肖 敏，吳又多，薛 闖

(大連理工大學 生命科學與技術學院，遼寧 大連 116024)

隨著人們生活水平的提高和生產工業(yè)的發(fā)展，化石燃料需求量日益增長，導致原油資源逐漸枯竭且價格逐步上升，同時，化石燃料的大量使用也加劇了一系列環(huán)境問題，如全球氣候變暖和大氣污染等[1]。2009年，美國環(huán)境保護局出臺了可再生燃料標準計劃(RFS2)，發(fā)展可再生生物燃料作為替代能源已成為全球趨勢[2]。丁醇是繼燃料乙醇之后另一個備受矚目的可再生生物燃料，其優(yōu)越的理化性能使其成為潛在的優(yōu)良替代能源。丁醇通常通過生物發(fā)酵法制備得到，生物發(fā)酵法產丁醇的流程一般分為原料選擇、原料預處理、纖維素酶酶解和丁醇發(fā)酵4個部分，本文中，筆者圍繞這4個方面總結了近年來國內外在生物丁醇領域的研究成果。此外，本文重點分析丁醇生產的主要瓶頸，并總結相關研究進展，以期為相關研究人員提供參考。

1 生物丁醇簡介

Weizmann[3]曾在第一次世界大戰(zhàn)期間開創(chuàng)了生物發(fā)酵法生產丙酮-丁醇-乙醇(acetone-butanol-ethanol，ABE)，主要利用丙酮為化工原料生產彈藥，而丁醇則用來生產涂漆。然而在20世紀五六十年代石化合成方法的競爭下，歐洲和北美的ABE發(fā)酵工業(yè)完全停止。

中國的ABE發(fā)酵產業(yè)最早建立于20世紀50年代，同樣在石化產業(yè)的沖擊下，20世紀末所有的ABE生產工廠被關閉[4]。直到近年來，由于石油資源的短缺和環(huán)境問題的凸顯，丁醇作為極具前景的第二代生物燃料再次成為研究熱點。與燃料乙醇相比，生物丁醇有天然的性能優(yōu)勢：①丁醇烷基鏈較長且能量密度高，可與柴油或汽油等傳統(tǒng)化石燃料較好的混溶；②丁醇和商用柴油具有較為接近的黏度值及表面張力值，可在發(fā)動機內部快速霧化，且無需改造現有發(fā)動機構造而直接加入使用[5-6]；③丁醇含氧量為22%，這使得丁醇的燃燒更加清潔，Zhang等[7]和Nigam等[8]也發(fā)現丁醇的添加有助于減少重型柴油機的污染物排放；④丁醇還具有吸濕性小和腐蝕性小的優(yōu)點，不會腐蝕現有的汽油存儲和運輸的基礎設施[8-9]。

生物丁醇可通過厭氧發(fā)酵各類可再生生物質資源中的碳源得到，發(fā)酵微生物主要是一些產溶劑梭菌，如丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)和拜氏梭菌(Clostridiumbeijerinckii)等，它們是革蘭氏陽性和專性厭氧微生物，能夠利用多種碳源代謝，包括多糖、二糖、己糖及戊糖等。以葡萄糖為例，菌株先通過糖酵解途徑將糖轉化為丙酮酸，同時生成大量對菌體對數生長及后期產溶劑代謝至關重要的儲能化合物ATP及還原力NADH。碳流經糖酵解催化轉化后進入產酸期，菌體對數生長狀態(tài)進一步增強，乙酸和丁酸快速積累，引發(fā)發(fā)酵體系pH水平迅速下降，同時氣體產物CO2與H2大量釋放。當酸積累到一定水平時，ABE發(fā)酵進入產溶劑階段，以3∶ 6∶ 1的體積比生產丙酮、丁醇和乙醇。以可再生生物質資源為發(fā)酵原料的丁醇生產不僅有助于農業(yè)廢物的資源化利用，而且可降低生產成本。但是，有些生物質資源具有剛性結構，直接纖維素酶水解獲得可發(fā)酵糖的效率較低，必須經過預處理后，再進行酶解發(fā)酵。

2 生物發(fā)酵法產丁醇的工藝路線

2.1 原料的選擇

目前用于丁醇生產的原料主要來源于淀粉質和糖質原料。淀粉質原料主要是一些塊莖作物，如甘薯、木薯和菊芋等，它們不是主要的糧食作物，且均含有大量碳水化合物。其中，菊芋是一種耐寒耐旱、適應性強的植物，因其產量較高而成為有前景的丁醇生產原料[10]。據報道，在控制pH的條件下，使用菊芋酶水解液發(fā)酵可得到23～24 g/L 總溶劑[11]。另一種產量較高的淀粉質原料是木薯，Li等[12]利用100 g/L木薯粉發(fā)酵產出18.3 g/L丁醇和29.2 g/L 總溶劑。另外，Luo等[13]還發(fā)現小麥淀粉廢水的添加可以提高木薯粉產丁醇的濃度，同時也可降低生產成本。

用于丁醇生產的糖質原料則主要有甘蔗、甜菜和糖蜜等，這些原料無需預處理，壓榨得到的汁液可直接用于酶解發(fā)酵，一定程度降低了生產丁醇的成本[14-16]。Wechgama等[17]曾比較甜高粱莖稈汁、蔗糖汁和甘蔗糖蜜作為原料的發(fā)酵，結果發(fā)現甘蔗糖蜜是最適合丁醇生產的發(fā)酵基質。為了從甘蔗糖蜜發(fā)酵獲得更高的丁醇產量，Wechgama等[18]又對發(fā)酵條件進行優(yōu)化，在最優(yōu)條件下發(fā)酵得到12.55 g/L丁醇和17.96 g/L 總溶劑。雖然這些淀粉質原料和糖質原料含有大量的碳水化合物，且處理方式簡單，但原料來源受限，價格偏高，大量種植會產生與糧爭地的問題，因此近年來逐步轉向以廉價的纖維質資源為原料的丁醇生產工藝，這類原料大致可分為木質生物質、海洋藻類和農業(yè)廢棄物三大類。

木質生物質可以分為軟木和硬木。硬木是被子植物，大多是落葉樹，包括楊樹、柳樹等樹木，它們主要存在于北半球。與硬木不同，軟木來源于針葉樹和裸子植物的樹木，生長速度較快、密度較低[26]。木質生物質具有更靈活的收獲時間，不需要長時間儲存[27]，同時還具有密度高、灰分含量小和戊糖含量低的特性，這使得木質生物質的運輸更加經濟有效[27]。但是，木質生物質較高的木質素含量使其對微生物和纖維素酶具有更強的抵抗力，因此需要在預處理過程中投入更多能量來克服木質生物質的“頑固性”，這也使得成本大大提高。

海洋藻類作為第三代生物燃料的原料，具有不與糧食作物爭地、無需淡水栽培的優(yōu)點，且在生長過程中可以消耗大量CO2，具有突出的環(huán)境效益。此外，海洋藻類生長快速，含有高組分的碳水化合物和少量木質素，甚至有些藻類不含木質素，比如紅藻，這進一步降低了預處理成本[28-30]。目前，一些大型藻類，如綠藻和褐藻，已經用于梭菌發(fā)酵產丁醇，Potts等[31]以綠藻為原料，在酸水解后提取藻多糖進行發(fā)酵，丁醇產率達到0.29 g/g。

農業(yè)廢棄物是目前最具潛力的一類原料，以農作物秸稈和一些廢渣為代表，如玉米秸稈、小麥秸稈和甘蔗渣等，表1列出了幾種代表性的農業(yè)廢棄物的組分。與木質生物質相比，農業(yè)廢棄物含有較少的纖維素組分(大約30%～40%)和木質素組分(大約15%～20%)以及更多的半纖維素組分(大約15%～30%)，這使得農業(yè)廢棄物在處理過程中消耗的能量較少[32]。此外，農業(yè)廢棄物的資源化利用不僅有助于環(huán)境保護，還可以避免對木質生物質原料的依賴，從而減少森林砍伐。因此，目前國內外研發(fā)重點主要集中在秸稈類農業(yè)廢棄物的高效生物煉制方面。

表1 3種國內常見農業(yè)廢棄物的組分

2.2 原料預處理

木質生物質主要由纖維素、半纖維素和木質素構成，半纖維素和木質素將纖維素包裹在內部。預處理可以將纖維素暴露，增加纖維素酶的可及性，從而提高酶解效果。因而，有效的預處理對于成功的酶水解和下游操作是至關重要的[33]。

圖1展示了目前普遍使用的原料預處理方法，主要包括生物法、物理法、物理化學法和化學法。

圖1 常用的原料預處理方法Fig.1 Common methods used for feedstocks pretreatment

其中，生物法預處理采用微生物降解可再生生物質，從而改變其化學組成，這些微生物包括白腐菌、褐腐菌、軟腐菌和細菌[34-36]。其中，白腐菌被認為是處理木質纖維素最有前景的微生物。Zhang等[37]篩選了35株白腐菌，用于處理竹子，他們觀察到Echinodontiumtaxodii2538、TrametesversicolorG20和CoriolusversicolorB1是一類高選擇性降解木質素的白腐菌，可以顯著改善酶促糖化效率[38]。盡管生物預處理具有許多優(yōu)點，如能耗低、處理條件溫和，但菌株生長緩慢、預處理時間長且需要控制生長條件。因此，生物預處理面臨著技術經濟挑戰(zhàn)，在工業(yè)生產上不具有吸引力。

物理法預處理主要是通過碾磨、研磨、切片、超聲和射線等方式來破壞植物細胞的細胞壁結構，減小原料的尺寸，這可以提高下游預處理的效率。但是，在研磨階段能量消耗較高，且若研磨成很小的顆粒反而會對隨后的預處理產生負面影響，導致預處理結果并不理想。值得注意的是，超聲和射線預處理方法本質上屬于物理預處理方法，由于這2種方法不能去除木質纖維素材料中的半纖維素或木質素，所以常將這幾種方法作為其他預處理方法的輔助工藝。其中，射線預處理由于安裝成本太高，很少用于工業(yè)生產[39]。

常用的物理化學法預處理主要有微波、水熱和爆破。其中，微波處理可以盡可能減小微晶纖維素的粒徑(<4 mm)，從而提高糖的產量[40]。Ma等[41]用微波處理稻草，在最佳條件下，纖維素含量從33.4%增加到41.8%，酸溶性木質素含量從2.1%減少到1.9%，總糖化率增加了30.3%。水熱預處理可以在纖維素降解之前去除大部分半纖維素和部分木質素，具有反應器成本低、較少發(fā)酵抑制物形成以及可以直接使用濕物料的優(yōu)點。由于纖維素在高于240 ℃的溫度下會發(fā)生嚴重降解，因此處理溫度通常為160～240 ℃[42-43]。此外，為了提高半纖維素或木質素的去除率，水熱預處理也可以在化學物質催化下進行[44-45]。爆破主要包括蒸汽爆破和氨纖維爆破(AFEX)，它們對環(huán)境的污染較小、產生的毒性物質也較少[46-48]，Horn等[46]在210 ℃下蒸汽爆破處理小麥秸稈10 min時，酶水解產率達到最高。另外，經氨纖維爆破處理過的百慕大草的酶解糖產量也可以達到理論糖得率的94.8%[48]。

化學法預處理大致可以分為酸、堿、有機溶劑和離子液體預處理4種。

由于半纖維素和纖維素的糖苷鍵對酸敏感，酸預處理可溶解木質纖維素材料中的部分半纖維素，從而改善纖維素酶的可及性。在酸處理中，稀H2SO4預處理工藝的經濟性最佳，一直是國內外研究的熱點。Deshavath等[49]在最佳條件(0.2 mol/L H2SO4、121 ℃、120 min)下處理高粱秸稈，97.6%的半纖維素轉化為木二糖、木糖和阿拉伯糖，且糠醛產率僅為4.6 mg/g。

堿預處理過程使得木質纖維素原料中半纖維素和木質素間的酯鍵斷裂，從而促進半纖維素和木質素溶解，使纖維素暴露出來[50]。用于堿處理的試劑主要有NaOH、KOH、Ca(OH)2、Na2CO3和氨水，其中尤以Ca(OH)2預處理方法的效果最優(yōu)，Kim等[51]曾使用此方法去除了87.5%的木質素。與此同時，氨預處理因氨易于回收、腐蝕性小、無毒等優(yōu)點也被廣泛研究[52]，它除了可以去除木質素，還可以通過引發(fā)原料膨脹，增加比表面積，使其易于被纖維素酶水解[53]。

有機溶劑預處理則是通過有機溶劑在酸或堿的催化下破壞木質素和半纖維素之間的化學鍵，從生物質中提取木質素[54]。這個過程的優(yōu)點是溶劑易于回收，提取的木質素也可以被用來生產其他化學品[39,55]。迄今為止，甲醇[56]、乙醇[57]、丙酮[58]和乙二醇[59]等溶劑被用來預處理操作，其中，乙醇由于其低毒性更安全[60-61]。但是，有機溶劑的價格較高，且由于其高揮發(fā)性，需要高壓設備支持，因而難以用于工業(yè)生產中。

相比之下，離子液體是一種高效且“綠色”的纖維素溶劑，離子液體與纖維素分子中的羥基相互作用使得纖維素分子鏈間的氫鍵斷裂，溶解纖維素形成均勻的溶液[61-63]。溶解的纖維素可以在一些抗溶劑中快速沉淀而被回收，如水、乙醇、甲醇或丙酮，Zhu等[64]發(fā)現回收的纖維素與初始纖維素具有不同的宏觀和微觀結構，特別是結晶度降低。此外，再生的木質纖維素的酶水解速率可以提高數倍至數十倍[65]。但是，由于大多數離子液體都非常昂貴，且預處理需要較嚴格的條件，造成工藝成本很高。

2.3 纖維素酶水解

高效的預處理是成功酶解的基礎，而使用合適的纖維素酶進行水解可以有效從可再生生物質中釋放出單糖。纖維素酶是一系列協同將纖維素轉化為葡萄糖的酶的混合物，典型的纖維素酶系統(tǒng)至少需要3種酶來行使這個功能，包括內切-1-4-β-葡聚糖酶(EC 3.2.1.4)、外切葡聚糖酶(EC 3.2.1.91)和β-葡糖苷酶(EC 3.2.1.21)[66-67]。纖維素酶通過吸附、生物降解和解吸3個步驟發(fā)揮作用，然而在水解過程中，纖維素酶活性會降低，這可能是由于其對纖維素的不可逆吸附作用。木質素對酶的非生產性吸附也會對纖維素酶的活性產生不良影響。因此，一些研究確定了幾種消除纖維素酶抑制的方法。Liu等[68]已經證明添加的金屬離子(Ca2+和Mg2+)可以與木質素形成絡合物，增強酶水解。表面活性劑也可以改變纖維素表面的特性，減少酶對纖維素的不可逆結合，防止纖維素酶變性以及與木質素的非生產性結合，Tween 20被證明是可以增強纖維素酶促水解最有效的非離子表面活性劑[69-70]。此外，Erickson等[71]報道了牛血清白蛋白(BSA)可以阻斷木質素與纖維素酶的相互作用從而保護酶活性。Sewalt等[72]則發(fā)現木質素對纖維素酶的不利影響可以通過木質素的氨化和各種含氮化合物的添加來克服。

預處理產生的發(fā)酵抑制物會對酶解過程產生不利影響，需要首先對水解液進行脫毒處理來提高酶解效率。水解液脫毒方法可以分為物理法、化學法和生物法。

物理法脫毒主要包括蒸發(fā)[73]、有機溶劑萃取[74]、離子交換樹脂[75]、活性炭吸附[76]和膜分離[77]，其中最常用的方法是活性炭吸附。Liu等[78]發(fā)現活性炭可以吸附25%的可溶性發(fā)酵抑制物，即羥甲基糠醛(HMF)、糠醛和酚類化合物，用活性炭脫毒后的水解液發(fā)酵可得到13 g/L丁醇，而未經脫毒的水解液發(fā)酵生產的丁醇質量濃度僅為1 g/L。

化學法脫毒是在特定的pH下沉淀有毒化合物或使發(fā)酵抑制物電離，后者能夠改變化合物的毒性程度[79-80]。常見的用來進行化學脫毒的試劑有Ca(OH)2、NaOH和KOH等，其中Ca(OH)2的脫毒效果最佳。

生物法脫毒方分為兩大類：微生物酶的使用和可以改變發(fā)酵抑制物結構的生物試劑的使用[81]。在最近的研究中，Morozova等[82]為了提高丁醇產量，使用了一種微生物聯合體的活性污泥，它只利用木質纖維素水解液中的有毒成分而不消耗碳源，從水解產物中去除了98%的HMF和99%的糠醛。

2.4 纖維素丁醇發(fā)酵工藝

發(fā)酵工藝是決定丁醇產量的重要因素，合適的發(fā)酵策略的選擇能夠大大提高丁醇產量，目前廣泛使用的丁醇發(fā)酵工藝主要有：分步水解發(fā)酵(SHF)、同步糖化發(fā)酵(SSF)和同步糖化共發(fā)酵(SSCF)，其中SHF和SSF是丁醇生物煉制過程中常用的2個工藝。

SHF工藝是將水解和發(fā)酵在各自的最佳條件下分別進行，首先將預處理的可再生生物質通過纖維素酶轉化為可發(fā)酵的糖，然后將可發(fā)酵糖進行滅菌后作為發(fā)酵碳源用于微生物發(fā)酵。目前，大部分研究都是利用SHF工藝來生產生物丁醇，但是，SHF工藝具有一些明顯的缺點。首先，在酶解過程中葡萄糖的積累會對β-葡萄糖苷酶產生抑制作用，導致酶解效果不佳；其次，在SHF工藝中，高溫滅菌不僅會破壞酶解液中的一些營養(yǎng)物質，還會產生少量糠醛和5-羥甲基糠醛[83]。因此，為了克服SHF工藝的缺點，Gauss等[84]開發(fā)了同步糖化發(fā)酵的方法，已在生物乙醇的生產中被廣泛研究，最近開始用于生物丁醇的生產。

SSF工藝是在一個容器中同時進行水解和發(fā)酵，水解過程中產生的糖立即發(fā)酵成丁醇，避免了糖積累對纖維素酶的抑制，從而提高了酶解效率[85]，獲得更高的丁醇產率[86]，有效降低總操作成本。Dong等[87]以玉米秸稈為原料分別采用SHF工藝和SSF工藝進行丁醇發(fā)酵，SSF工藝發(fā)酵得到12.3 g/L丁醇，比SHF工藝發(fā)酵得到的丁醇濃度高出20.6%。另外，Sasaki等[88]以木屑為原料，通過SSF工藝獲得了100%的ABE轉化率。

但是，SSF工藝也有一定的缺點，即酶解和發(fā)酵過程的最佳溫度不同，這可能導致酶解或發(fā)酵效果不佳。Qureshi等[89]評估了在35 ℃、pH 6.8條件下，利用稀酸預處理的小麥秸稈生產ABE的同步糖化發(fā)酵工藝，結果發(fā)現，SSF工藝生產的ABE質量濃度為12 g/L，而SHF工藝生產的ABE質量濃度為13 g/L，產生這樣的結果是由于酶解產糖速度低于梭菌消耗糖的速度。因此，該研究提出了改進SSF工藝的方法，即在較高溫度和較低pH下進行SSF，使環(huán)境有利于纖維素酶水解。此外，Guan等[90]發(fā)現，在SSF的過程中，隨著固載量的增加，發(fā)酵液因變得黏稠而產生了“固體效應”，這會使得發(fā)酵效果變差，丁醇得率大大降低。在SSF工藝中，為實現溶劑產量最大化，使用50 g/L的固載量為最佳，當固載量增加到70 g/L時，會由于酶水解受到阻礙而使得丁醇產量下降，由此可知，很難利用SSF工藝得到高濃度的溶劑[90]。

SSCF工藝是SSF的改進，這個過程通常需要通過對菌株進行基因改造，使其可以同時利用葡萄糖和戊糖，提高酶解發(fā)酵效率，也可以同時使用幾種菌株進行共發(fā)酵來提高糖利用率。SSCF工藝大多是用于生物乙醇的發(fā)酵中，Jafari等[91]首次評估了SSCF工藝對溶劑產量的影響，對比了同步糖化發(fā)酵和同步糖化共發(fā)酵生產溶劑的效果，結果發(fā)現，與SSF相比，SSCF工藝使溶劑產量增加了27%～36%。

3 生物丁醇的研究進展

3.1 生物丁醇的主要瓶頸

盡管ABE發(fā)酵是最古老的大規(guī)模發(fā)酵過程之一，但目前仍面臨許多困難。首先，產溶劑梭菌可以發(fā)酵各種己糖和戊糖，但其優(yōu)先利用的底物是葡萄糖，對其他糖類的利用率較低。如前所述，生物丁醇可由不同種類的原料生產得到，但由于它們含糖的種類不同，菌株很難有效地利用水解液中所有的可發(fā)酵糖，這使得丁醇產率較低。其次，盡管預處理大大提高了酶解效率，是將可再生生物質轉化為生物丁醇的重要步驟，但是在預處理時會產生一些降解副產物，作為纖維素酶和發(fā)酵菌株的抑制物，這些副產物積累到一定程度會給整個過程帶來不利的影響。再次，丁醇對宿主細胞的毒性較高，積累到一定程度會導致微生物自溶，據報道，菌株以可再生生物質作為原料發(fā)酵產生的總溶劑質量濃度通常僅有20 g/L左右[92]，Ezeji等[93]也發(fā)現，在反應器中，當總溶劑質量濃度高于16 g/L時，細胞的生長開始受到抑制。最后，在傳統(tǒng)的ABE發(fā)酵中，副產物丙酮、乙醇和有機酸的產生也影響了丁醇生產的經濟性，分離這幾種產品會增加成本。因此，針對這些丁醇生產的瓶頸，常利用菌株改造和丁醇分離這2種方法來提高丁醇產量。

3.2 菌株改造

3.2.1 提高菌株對底物的利用

用于生產丁醇的原料中大多含有不同種類的己糖和戊糖，針對這些原料進行菌株適應性改造有助于提高糖的利用率和丁醇產量。Li等[94]用低能離子束和N-甲基-N-硝基-N-亞硝基胍對C.beijerinckiiL175進行誘變后分離出突變菌株MUT3，并以甘蔗糖蜜作為底物進行丁醇發(fā)酵實驗，發(fā)現MUT3可有效利用底物中的葡萄糖、果糖和蔗糖，且丁醇質量濃度最大能達到14.9 g/L。此外，在最近的研究中，Zhang等[95]構建的基因工程菌株C.tyrobutyricumCt(Δack)-pscrBAK在以甘蔗汁為底物的發(fā)酵中表現出對蔗糖的高利用率。對于木質生物質和農業(yè)廢棄物來說，其主要的單糖單元為葡萄糖和木糖，由于產溶劑梭菌對木糖的利用率較低，因此需要提高菌株對木糖的利用率。Gu等[96]通過破壞C.beijerinckii中編碼D-木糖阻遏物XylR的基因cbei2385使得D-木糖的消耗顯著增加。Xiao等[97]將C.acetobutylicumATCC 824中編碼D-木糖質子同向轉運體、D-木糖異構酶和木酮糖激酶的基因cac1345、cac2610和cac2612過表達后，對D-葡萄糖、D-木糖和L-阿拉伯糖的混合物進行發(fā)酵，得到的總溶劑比野生型菌株高了24%。這些策略都使得梭菌更適合利用木質纖維素材料生產丁醇。對于海洋大型藻類來說，它們含有一些不被梭菌利用的糖成分，如L-鼠李糖、半乳糖和3,6-脫水-L-半乳糖，這些糖是綠色和紅色大型藻類的主要成分，因此必須通過代謝工程來克服這一障礙，但目前相關的研究還比較少。

3.2.2 提高菌株對丁醇的耐受性

為了克服丁醇對宿主細胞的高毒性，已經在產溶劑梭菌中嘗試了各種代謝工程策略。熱激蛋白(HSP)，也稱為分子伴侶，是細胞應激反應相關的重要蛋白，在蛋白質的合成、轉運、折疊和降解中發(fā)揮重要作用。HSP的表達可以由很多種應激物誘導，包括溶劑和其他生物體內的有毒化學物質[98-101]。熱激蛋白的過表達使得菌株在應激狀態(tài)下具有更高的存活率。在丙酮丁醇梭菌中，groESL過表達將丁醇脅迫引起的生長抑制降低了85%，細胞代謝時間延長了2.5倍[102]。在后續(xù)工作中，Tomas等[101]又證明當細胞受丁醇脅迫時，groESL過表達會使得其他幾種HSP編碼基因的表達增加，包括dnaKJ、hsp18和hsp90。此外，Spo0A是一種反應調節(jié)因子，可作為基因表達的激活因子和抑制因子，Alsaker等[99]發(fā)現spo0A過表達使得與應激反應相關的一些基因表達上調，菌株響應丁醇脅迫的耐受性增加且代謝時間延長。Zhu等[103]通過實驗發(fā)現在培養(yǎng)基中添加谷胱甘肽可以提高細胞的存活率，提出了另一種基因改造的方法，即引入大腸桿菌gshAB基因，使得C.acetobutylicumDSM1731產生谷胱甘肽，以此來賦予宿主菌株更強的丁醇耐受性。為了解決丁醇耐受性的問題，還有一些研究直接轉向其他具有較高丁醇耐受性的菌株，以它們作為平臺宿主來異源表達生物丁醇相關的基因。迄今為止，已開發(fā)出許多非天然丁醇生產菌株，如大腸桿菌[104-105]、釀酒酵母[106]和短乳桿菌[94]等。

3.2.3 提高菌株產丁醇的比例

開發(fā)高丁醇比例或僅含丁醇的產溶劑梭菌可以顯著改善ABE發(fā)酵的經濟性，一些研究希望通過敲除產丙酮和酸途徑的相關基因，或是過表達與產丁醇相關的一些基因，來提高梭菌產丁醇的比例。例如，adc、ctfA和ctfB這3個基因在丙丁梭菌中負責將乙酰乙酰-CoA轉化為丙酮，在ctfA、ctfB和adc單敲除突變體中完全沒有丙酮的形成也證實了這點[107-110]。然而，在ctfA、ctfB和adc單敲除突變體發(fā)酵實驗中，丁醇產量也減少，而乙酸和丁酸產量則增加，這表明丙酮生成途徑對酸重吸收起到重要作用。Jiang等[108]破壞了工程菌株C.acetobutylicumEA 2018中的adc基因后，丙酮產量僅有0.21 g/L，再通過調節(jié)pH和添加甲基紫精的手段控制電子流向，使得菌株產丁醇的比例達到82%。另外，還有一些研究是通過敲除與產乙酸和丁酸的相關基因來提高菌株產丁醇的比例，這些基因分別是pta、ack、ptb和buk。Jang等[111]發(fā)現pta和buk單敲除突變體發(fā)酵的丁醇質量濃度為17.2和15.2 g/L，與野生型C.acetobutylicumATCC 824的11.8 g/L相比，產量有所增加。Shao等[112]發(fā)現buk單敲除也可以提高丁醇產量，基于這個事實，Jang等[111]將pta和buk同時敲除，發(fā)現丁醇占總溶劑的比例提高到0.8，丁醇濃度進一步提高。

3.3 丁醇分離

丁醇分離通常采用發(fā)酵分離耦合的方法，在發(fā)酵的同時將丁醇分離出來，一方面可以得到高濃度丁醇，另一方面可以將丁醇從發(fā)酵液中移除，減輕丁醇對微生物的毒性，從而提高丁醇產量。目前常用的丁醇分離方法主要有吸附、氣提、液-液萃取和滲透汽化等。

吸附是指液體或氣體混合物的其中一種顆粒優(yōu)先附著在固體表面的過程，介孔碳、活性炭、大孔吸附樹脂、高二氧化硅沸石和硅沸石等都可以吸附丁醇，從而達到回收的目的[113-116]。最近，Xue等[117]開發(fā)了一種有效的方法，將細胞固定在纖維基質中，并用活性炭吸附丁醇，在整個原位吸附發(fā)酵過程中產生了54.6 g/L丁醇，通過熱解吸得到含約167 g/L丁醇的冷凝物。雖然吸附具有高選擇性和易操作性，但當吸附劑重復使用時，細菌和培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分會吸附在吸附劑上，導致吸附效率的降低。

氣提是通過鼓泡將氣體介質釋放到生物反應器或塔中，然后通過冷凝器的冷凝從發(fā)酵液中回收揮發(fā)性溶劑的方法。代表性研究是采用間歇式氣提在補料分批發(fā)酵中產生高濃度的丁醇[118]，在此研究中，發(fā)酵共產生113.3 g/L丁醇與172 g/L 總溶劑，當發(fā)酵液中丁醇質量濃度大于8 g/L時進行氣提，自發(fā)相分離后最終產物中含有大于600 g/L的丁醇。此外，發(fā)酵時產生的H2和CO2可以經回收后用到氣提中，并在生物反應器和冷凝器之間的閉合回路中循環(huán)利用[93]。與其他分離技術相比，氣提具有操作簡單、成本低，效率不會因生物質的堵塞而受影響的優(yōu)點[93,119]。但是，氣提過程中需要防止氣泡過多或其直徑太大而影響傳質效果。

液-液萃取是使萃取劑與發(fā)酵液接觸，通過分配系數的不同而使目標產物溶解在萃取劑中的一種方法。許多萃取劑，如油醇[120]、生物柴油[121]、癸醇[122]和甲基化粗棕櫚油[123]，已經被用來從水溶液或發(fā)酵液中提取ABE。在各種萃取劑中，油醇的分配系數相對較高且對微生物無毒性。當以木薯為原料用C.acetobutylicumATCC824發(fā)酵時，使用油醇作為萃取劑產生了35.9 g/L丁醇[124]。原位萃取發(fā)酵是最節(jié)能的一種工藝，但是由于分配系數低，萃取相中的丁醇濃度通常遠低于使用其他技術回收得到的丁醇濃度。此外，在發(fā)酵過程中直接提取丁醇可能會形成乳液并產生萃取劑結垢的問題，導致不完全的相分離和發(fā)酵液污染。

滲透汽化是建立在膜分離技術基礎上的，進料溶液直接與膜的選擇性層接觸，然后將滲透物在冷阱中冷凝回收。很多研究者已經評估了各種聚合物膜的丁醇回收效率，其中聚二甲基硅氧烷(PDMS)復合膜由于其超疏水性、良好的熱穩(wěn)定性和力學穩(wěn)定性而被廣泛研究[125-127]。許多研究希望通過制造疏水性填料混合的復合膜或多層復合膜來改善膜性能。例如，Xue等[128]發(fā)現當沸石混合的PDMS膜整合在發(fā)酵系統(tǒng)中用于丁醇回收時，丁醇產量提高至34.5 g/L，回收后得到含有169.6 g/L丁醇的冷凝物。在最新的研究中，Yang等[129]開發(fā)出了垂直定向兩端開口的碳納米管-聚二甲基硅氧烷復合膜，有效提高了乙醇和丁醇的分離效率。滲透汽化被認為是丁醇回收最具潛力的方法，因為它具有高分離因子且對細胞培養(yǎng)沒有影響，但生物分子、培養(yǎng)基組分和細胞會引起膜污染，導致滲透汽化性能的降低。

最近，汽化滲透過程開始被提出，這個過程是在生物反應器中通過氣提將揮發(fā)性溶劑以蒸汽的形式選擇性地滲透過分離膜，實現與水脫離，獲得目標產物。Xue等[130]在ABE發(fā)酵期間利用汽化滲透，對含有約10 g/L丁醇和17 g/L 總溶劑的玉米秸稈發(fā)酵液進行原位產物回收，最終獲得含有212.0～232.0 g/L丁醇、86.3～115.5 g/L丙酮和8.3～8.6 g/L乙醇的回收冷凝物，而經滲透汽化過程回收的冷凝物中僅含有71.5～77.4 g/L丁醇，35.0～39.8 g/L丙酮和6.3～6.7 g/L乙醇。當使用相同的膜時，汽化滲透過程對ABE溶劑的選擇性比滲透汽化更高，它更像是氣提和滲透汽化的組合，使ABE回收更加高效[130]。

4 展望

生物丁醇具有潔凈、熱值高和腐蝕性小等特點，是最具前景的可再生生物燃料。由于木質纖維素難分解、預處理產生的發(fā)酵抑制物和丁醇毒性等問題使得生產成本較高、丁醇產量較低。其中，預處理的能量消耗是丁醇生產成本較高的主要原因，至今仍未開發(fā)出環(huán)保、經濟、有效的預處理方法，為了尋求適當的預處理策略，未來研究的重點應集中在以下幾個方面。首先，應盡可能減少能量輸入，減少化學品和水的使用；其次，開發(fā)清潔的去木質素劑，最大程度保留己糖和戊糖；最后，減少糠醛、5-HMF和乙酸等發(fā)酵抑制物的產生，避免增加脫毒環(huán)節(jié)。此外，盡管各種丁醇分離技術可以減輕丁醇的抑制作用并提高產率，但設施的建造和分離過程中能量的消耗都會增加丁醇的生產成本。因此，菌株改造成為降低成本的關鍵。一方面，提高菌株對碳源利用，尤其是對戊糖的利用，來提高原料利用率；第二方面，開發(fā)出穩(wěn)健的丁醇高產菌種，同時將經典ABE發(fā)酵轉化為單一丁醇產品的發(fā)酵，可減少不必要的碳流失，有效提高原料轉化率；第三方面，提高菌株對發(fā)酵抑制物和丁醇的耐受性，開發(fā)適用于無需脫毒處理的纖維素料液的生產菌株，節(jié)約能耗并減少廢水產生。總體而言，生物丁醇的煉制工藝需要適當整合預處理方法、菌株改造和丁醇分離技術，通過大量的協調研究進行優(yōu)化，從而獲得高產量、高濃度的生物丁醇以及增值副產品。