田林奇 韓穎 魏聰 徐玉茵 周靜 張娟麗 郭艷 河南省醫(yī)療器械檢驗所 （河南 鄭州 450000）

內(nèi)容提要： 目的：通過比較GB/T 14233.2-2005和GB/T 16886.5-2017中涉及的細胞毒性檢測方法-MTT法的差異，為試驗的選擇提供參考。方法：分別采用GB/T 14233.2-2005和GB/T 16886.5-2017中的MTT法檢測8種醫(yī)療器械的細胞毒性，比較兩種方法對同一樣品的結(jié)果判定是否存在差異。結(jié)果：由于兩個標(biāo)準(zhǔn)在細胞濃度、培養(yǎng)時間、結(jié)果判定方面都有所不同，對同一種樣品，可能會出現(xiàn)不同的判定結(jié)果。

隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，醫(yī)療器械在全球范圍內(nèi)發(fā)展迅猛，大量新型的醫(yī)療器械產(chǎn)品得到了廣泛的應(yīng)用。但同時，因某些產(chǎn)品材質(zhì)選用不當(dāng)，或受加工殘留劑的影響，對人體帶來了一些不容忽視的生物學(xué)危害為了保障醫(yī)療器械在臨床使用的安全有效，臨床前的醫(yī)療器械生物學(xué)評價及評價方法的全球統(tǒng)一化引起了世界各國政府及生物學(xué)評價專家的高度重視，為此國際標(biāo)準(zhǔn)化組織于1989年正式成立了ISO/TCl94醫(yī)療器械生物學(xué)評價技術(shù)委員會，并相繼制定頒布了ISO10993系列標(biāo)準(zhǔn)。這些標(biāo)準(zhǔn)已逐步為世界各國所認同并相繼采納。對于ISO10993系列標(biāo)準(zhǔn)，我國等同采用為GB/T 16886系列標(biāo)準(zhǔn)。

細胞毒性試驗是醫(yī)療器械生物安全性評價的一個重要檢測項目，并以其簡便、快捷、靈敏性高、節(jié)省動物等優(yōu)點均被列為首選試驗項目，作為評價材料毒性的重要指標(biāo)[1]。細胞毒性試驗是將樣品或樣品浸提液與細胞共培養(yǎng)一段時間后，通過測定對L-929細胞生長和增殖的影響來評價樣品對細胞的潛在毒性作用。目前我國醫(yī)療器械細胞毒性檢測主要參照GB/T16886.5和GB/T14233.2-2005，而2018年7月1日起新實施的GB/T 16886.5-2017中，細胞毒性試驗MTT法與GB/T14233.2-2005相比有了較大的變化。

在GB/T16886.5-2003中，只規(guī)定了幾種評價方式，并沒有規(guī)定具體的試驗方法，而對于輸血輸注器具而言，一般采用的是GB/T14233.2-2005中的規(guī)定的MTT法。但在GB/T16886.5-2017中詳細列舉了幾種細胞毒性檢測的方法，具體有MTT法、XTT法、瓊脂擴散法等。MTT法因毒性分級清晰，操作簡單，靈敏度高，并可估算聚合物的IC50值，表現(xiàn)出了相對優(yōu)勢，所以被經(jīng)常的使用[2]。但是GB/T16886.5-2017的MTT法與GB/T14233.2-2005相比具有很大的變化，主要表現(xiàn)在細胞濃度，培養(yǎng)時間，檢測試劑，評價方法等。由于GB/T 14233.2-2005仍然現(xiàn)行有效，且此方法是之前對各類檢品一直采用的通用的方法，因此，有必要對GB/T16886.5-2017和GB/T 14233.2-2005中所采用的方法進行比較，以便更好的評價醫(yī)療器械的細胞毒性[3]。

本試驗通過分別采用GB/T 14233.2-2005和GB/T16886.5-2017中MTT法對4類8種具有代表性的醫(yī)療器械（涉及二類和三類器械）進行細胞毒性檢測，以便為生產(chǎn)企業(yè)和檢測部門進行體外細胞毒性試驗的選擇提供參考。

1.儀器與試劑

1.1 儀器

4131型二氧化碳培養(yǎng)箱（Thermo Fisher公司），T-DH型倒置顯微鏡（Nikon公司），Scepter型細胞計數(shù)儀（Millipore公司），Varioskan Flasg型全波長掃描讀數(shù)儀（Thermo Scientific公司）。

1.2 試劑

L-929小鼠成纖維細胞株（中國科學(xué)院上海細胞所），胎牛血清（廠家：Gibco；批號：1912660C），MEM培養(yǎng)基（廠家：Gibco；批號：1897268），胰酶（廠家：Gibco；批號：1869828），DMSO（廠家：sigma；批號：RNBD8359），異丙醇（廠家：國藥集團化學(xué)試劑有限公司；批號：20160217），MTT（廠家：sigma；批號：MKBN7264V）。

2.試驗樣品

醫(yī)療器械檢品分別為不同廠家的麻醉面罩，導(dǎo)尿管，輸液器，活檢針等檢品（本實驗采用的檢品均為上市前的產(chǎn)品）。

3.試驗方法

3.1 供試液的制備

根據(jù)GB/16886.12的方法，由于選擇的供試品均為不規(guī)則形狀，按0.2g/mL的浸提比例浸提。使用含10%胎牛血清的細胞培養(yǎng)液，置于37°C浸提24h。

陰性對照品為PE，同等條件下制備。

陽性對照品溶液為含10%DMSO的細胞培養(yǎng)液，同等條件下制備。

3.2 GB/T 14233.2-2003方法

第1d，取對數(shù)生長期的細胞消化并加入細胞培養(yǎng)液，調(diào)節(jié)細胞密度為1×104/mL。

將配制好的細胞懸液接種96孔培養(yǎng)板，設(shè)空白對照、陰性對照、陽性對照和供試品組，每組各設(shè)6復(fù)孔，每孔接種100μL細胞懸液。置5%CO2培養(yǎng)箱37°C培養(yǎng)24h。

第2d，棄去96孔培養(yǎng)板內(nèi)原培養(yǎng)液?？瞻讓φ战M加入新鮮細胞培養(yǎng)液，陰性對照組加入PE浸提液，陽性對照組加入5%DMSO溶液，供試品組加入試驗樣品浸提液，每孔100μL，置CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)72h。

第5d，置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。每孔加入20μL質(zhì)量濃度為5g/L的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4h后棄去孔內(nèi)液體，加入150μLDMSO，置振蕩器上振蕩10min，在酶標(biāo)儀570nm和630nm波長下測定吸光度，按下式計算相對增殖率（RGR）。

式中：RGR：相對增殖率，%；A：供試品組（陰性、陽性組）吸光度；A0：空白對照組吸光度。

根據(jù)下表分級標(biāo)準(zhǔn)判定。陰性對照組的反應(yīng)應(yīng)不大于1級，陽性對照組至少為3級反應(yīng)[4]。見表1。

表1. 細胞毒性反應(yīng)分級

3.3 GB/T 16886.5-2017的方法

第1d，用0.25%胰酶將培養(yǎng)細胞從培養(yǎng)瓶中移出，細胞懸液在200g離心3min。用培養(yǎng)基重懸細胞懸液，調(diào)整密度為1×105個細胞/mL。將配制好的細胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板，每孔接種100μL。置5%CO2培養(yǎng)箱37°C培養(yǎng)24h。

表2. 試驗結(jié)果

第2d，棄去96孔培養(yǎng)板內(nèi)原培養(yǎng)液。每孔加入100μL含適當(dāng)濃度樣品浸提液、或陰性對照組、或陽性對照或溶劑（空白）的處理培養(yǎng)基，置CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24h。

第3d，將培養(yǎng)板置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。棄去孔內(nèi)溶液，每孔加入50μL質(zhì)量濃度為1g/L的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)2h后棄去MTT溶液，加入100μL異丙醇溶液。震蕩平板，在酶標(biāo)儀570nm和650nm波長（參照波長）下測定吸光度。

活細胞減少導(dǎo)致了樣品中代謝活性降低，這直接與生成的藍紫色甲臜量有關(guān)，在570nm測量光密度，按下式比較計算存活率下降：

式中：OD570e：試樣樣品100%浸提液光密度平均值；OD570b：空白光密度平均值。

空白OD570平均值如≥0.2，則試驗符合接受標(biāo)準(zhǔn)，如試驗樣品細胞存活率下降到＜空白的70%，則具有潛在的細胞毒性[5]。

4.結(jié)果

結(jié)果如下，兩種方法的陰性浸提液和陽性浸提液均符合標(biāo)準(zhǔn)要求，供試品的具體結(jié)果如下，見表2。

可見，對于麻醉面罩，其材質(zhì)多數(shù)為PVC，因此作為2類醫(yī)療器械，若采用GB/T14233.2-2005中的方法（即為GB/T16886.5-2003中經(jīng)常采用的方法），反應(yīng)等級為2級，可以判斷為檢品合格，若是采用GB/T16886.5-2017中的方法，由于檢品原材料或是加工工藝的問題，其細胞增殖率達不到70%，則在結(jié)果判定中會判定為不合格，而輸液器作為3類醫(yī)療器械，若采用GB/T14233.2-2005中的方法，其增殖率達不到80%，細胞等級達不到1級，對于三類醫(yī)療器械，一般要求細胞毒性為1級才會判定為合格，因此會判定為不合格，但是采用GB/T16886.5-2017中的方法，其細胞增殖率能夠達到70%以上，因此可以判定為合格。同時，像橡膠類的導(dǎo)尿管這類檢品，由于其細胞毒性大，兩種方法的檢品結(jié)果都為不合格，還有活檢針之類的材質(zhì)為不銹鋼的檢品，兩種方法的結(jié)果都為合格?？梢钥吹?，檢品本身的材質(zhì)和加工工藝對細胞毒性的結(jié)果還是有很大的影響，同時，對于一些細胞毒性臨近判定點的檢品，兩種方法也可能會出現(xiàn)不同的判定結(jié)果。這兩種方法存在一定的差異性。

5.討論

MTT比色法的原理：活細胞的線粒體酶可將黃綠色的MTT降解形成藍紫色的物質(zhì)，用DMSO將其溶解成溶液，用酶標(biāo)儀測定其濃度，從而定量測定細胞的存活比例。本試驗通過采用2種體外細胞毒性檢測方法，對4類8種不同器械的浸提液的細胞毒性進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這兩種標(biāo)準(zhǔn)在結(jié)果判定上存在一定的差異性，這可能是由于兩個標(biāo)準(zhǔn)在細胞密度、培養(yǎng)時間、吸光度檢測方法、評價方法上都有很大的區(qū)別。根據(jù)評審中心的一般要求，對于二類醫(yī)療器械，一般要求細胞毒性不大于2級細胞毒性可以接受，而對于三類的醫(yī)療器械，一般要求細胞毒性至少不大于1級。在GB/T 14233.2-2003的結(jié)果判定中，細胞增殖率不低于80%被認定為細胞毒性1級，增殖率不低于50%被認定為細胞毒性2級，而GB/T 16886.5-2017中增殖率達到70%即可判定為無細胞毒性，因此，實行GB/T 16886.5-2017對三類的醫(yī)療器械的要求放寬，而對二類的醫(yī)療器械的要求收緊。