杜木香 梁 珊 黃 玉 莊曉慈 李愛軍 汪 勇

(廣東油脂生物煉制工程技術研究中心；暨南大學食品科學與工程系；暨南大學-薩斯喀徹溫大學“油料生物煉制與營養(yǎng)”聯(lián)合實驗室，廣州 510632)

亞麻籽膠(Flaxseed gum)，又名富蘭克膠、胡麻膠，是一種以多糖為主要成分的天然植物種子膠[1]，常作為增稠劑、凝膠劑、乳化劑、保濕劑等應用于食品、日化及醫(yī)藥行業(yè)[2]。亞麻籽膠的主要成分亞麻籽多糖是由5～7種單糖通過一系列特異性糖苷鍵連接而成的大分子聚合物[3]，分子質(zhì)量通?？蛇_2 000 ku以上[4]，較高的分子質(zhì)量賦予了亞麻籽膠類似于膳食纖維的作用，但同時也限制了其在胃腸道內(nèi)的消化吸收。亞麻籽多糖分子可通過物理、化學或生物的方法被降解，得到小分子產(chǎn)物，從而提高其消化吸收效率[5]。筆者在研究芬頓氧化降解法降解亞麻籽膠時發(fā)現(xiàn)由于反應體系中鐵離子的引入，使得產(chǎn)物形成了一種新型膠-鐵復合物，可為制備新型無副作用膳食鐵補充劑提供新的思路，因此進一步深入了芬頓氧化降解法制備低分子質(zhì)量亞麻籽膠-鐵復合物的研究。

芬頓反應是由Fe2+催化H2O2發(fā)生一系列復雜的自由基鏈式反應，反應過程中釋放大量的羥基自由基，從而表現(xiàn)出很強的氧化降解能力[6]。芬頓反應主要在環(huán)境化學中應用于有機廢水的處理，對氰化物、酚類物質(zhì)、芳香族化合物等表現(xiàn)出很強的清除能力，也可用于降解有機高分子聚合物(多糖、蛋白等)[7]，因此可用于大分子亞麻籽膠的降解。在降解亞麻籽膠的反應體系中，亞麻籽膠被降解產(chǎn)生低分子質(zhì)量多糖基產(chǎn)物，F(xiàn)e2+被氧化產(chǎn)生Fe3+，F(xiàn)e3+進一步與低分子質(zhì)量多糖基物質(zhì)結(jié)合，形成了穩(wěn)定的低分子質(zhì)量亞麻籽膠-鐵復合物[LMWFG-Fe(Ⅲ)]。鐵是人體必需的一類微量營養(yǎng)元素，對維持機體正常代謝十分重要，尤其是酶的表達、免疫系統(tǒng)調(diào)控以及電子傳遞等，鐵缺乏易造成缺鐵性貧血(iron-deficiency anemia,IDA)，進而造成機體功能紊亂，罹患各種疾病[8]。

目前臨床上用于治療IDA的藥物主要是硫酸亞鐵制劑，但游離Fe2+在機體內(nèi)可產(chǎn)生內(nèi)源性自由基，造成細胞氧化損傷，還有較大的胃腸刺激性，不利于鐵的消化吸收[9]。因此近年來以多糖鐵為代表的新型復合物補鐵劑引起了人們的廣泛關注。多糖鐵以三價鐵(Fe3+)為核心，鐵元素以穩(wěn)定的配合物形式存在，對胃腸道無或甚少刺激作用，在體內(nèi)釋放后會被還原成二價鐵(Fe2+)后吸收利用[10]。多糖鐵具有副作用小、配合性穩(wěn)定、溶解度好、含鐵量高等優(yōu)點，可為IDA的治療提供新的解決方案[9-11]。但以膠類物質(zhì)為鐵受體的復合物則鮮有報道，尤其是低分子質(zhì)量膠-鐵復合物的研究。因此，本實驗聚焦于芬頓氧化降解法制備LMWFG-Fe(Ⅲ)的研究，并對其進行了分離純化、理化性質(zhì)表征以及體外模擬釋放動力學的研究，旨在拓展亞麻籽膠的應用深度，并為治療IDA提供新的解決方案。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

亞麻籽膠；雙氧水(30%)、七水合硫酸亞鐵、乙酸、乙酸鈉、1,10-鄰菲羅林、抗壞血酸、3,5-二硝基水楊酸、酒石酸鈉、苯酚、硫酸，均為分析純；葡聚糖標準品，分子質(zhì)量分別為1 100、150、50、1 ku；模擬胃液：2 g NaCl、7 mL HCl、3.2 g胃蛋白酶溶解于1 L水中制備得到[12]。

1.2 儀器與設備

DF-101S型集熱式磁力攪拌器；722s型紫外可見分光光度計；LC-20AD高效液相色譜儀；Scientz-10N 型冷凍干燥機；VERTEX70型傅里葉紅外光譜儀；Miniflex600型X射線衍射理學儀。

1.3 實驗方法

1.3.1 芬頓氧化法降解亞麻籽膠實驗條件的確定

1.3.1.1 單因素實驗設計

研究雙氧水添加量、Fe2+添加量、pH、溫度、反應時間對亞麻籽膠降解率的影響。將亞麻籽膠溶于特定pH的緩沖液中(醋酸-醋酸鈉緩沖液，NaAc-HAc)，磁力攪拌狀態(tài)下依次加入雙氧水、硫酸亞鐵溶液，控制特定的溫度和反應時間，反應在DS-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器中進行，反應過程中用磁力攪拌子不斷攪拌，反應結(jié)束后測總糖及還原糖含量[13-14]，以還原性末端糖基得率按式(1)計算亞麻籽膠降解率[15]。

(1)

1.3.1.2 正交實驗設計

由于亞麻籽膠在芬頓氧化降解過程中不僅受到雙氧水添加量、Fe2+添加量、pH、溫度、反應時間的單獨影響，而且這些因素之間還存在復雜的交互作用，因此在單因素實驗的基礎上設計四因素三水平L9(34)正交實驗，以確定最佳降解條件。

1.3.2 大孔樹脂分離純化降解產(chǎn)物

降解產(chǎn)物經(jīng)真空抽濾除去未降解大分子，得到降解糖液。由于原料亞麻籽膠屬天然植物提取物，因此降解糖液中疑似含有黃酮、皂苷、生物堿等非糖成分，這對產(chǎn)品的后期分析會產(chǎn)生一定影響，因此采用HZ-814大孔樹脂進行純化處理[16]，進行動態(tài)吸附實驗，以糖保留率、鐵保留率以及脫色率為評價指標，分別研究上樣濃度、洗脫速度以及洗脫液體積對純化效果的影響。大孔樹脂吸附結(jié)束后進行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，真空冷凍干燥，得到LMWFG-Fe(Ⅲ)。

1.3.3 鐵的定性鑒別及含量測定

1.3.3.1 定性鑒別

以蒸餾水溶解樣品，得到1 mg/mL的樣品溶液，然后分別采用硫氰酸鉀及亞鐵氰化鉀根據(jù)現(xiàn)象變化及顏色反應定性鑒別Fe3+及Fe2+，滴加硫氰酸鉀后溶液變紅表明有游離Fe3+，滴加亞鐵氰化鉀后有藍色沉淀產(chǎn)生表明有游離Fe2+。

1.3.3.2 定量測定[17]

取適量樣品加1 mol/L HCl充分溶解，適當稀釋后取1.0 mL，先后加入1 mL水、1 mL 10%的鹽酸羥胺溶液、1 mL 0.25%的鄰菲羅林溶液、6.0 mL pH4.5的NaAc-HAc緩沖液，充分混勻，室溫下放置15 min后以蒸餾水為參比測510 nm下吸光度值，然后根據(jù)吸光度和硫酸亞鐵銨標準曲線計算得到總鐵含量。以蒸餾水代替HCl溶解樣品的處理組測量得到游離Fe2+含量。

1.3.4 LMWFG-Fe(Ⅲ)的表征

1.3.4.1 分子質(zhì)量的變化

采用凝膠滲透色譜法(GPC)評價芬頓氧化降解前后亞麻籽膠相對分子質(zhì)量的變化。采用島津液相LC-20AD高效液相色譜儀，TSKgel G6000 PWXL單柱分析，ELSD檢測器(漂移管溫度110 ℃，氣流速度3.0 L/min)，流動相為純水，流速為1.0 mL / min，柱溫40 ℃，分析時間20 min。以葡聚糖標準品(分子質(zhì)量分別為1 100、150、50、1 ku)為對照。

1.3.4.2 紅外光譜(FTIR)表征

采用FTIR探究亞麻籽膠及LMWFG-Fe(Ⅲ)的結(jié)構特征。取1.0 mg左右的樣品及原料亞麻籽膠，采用溴化鉀壓片法充分碾磨后制成薄片上機測定，紅外光譜掃描范圍為4 000～400 cm-1。

1.3.4.3 X射線粉末衍射(XRD)

采用XRD探究亞麻籽膠及LMWFG-Fe(Ⅲ)的晶體結(jié)構。采用Cu靶，Kα輻射源，X射線粉末衍射系統(tǒng)，10°～80° 2θ連續(xù)掃描，掃描速度為5(°)/min，電壓40 kV，電流40 mA，分別測定亞麻籽膠及LMWFG-Fe(Ⅲ)的XRD圖譜。

1.3.5 LMWFG-Fe(Ⅲ)體外模擬釋放動力學研究

分別稱取LMWFG-Fe(Ⅲ)樣品100 mg以及30 mg Fe2(SO)4于15 mL試管中，加入10 mL模擬胃液，漩渦振蕩混勻2 min后轉(zhuǎn)移至透析袋中(截留分子質(zhì)量3 500 u)，置于含有200 mL模擬胃液的燒杯中，溫和磁力攪拌，保持模擬消化體系溫度為37 ℃，進行模擬消化，然后分別在特定時間從燒杯中取1.0 mL消化液進行鐵含量的測定(取出后燒杯中補充1.0 mL模擬胃液)，計算鐵釋放率，然后以時間為橫坐標，鐵釋放率為縱坐標做圖，得到鐵釋放動力學曲線。根據(jù)所得到的數(shù)據(jù)按以下公式進行擬合，匹配動力學模型，得到相關參數(shù)，探究鐵釋放機理[18]。

零級模型:Mt/M∞=C0+k0t

(2)

一級模型: logMt/M∞=k1t/2.303+C1

(3)

Higuchi模型:Mt/M∞=kHt1/2+CH

(4)

Hixson-Crowell模型: (Mt/M∞)1/3=kHCt+CHC

(5)

Korsmeyer-Peppas模型:Mt/M∞=kKPtn

(6)

式中：Mt/M∞為t時刻鐵的累積釋放率；k0、k1、 kH、 kHC、 kKP為相應動力學模型的鐵釋放速率常數(shù)；C0、 C1、 CH、 CHC為擬合方程常數(shù)項；n為Korsmeyer-Peppas模型釋放指數(shù)；t為時間。

2 結(jié)果分析

2.1 芬頓氧化法降解亞麻籽膠實驗條件的確定

在其他反應參數(shù)固定的條件下，通過單因素實驗，分別得到了各因素的最佳實驗結(jié)果(圖1)，即雙氧水添加量為亞麻籽膠質(zhì)量的10%，F(xiàn)e2+添加量為雙氧水摩爾量的1/2，溫度為75 ℃，pH3.0，反應時間2.0 h?？紤]到降解時間對反應結(jié)果的影響不大，因此在單因素實驗結(jié)果的基礎上，固定反應時間為2.0 h，選擇雙氧水添加量、Fe2+添加量、溫度、pH進行4因素3水平[L9(34)]正交實驗設計(見表1)，以確定芬頓氧化降解亞麻籽膠的最佳實驗條件，正交實驗結(jié)果見表2。根據(jù)正交結(jié)果分析，雙氧水添加量對降解率影響最大，其次是pH，F(xiàn)e2+添加量和溫度對降解率的影響相對較小。芬頓氧化降解亞麻籽膠的最佳工藝條件為A2B2C3D2，即雙氧水添加量為亞麻籽膠質(zhì)量的10%，F(xiàn)e2+添加量為雙氧水摩爾量的1/2，溫度為80 ℃，pH3.0。由于此條件在正交表中并未列入，故按此條件進行驗證，測得亞麻籽膠降解率為47.83%，優(yōu)于正交表中的實驗值。

圖1 芬頓氧化降解法單因素實驗結(jié)果

水平因素雙氧水添加量/%Fe2+添加量溫度/℃pH161/3604.02101/2703.03141/1802.0

表2 正交實驗結(jié)果

2.2 大孔樹脂分離純化效果評價

分別研究了上樣濃度、洗脫速度以及洗脫液體積對純化效果的影響。結(jié)果表明，在pH 3.0的條件下，HZ-814大孔樹脂最佳吸附工藝條件為上樣濃度10 mg/mL(相當于原料亞麻籽膠的質(zhì)量濃度)、洗脫速度為3 mL/min、洗脫液(蒸餾水)體積為5倍柱體積，在此工藝條件下總糖保留率為83.42%，鐵保留率為94%，脫色率為28.62%，最終洗滌液莫氏反應呈陰性(表明糖分已被完全洗脫)。大孔樹脂吸附后得到的糖液為澄清透明的亮黃色，且旋蒸時起泡現(xiàn)象大大減小，表明皂苷、黃酮、生物堿等雜質(zhì)被有效去除。

2.3 LMWFG-Fe(Ⅲ)中鐵的定性及定量結(jié)果

按正交實驗得到的最佳工藝條件降解亞麻籽膠，平行制備得到了5份LMWFG-Fe(Ⅲ)，產(chǎn)物中鐵的定性及定量測定結(jié)果見表3。由表3可知，加入硫氰酸鉀后溶液顏色無明顯變化，而加入亞鐵氰化鉀后溶液有少許藍色沉淀產(chǎn)生，表明LMWFG-Fe(Ⅲ)中鐵的存在形式為結(jié)合態(tài)的Fe3+和少量的游離Fe2+，通過定量測定可知，5組LMWFG-Fe(Ⅲ)鐵的定量平均值為：總鐵8.97%，結(jié)合態(tài)Fe3+為7.86%，游離Fe2+為1.11%；產(chǎn)物平均得率為43.85%，總糖質(zhì)量分數(shù)平均值為52.61%。產(chǎn)物中鐵的這種存在形式有利于其在胃液中緩釋，從而減輕游離鐵的副作用。

表3 LMWFG-Fe(Ⅲ)中鐵的定性及定量結(jié)果

2.4 LMWFG-Fe(Ⅲ)的表征

2.4.1 芬頓氧化降解前后分子質(zhì)量的變化

根據(jù)GPC的分析原理，大分子先被洗脫，小分子洗脫時間滯后。因此，如圖2a所示，原料亞麻籽膠的分子質(zhì)量遠大于1 100 ku(小的洗脫峰忽略不計)，經(jīng)過芬頓氧化降解之后，亞麻籽膠的大分子單峰分解為四個分子質(zhì)量較小的峰(洗脫時間滯后)，其中第一個峰分子質(zhì)量仍在1 100 ku以上，但峰面積較小，第二及第三個峰分子質(zhì)量介于50～150 ku，第四個面較大的峰分子質(zhì)量在1 ku左右。分子質(zhì)量測定結(jié)果表明亞麻籽膠經(jīng)降解得到的LMWFG-Fe(Ⅲ)分子質(zhì)量明顯減小。

2.4.2 紅外光譜分析

圖2 LMWFG-Fe(Ⅲ)的表征

2.4.3 XRD分析

如圖2c所示，LMWFG-Fe(Ⅲ)與原料亞麻籽膠的XRD圖譜存在較大差異。對于亞麻籽膠，在2θ=21.6°時有一個寬峰，表明亞麻籽膠呈現(xiàn)出無定形態(tài)即非晶體結(jié)構，而LMWFG-Fe(Ⅲ)在22θ=19.9°、21.1°以及29.3°出現(xiàn)了3個尖銳的吸收峰，這表明鐵離子與低分子質(zhì)量亞麻籽膠結(jié)合后產(chǎn)生了新的化合物，信號分別歸屬于α-Fe2O3,Fe3O4以及α-FeOOH[23]。這也表明低分子質(zhì)量亞麻籽膠中的羥基或羧基參與了與鐵離子的締合作用，從而形成了新的鐵化合物晶體網(wǎng)絡結(jié)構。

2.5 LMWFG-Fe(Ⅲ)中Fe3+的體外模擬釋放動力學

胃液是鐵消化吸收的重要環(huán)境，因此本實驗研究了LMWFG-Fe(Ⅲ)在模擬胃液中的對Fe3+的緩釋效果，以游離鐵鹽Fe2(SO4)3為對照，鐵釋放曲線如圖3所示，由圖可知，在相同的時間點，LMWFG-Fe(Ⅲ)中Fe3+的釋放率遠低于游離鐵鹽Fe2(SO4)3，例如在3.0 h時，LMWFG-Fe(Ⅲ)以及Fe2(SO4)3中Fe3+的釋放率分別為49.89%以及79.78%，經(jīng)過5.0 h的模擬消化后，實驗組以及對照組的Fe3+累積釋放率分別為55.90%以及92.92%，這表明LMWFG-Fe(Ⅲ)在模擬胃液中能夠很好地起到緩釋Fe3+的作用，可潛在制備成一種新型無副作用的膳食鐵制劑。對釋放曲線進行動力學方程擬合，結(jié)果如表4所示，根據(jù)最佳擬合R2值可知，LMWFG-Fe(Ⅲ)及Fe2(SO4)3中Fe3+釋放動力學均符合Korsmeyer-Peppas模型，n值分別為0.594 6和0.637 0。對于球狀藥物顆粒，當n≤0.43時，釋放機制屬于費克擴散，當0.43

圖3 LMWFG-Fe(Ⅲ)及Fe2(SO4)3中Fe3+鐵釋放曲線

動力學模型LMWFG-Fe(Ⅲ)R2knFe2(SO4)3R2kn零級0.8890.0881—0.92730.1552—一級0.77430.2579—0.82180.2821—Higuchi0.96070.2769—0.98010.4822—Hixson-Crowell0.81870.0593—0.86370.0759—Korsmeyer-Peppas0.96590.24020.59460.98270.36630.637

3 結(jié)論

芬頓氧化降解法可有效降解亞麻籽膠得到低分子質(zhì)量亞麻籽膠鐵復合物，在最優(yōu)反應條件下，亞麻籽膠降解率可達47.83%，LMWFG-Fe(Ⅲ)得率為43.85%，總糖質(zhì)量分數(shù)為52.61%，亞麻籽多糖分子由原來的大分子質(zhì)量單峰轉(zhuǎn)變?yōu)?個小分子質(zhì)量峰，產(chǎn)物的總鐵質(zhì)量分數(shù)為8.97%，且大多以結(jié)合Fe3+形式存在。鐵離子與低分子質(zhì)量亞麻籽膠中的羥基或羧基之間以共價或配位結(jié)合的形式形成了穩(wěn)定的晶體網(wǎng)狀結(jié)構。LMWFG-Fe(Ⅲ)在模擬胃液中能夠有效緩釋Fe3+，釋放動力學符合Korsmeyer-Peppas模型，釋放機制屬于非費克擴散。