子水分調(diào)節(jié)結(jié)果

經(jīng)測(cè)定，該批穿心蓮種子的初始含水量為(12.91±0.01)%；經(jīng)過硅膠干燥24 h和3 h，含水量分別降至6.27%和8.58%；飽和水蒸汽加濕8，24 h和72 h，含水量分別提高到18.58%、23.97%和33.39%(見表1)。

2.2 穿心蓮種子含水量對(duì)等離子體處理后萌發(fā)的影響

發(fā)芽試驗(yàn)結(jié)果表明，穿心蓮種子經(jīng)過水分調(diào)節(jié)后，未經(jīng)等離子體處理組中含水量為6.3%種子的發(fā)芽勢(shì)與基礎(chǔ)水分組(含水量為12.9%)的發(fā)芽勢(shì)(21.3±3.9)%相比降低了28.2%，但未達(dá)到顯著性差異；而含水量為18.6%組發(fā)芽勢(shì)相比基礎(chǔ)水分組提高了54.0%(p<0.05)。由此看來，4 ℃條件下飽和水蒸汽增濕處理種子8 h有助于提高穿心蓮種子發(fā)芽勢(shì)。但是，等離子體處理組和未處理組間發(fā)芽勢(shì)未見顯著性差異(見圖1 A)。從7 d內(nèi)的總發(fā)芽率來看(見圖1 B)，水分增加到18.6%組相比基礎(chǔ)水分組的發(fā)芽率(52.8±4.2)%顯著提高了25.9%(p<0.05)；經(jīng)過等離子體處理后從含水量為12.9%、18.6%到24.0%各組發(fā)芽率有逐漸升高的趨勢(shì)，含水量為12.9%組和24.0%組的發(fā)芽率與未經(jīng)等離子體處理組相比較分別顯著提高了25.0%和39.2%(p<0.05)，其它各組包括含水量為18.6%組差異不顯著。發(fā)芽指數(shù)與發(fā)芽率變化情況類似。未經(jīng)等離子體處理前含水量為18.6%組相比基礎(chǔ)水分組的發(fā)芽指數(shù)(19.48±2.09)提高了34.4%(p<0.05)；經(jīng)過等離子體處理后從含水量12.9%、18.6%到24.0%各組發(fā)芽指數(shù)分別比未經(jīng)等離子體處理組提高了24.8%(p<0.05)、8.1%和29.3%(p<0.05)，含水量為18.6%組差異不顯著(見圖1 C)。從日均發(fā)芽數(shù)來看，未經(jīng)等離子體處理各組間差異不顯著；經(jīng)等離子體處理后從含水量為12.9%、18.6%到24.0%各組日均發(fā)芽數(shù)有逐漸升高趨勢(shì)；含水量為12.9%、24.0%和33.4%各組日均發(fā)芽數(shù)分別比未處理組提高22.1%、51.2%和19.5%(p<0.05)；其它各組包括含水量為18.6%組差異不顯著(見圖1 D)。

表1 干燥或增濕處理后穿心蓮種子的含水量(mean±SD,n=3)

注：“—”表示未進(jìn)行干燥或增濕調(diào)節(jié)的初始狀態(tài)。

2.3 穿心蓮種子含水量對(duì)等離子體處理后幼苗的影響

置種后第7天結(jié)束發(fā)芽試驗(yàn)，測(cè)量胚根長(zhǎng)度，計(jì)算試驗(yàn)過程中受到細(xì)菌或霉菌感染而腐爛的種子或幼苗與試驗(yàn)種子總數(shù)的百分比(霉變率)，剔除霉變等不正常幼苗并計(jì)算最終正常幼苗百分比。結(jié)果顯示，未經(jīng)等離子體處理前含水量為8.6%組的胚根長(zhǎng)度為(1.55±0.13)cm，顯著長(zhǎng)于基礎(chǔ)水分組的(1.16±0.23)cm，表明4 ℃低溫干燥3 h后進(jìn)行播種能促進(jìn)萌發(fā)早期胚根生長(zhǎng)；但該組經(jīng)等離子體處理后胚根長(zhǎng)為(1.19±0.09)cm，顯著短于未處理前，其原因有待進(jìn)一步研究。含水量為33.4%未經(jīng)等離子體處理組的胚根長(zhǎng)度為(0.91±0.13)cm，短于基礎(chǔ)水分組，差異雖未達(dá)顯著水平，但是4 ℃低溫條件下飽和水蒸汽增濕72 h有可能對(duì)種子產(chǎn)生了吸脹冷害的影響。從活力指數(shù)來看，受到胚根長(zhǎng)度的影響，未經(jīng)等離子體處理含水量為8.6%組相比基礎(chǔ)水分組的的活力指數(shù)(22.88±6.61)提高了46.5%(p<0.05)；含水量為18.6%組的活力指數(shù)相比基礎(chǔ)水分組提高了51.5%(p<0.05)，為未處理組的最高值。經(jīng)等離子體處理后，含水量為18.6%組的活力指數(shù)為最高值(42.65±8.21)，由于試驗(yàn)重復(fù)間差異太大，與未處理組差異未達(dá)顯著水平；但含水量為24.0%處理組相比未處理組的活力指數(shù)(25.23±4.20)提高了57.8%(p<0.05)。從種子或幼苗霉變情況來看，各干燥或增濕處理組間未見顯著差異，說明4 ℃低溫條件干燥24 h或增濕處理72 h對(duì)種子萌發(fā)過程感染細(xì)菌或霉菌情況沒有顯著影響。經(jīng)等離子體處理后，含水量為12.9%、18.6%、24.0%和33.4%組霉變率顯著降低(p<0.05)，與未處理組比較分別降低36.5%、41.4%、54.7%和31.0%，含水量為24.0%組的霉變率最低。從正常幼苗百分比來看，未處理組間未見顯著差異；經(jīng)等離子體處理后受到霉變率顯著降低的影響，含水量為12.9%、18.6%、24.0%和33.4%組正常幼苗百分比顯著提高(p<0.05)，與未處理組比較分別提高46.2%，51.0%，58.2%，36.6%，含水量為24.0%組的正常幼苗百分比最高。

注：組間比較采用方差分析，兩兩比較采用Duncan檢驗(yàn)；不含有相同字母的組間差異具有顯著意義。下同。圖1 穿心蓮種子含水量對(duì)等離子體處理后萌發(fā)參數(shù)的影響

圖2 穿心蓮種子含水量對(duì)等離子體處理后幼苗參數(shù)的影響

3 討 論

前人采用等離子體處理種子，大多沒有考慮空氣濕度和種子含水量對(duì)處理效應(yīng)的影響。本研究把空氣濕度調(diào)節(jié)到70%，盡量避免處理過程中種子受到空氣影響而含水量產(chǎn)生變化，從而考察種子含水量對(duì)處理效果的影響。結(jié)果表明，不同含水量的穿心蓮種子進(jìn)行等離子體處理后萌發(fā)效應(yīng)不一?；A(chǔ)水分為12.9%或提高到18.6%、24.0%水分條件下種子經(jīng)等離子體處理，發(fā)芽指數(shù)、日均發(fā)芽數(shù)和發(fā)芽率有逐漸升高趨勢(shì)，含水量為12.9%和24.0%組相比未處理組有顯著提高；水分和等離子體處理對(duì)含水量為18.6%組可能有交互作用，差異未達(dá)顯著意義。前期研究采用相同劑量等離子體處理含水量為11.6%的穿心蓮種子，也能達(dá)到提高發(fā)芽勢(shì)和促進(jìn)幼苗生長(zhǎng)的作用[22]。但含水量降低到6.3%和8.6%進(jìn)行等離子體處理，對(duì)種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的效應(yīng)不明顯。

種子含水量為12.9%到33.4%各組，等離子處理除了表現(xiàn)出促進(jìn)萌發(fā)的作用之外，還有明顯的抑制細(xì)菌和霉菌、降低種子和幼苗染菌，從而提高正常幼苗存活率的效果；含水量為24.0%組效果最好。Jiang等研究表明，等離子體處理番茄(Solanumlycopersicum)種子后，幼苗抗青枯菌感染，從而降低青枯病的發(fā)病率[28]；處理小麥種子，對(duì)攜帶的種傳病原如雪腐鐮刀菌(Fusariumnivale)、大刀鐮刀菌(Fusariumculmorum)、粉紅單端孢(Trichotheciumroseum)、黃曲霉(Aspergillusflavus)、棒曲霉(Aspergillusclavatus)等都有顯著的滅活作用[29]。其機(jī)理是由于等離子體中的帶電粒子和激發(fā)過程產(chǎn)生的活性氧(reactive oxygen species)有明顯的抗菌效果。胡友誼等采用不同含水量的空氣等離子體對(duì)指狀青霉(Penicilliumdigitatum)進(jìn)行滅活處理，結(jié)果顯示隨著氣氛中水分比例的升高滅菌效果越好，分析認(rèn)為主要是由于水分子電離產(chǎn)生的活性氫氧離子(OH)的作用[30]。

但是，并不是種子含水量調(diào)節(jié)得越高處理效果越好。當(dāng)種子含水量升高到33.4%時(shí)進(jìn)行等離子體處理，表現(xiàn)出明顯提高日均發(fā)芽數(shù)，也有顯著的殺菌和提高正常幼苗百分比的效應(yīng)，但沒有明顯提高發(fā)芽指數(shù)和發(fā)芽率。研究表明，空氣中水分含量越高，激發(fā)產(chǎn)生的等離子體中帶電氫氧離子濃度越高；但是從液態(tài)水激發(fā)產(chǎn)生等離子體需要更高的能量，否則無法產(chǎn)生等離子體[30-31]。而前期研究表明，過高劑量的等離子體處理會(huì)對(duì)穿心蓮種子產(chǎn)生傷害，從而降低發(fā)芽率[32]。同時(shí)，結(jié)果顯示，調(diào)節(jié)水分處理的長(zhǎng)時(shí)低溫(72 h，4 ℃)高濕環(huán)境可能對(duì)種子產(chǎn)生吸脹冷害，這在實(shí)際運(yùn)用中也要考慮避免。此外，不同作物種子的大小、種皮厚薄和質(zhì)地等具有多態(tài)性，最適合的種子含水量區(qū)間可能不同，應(yīng)用前需要進(jìn)行試驗(yàn)摸索。

4 結(jié) 論

由于大氣壓敞開環(huán)境下等離子體的激發(fā)會(huì)受到空氣濕度和處理對(duì)象所含水分的影響，采用該條件的介質(zhì)阻擋放電等離子體處理種子來促進(jìn)萌發(fā)，種子含水量是影響處理效果的重要因素，需要適當(dāng)?shù)暮坎拍苓_(dá)到促進(jìn)萌發(fā)的效果，過低或過高的水分條件下進(jìn)行處理都有可能達(dá)不到效果。總體來說，穿心蓮種子含水量在11.6%～24.0%范圍以內(nèi)是合適的，該水分條件下進(jìn)行等離子體處理能夠促進(jìn)發(fā)芽，抑制種子攜帶的微生物的生長(zhǎng)，從而獲得更多的健康幼苗。