李恩杰，湯曉玲，吳哲明，鄭仁朝

(浙江工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，浙江 杭州 310014)

腈水解酶(nitrilase，EC 3.5.5.1)是一類重要的生物催化劑，能一步催化腈類化合物合成相應(yīng)的羧酸和氨[1-3]。腈水解酶在自然界中廣泛存在于真菌、細(xì)菌和植物體中[4]，具有反應(yīng)條件溫和、特異性高和立體選擇性嚴(yán)格等優(yōu)點(diǎn)[5-6]。腈水解酶的高立體選擇性、高催化活力等特點(diǎn)使其在制備手性羧酸中具有明顯優(yōu)勢[7-9]，廣泛應(yīng)用于維生素、有機(jī)酸、氨基酸等化工產(chǎn)品和醫(yī)藥中間體的生物合成[10-12]。

普瑞巴林(Pregabalin)化學(xué)名為(S)-3-氨甲基-5-甲基己酸，是抑制性神經(jīng)遞質(zhì)γ-氨基丁酸的結(jié)構(gòu)類似物。普瑞巴林為受體激動調(diào)節(jié)劑，能有效降低電壓對鈣離子通道的依賴性，從而減少神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，對治療神經(jīng)痛以及抗癲癇效果良好[13]。由于普瑞巴林良好的治療效果和適應(yīng)證的擴(kuò)大[14-15]，自2005年批準(zhǔn)上市以來，其銷售額逐年遞增，2017年全球銷售額達(dá)到50.65億美元，列全球最暢銷藥物榜第13位，已成為“重磅炸彈藥物”。

普瑞巴林S型異構(gòu)體的藥理活性是R型異構(gòu)體的10倍[16]。因此，手性中心的高效構(gòu)筑是普瑞巴林合成的關(guān)鍵[17]。目前，國內(nèi)外學(xué)者報(bào)道了大量普瑞巴林及其中間體的化學(xué)合成方法，但存在工藝步驟復(fù)雜、拆分試劑昂貴和“三廢”排放高等缺陷，限制了其工業(yè)化生產(chǎn)。如第一代普瑞巴林合成工藝以等濃度的(S)-扁桃酸為拆分試劑，總收率僅為20%，75%原材料變廢棄物[18]。生物催化法因其高立體選擇性、高催化效率和環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)，在手性藥物合成中的潛力巨大。如Xie等[19]篩選獲得Arabidopsisthaliana腈水解酶AtNit1，能夠高選擇性水解外消旋異丁基丁二腈(IBSN)合成普瑞巴林關(guān)鍵手性中間體(S)-3-氰基-5-甲基己酸，轉(zhuǎn)化率達(dá)到45%，產(chǎn)物對映體過量值(e.e.值)可達(dá)97%。但是AtNit1底物耐受性差，且活力較低[20]。Chaudhari等[21]利用腈水解酶水解外消旋3-氨甲基-5-甲基已腈制備普瑞巴林，但該合成路線的底物獲得困難，難以規(guī)?；瘧?yīng)用。因此，挖掘高立體選擇性、高活力的生物催化劑對于實(shí)現(xiàn)普瑞巴林的生物不對稱合成具有重要意義。

本研究以來源于Brassicarapasubsp.的重組腈水解酶BrNit為催化劑，優(yōu)化其水解IBSN合成(S)-3-氰基-5-甲基己酸的反應(yīng)條件，以期為普瑞巴林的高效合成奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種與培養(yǎng)基

腈水解酶基因NIT6，由生工生物工程(上海)有限公司合成；pET28b(+)表達(dá)載體，Novagen公司；大腸桿菌BL21(DE3)，Invitrogen公司。實(shí)驗(yàn)中所用的培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基。

1.2 試劑

蛋白胨、酵母粉、瓊脂粉，Oxoid公司；卡那霉素(Kan)、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，上海生工生物工程股份有限公司。其他試劑均為市售分析純。

1.3 重組腈水解酶工程菌BrNit的構(gòu)建

將表達(dá)載體pET28b(+)和合成的腈水解酶基因(源于B.rapasubsp.，登錄號：BAG72074.1)分別用XbaⅠ和XhoⅠ進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物用T4連接酶在16 ℃下連接16 h，得到重組表達(dá)質(zhì)粒pET28b(+)-NIT6。將表達(dá)載體pET28b(+)-NIT6轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)獲得基因工程菌E.coliBL21(DE3)/pET28b(+)-NIT6。

1.4 重組腈水解酶靜息細(xì)胞的制備

從活化平板上挑取單菌落至裝有50 mL LB培養(yǎng)基(含50 μg/mL Kan)的250 mL搖瓶中，在37 ℃、150 r/min下培養(yǎng)7 h。按2.0%的接種量接種至100 mL LB培養(yǎng)基(含50 μg/mL Kan)中，在37 ℃、150 r/min下培養(yǎng)2 h至OD600為0.6左右，加入0.1 mmol/L的 IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，在28 ℃、150 r/min條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)12 h。離心收集菌體(8 000 r/min離心10 min，4 ℃)，經(jīng)0.9%的生理鹽水洗滌后，收集菌體存放于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 pH對水解反應(yīng)的影響及pH穩(wěn)定性

研究不同pH對BrNit水解反應(yīng)的影響，分別為磷酸鈉緩沖液(pH 6.0～7.5)、Tris-HCl緩沖液(pH 7.5～9.0)和Gly-NaOH緩沖液(pH 9.0～10.0)，濃度都為100 mmol/L。反應(yīng)體系：10 mL各緩沖液，150 mmol/L IBSN，10 g/L濕菌體，在30 ℃、150 r/min條件下反應(yīng)30 min，氣相色譜法檢測轉(zhuǎn)化率和e.e.值。以最高酶活為100%計(jì)算。

分別考察在pH 8.0和9.0條件下BrNit的穩(wěn)定性，取濕菌體重懸于pH 8.0和pH 9.0的Tris-HCl緩沖液中(質(zhì)量濃度30 g/L)，于4 ℃下保存，每隔一定時間取出菌懸液加入到Tris-HCl緩沖液中，使菌體終質(zhì)量濃度為10 g/L，并調(diào)節(jié)pH至8.0，加入IBSN至終濃度150 mmol/L，在30 ℃、150 r/min條件下反應(yīng)30 min，取樣進(jìn)行氣相檢測。以時間為橫坐標(biāo)、ln(殘留酶活)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性擬合，計(jì)算不同pH下BrNit的失活速率常數(shù)(Kd)和半衰期(t1/2)，計(jì)算見式(1)～(2)。

(1)

(2)

式中：[E]為t時刻的酶活，[E0]為初始酶活，Kd為一級反應(yīng)失活常數(shù)，Xt為時間。

1.6 溫度對水解反應(yīng)的影響及溫度穩(wěn)定性

考察不同溫度對BrNit水解反應(yīng)的影響，反應(yīng)體系：10 mL的Tris-HCl緩沖液(pH 8.0)，濕菌體10 g/L，IBSN濃度150 mmol/L，150 r/min下反應(yīng)30 min，氣相色譜法檢測轉(zhuǎn)化率和e.e.值。以最高酶活為100%計(jì)算。

分別考察30和35 ℃下BrNit的溫度穩(wěn)定性，取濕菌體懸于Tris-HCl緩沖液(pH 8.0)中(終質(zhì)量濃度10 g/L)，置于30和35 ℃下保溫，每隔一定時間取出10 mL菌懸液，加入IBSN至終濃度150 mmol/L，在30 ℃、150 r/min條件下反應(yīng)30 min，取樣進(jìn)行氣相檢測。以時間為橫坐標(biāo)、ln(殘留酶活)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性擬合，計(jì)算不同溫度下BrNit的失活速率常數(shù)(Kd)和半衰期(t1/2)。

1.7 金屬離子對水解反應(yīng)的影響

考察金屬離子對BrNit催化IBSN水解的影響。反應(yīng)體系：10 mL的Tris-HCl緩沖液(pH 8.0)，濕菌體10 g/L，IBSN濃度150 mmol/L，加入金屬離子至終濃度5 mmol/L，在30 ℃、150 r/min條件下反應(yīng)3 h，氣相色譜法檢測轉(zhuǎn)化率和e.e.值。以不添加任何金屬離子為參比。

1.8 底物濃度對細(xì)胞轉(zhuǎn)化速率的影響

考察底物濃度對BrNit轉(zhuǎn)化速率的影響，反應(yīng)體系：10 mL的Tris-HCl緩沖液(pH 8.0)，濕菌體10 g/L，加入不同濃度的底物至反應(yīng)體系底物的終濃度為20～200 mmol/L，在30 ℃、150 r/min條件下反應(yīng)30 min，氣相色譜法檢測轉(zhuǎn)化率和e.e.值。

1.9 底物、產(chǎn)物分析方法

反應(yīng)液中底物、產(chǎn)物的光學(xué)純度由氣相色譜法測定。氣相色譜儀為6890N(Agilent公司)，色譜柱為毛細(xì)管柱BGB-174(BGB Analytik公司)。載氣為高純He，載氣流量1.6 mL/min，分流比為30∶ 1，檢測器、進(jìn)樣口的溫度為220 ℃。柱溫初始溫度為120 ℃，保持14 min，再以10 ℃/min升溫至170 ℃保持9 min。根據(jù)e.e.值計(jì)算底物、產(chǎn)物濃度及轉(zhuǎn)化率(c)[22]。

取反應(yīng)液200 μL，加入50 μL 2 mol/L HCl終止反應(yīng)，加入800 μL乙酸乙酯萃取，12 000 r/min振蕩1 min后離心，取上清液至1.5 mL離心管中，加無水Na2SO4干燥。取有機(jī)相，再加入15 μL純甲醇和30 μL重氮甲烷，進(jìn)行氣相色譜分析。

酶活定義:在30 ℃、pH 8.0條件下，每分鐘產(chǎn)生1 μmol 的3-氰基-5-甲基己酸所需的酶量定義為1個酶活單位(U)。

2 結(jié)果與討論

2.1 pH對水解反應(yīng)的影響及pH穩(wěn)定性

pH的改變可能會使酶的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而影響酶分子的催化部位和結(jié)合部位，另外，pH的改變還會影響底物分子的解離狀態(tài)，進(jìn)而影響底物與酶的結(jié)合[23]。在不同緩沖體系下pH對BrNit水解IBSN的影響結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知：pH 8.0時活力最高，e.e.值達(dá)到98.2%。在pH為7.0～9.0弱堿性環(huán)境下，活力變化不明顯，表明BrNit比較適合在中性以及弱堿性環(huán)境下反應(yīng)。

圖1 pH對BrNit酶活和立體選擇性的影響Fig.1 Effects of pH on activity and enantioselectivityof BrNit

進(jìn)一步對BrNit在pH 8.0和9.0條件下的穩(wěn)定性進(jìn)行研究，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知：BrNit在pH 8.0和9.0條件下的半衰期分別是24.8 h和17.1 h。因此選擇pH 8.0為最適pH。

圖2 BrNit的pH穩(wěn)定性Fig.2 pH stability of BrNit

2.2 溫度對水解反應(yīng)的影響及溫度穩(wěn)定性

在一定溫度范圍內(nèi)，酶的活力會隨著溫度的升高而增高，但是當(dāng)溫度高于最適溫度時，酶的結(jié)構(gòu)可能會被破壞而使酶的活力下降[24]。因此，筆者研究溫度(20～50 ℃)對BrNit水解IBSN的影響，結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知：溫度對e.e.值幾乎沒有影響，BrNit在30 ℃時酶活最高，且30 ℃時產(chǎn)物的e.e.值達(dá)到98.3%，而35 ℃時的酶活僅為30 ℃時的71%，表明該腈水解酶對溫度較為敏感。

進(jìn)一步對不同溫度下BrNit的穩(wěn)定性進(jìn)行研究，結(jié)果如圖4所示。

由圖4可知：BrNit在30和35 ℃下的半衰期分別為17.4和13.1 h。由此可知，BrNit在30 ℃下的穩(wěn)定性較好，30 ℃為最適反應(yīng)溫度。

圖3 溫度對BrNit酶活和立體選擇性的影響Fig.3 Effects of temperature on activity andenantioselectivity of BrNit

圖4 BrNit的溫度穩(wěn)定性Fig.4 The thermal stability of BrNit

圖5 金屬離子對BrNit轉(zhuǎn)化率和立體選擇性的影響Fig.5 Effects of metal ions on conversion rate andenantioselectivity of BrNit

2.3 金屬離子對細(xì)胞催化反應(yīng)的影響

有些金屬離子可以起到穩(wěn)定酶的構(gòu)象的作用，可參與電子傳遞從而對催化反應(yīng)產(chǎn)生影響[25]。筆者考察不同金屬離子對BrNit水解IBSN的影響，結(jié)果如圖5所示。

由圖5可知：幾乎沒有金屬離子對BrNit的催化反應(yīng)有促進(jìn)作用，F(xiàn)e3+、Ni2+、Zn2+、Fe2+和Cu2+對其活力有明顯抑制作用，其中Zn2+、Fe2+和Cu2+抑制更為嚴(yán)重；Zn2+、Cu2+為巰基結(jié)合型金屬離子[26]，其嚴(yán)重的抑制作用說明巰基對該腈水解酶的水解反應(yīng)至關(guān)重要，所以在后續(xù)反應(yīng)中沒添加任何金屬離子。

2.4 底物濃度對反應(yīng)速率的影響

底物耐受性是工業(yè)生物催化過程中的重要指標(biāo)之一。在一定催化劑濃度下，反應(yīng)速率隨著底物濃度的增加而增加，但是底物濃度過高則會使酶的活力下降，甚至對其選擇性也會產(chǎn)生影響[27]。筆者考察底物濃度對反應(yīng)速率(v)的影響，結(jié)果如圖6所示。

由圖6可知，底物濃度的變化對該酶選擇性幾乎沒有影響。當(dāng)?shù)孜飶?0 mmol/L增至180 mmol/L時，初始反應(yīng)速率顯著增加，從0.3 mmol/(L·h)增加到2.98 mmol/(L·h)。當(dāng)?shù)孜餅?00 mmol/L時，反應(yīng)速率下降為2.7 mmol/(L·h)，表明高底物濃度對酶活力產(chǎn)生抑制。因此，選擇180 mmol/L為最適底物濃度。

圖6 底物濃度對BrNit反應(yīng)初速率和立體選擇性的影響Fig.6 Effects of concentration of IBSN on initial reactionrate and enantioselectivity of BrNit

圖7 BrNit水解IBSN反應(yīng)進(jìn)程Fig.7 Progress of hydrolysis of IBSN by BrNit

2.5 全細(xì)胞生物催化選擇性水解IBSN反應(yīng)進(jìn)程

考察在最適反應(yīng)條件下，全細(xì)胞生物催化選擇性水解IBSN的反應(yīng)進(jìn)程，結(jié)果如圖7所示。

由圖7可知：隨著反應(yīng)的進(jìn)行，產(chǎn)物的e.e.值基本保持不變，始終保持在97%以上，反應(yīng)到6 h時，轉(zhuǎn)化率達(dá)到45.1%，e.e.值達(dá)到97.9%。

3 結(jié)論

利用重組腈水解酶工程菌催化IBSN水解合成(S)-3-氰基-5-甲基己酸，對其反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化。BrNit菌體最適溫度為30 ℃，最適pH為8.0，最適底物濃度為180 mmol/L。在此條件下，利用10 g/L濕菌體催化水解180 mmol/L IBSN，反應(yīng)6 h 轉(zhuǎn)化率可達(dá)45.1%，產(chǎn)物(S)-3-氰基-5-甲基己酸的e.e.值達(dá)到97.9%。結(jié)果表明，重組腈水解酶工程菌BrNit具有較高的立體選擇性和催化活性，顯示出較好的工業(yè)化應(yīng)用潛力。但是，該腈水解酶的穩(wěn)定性較差，活力也有進(jìn)一步提高的空間。因此，后期可以對該腈水解酶進(jìn)行分子改造，提高其酶活和穩(wěn)定性。