張 忠，薄彥樂(lè)，羅儀文，林漢成，王 磊，黃 平，李周儒，陳麗琴

（1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué) 法醫(yī)學(xué)教研室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010030；2.司法鑒定科學(xué)研究院 上海市法醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室上海市司法鑒定專(zhuān)業(yè)技術(shù)服務(wù)平臺(tái)，上海 200063；3.寶雞市扶風(fēng)縣公安局 刑事科學(xué)技術(shù)室，陜西 寶雞 722200；4.徐州醫(yī)科大學(xué) 法醫(yī)學(xué)教研室，江蘇 徐州 221004）

在法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中，面對(duì)火場(chǎng)中發(fā)現(xiàn)的尸體，快速準(zhǔn)確的判斷燒死還是死后焚尸，可為明確死因，判斷火場(chǎng)性質(zhì)提供重要信息[1]。 通常，法醫(yī)根據(jù)尸表特征檢驗(yàn)、呼吸道和消化道有無(wú)炭末沉積以及心血中碳氧血紅蛋白含量檢測(cè)等方法鑒別燒死和死后焚尸[2-3]。 然而，這些方法或依靠主觀經(jīng)驗(yàn)或受限于火場(chǎng)情況，很難客觀準(zhǔn)確地鑒別燒死和死后焚尸[4]。近來(lái)，有學(xué)者利用尸體征象和免疫組織化學(xué)等方法探究燒死尸體的特征變化，包括分析舌尖與牙齒的位置關(guān)系，皮膚水通道蛋白3 等表達(dá)[5-6]。但據(jù)報(bào)道，舌尖位置與燒死的關(guān)系還需要進(jìn)一步的研究證實(shí)[7]。 而免疫組織化學(xué)方法需要昂貴的實(shí)驗(yàn)試劑和復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)流程，限制了其在法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中的應(yīng)用。 因此，燒死的法醫(yī)學(xué)鑒定和研究仍需一種更加簡(jiǎn)便、可靠的實(shí)驗(yàn)手段。

構(gòu)成機(jī)體組織和細(xì)胞的基本物質(zhì)是蛋白質(zhì)、糖、脂肪和核酸等。 外界環(huán)境作用于機(jī)體主要引起相應(yīng)生物分子含量、結(jié)構(gòu)以及化學(xué)基團(tuán)的變化。 燒死通常會(huì)使受害者吸入火場(chǎng)中燃燒所產(chǎn)生的高溫?zé)熿F，對(duì)肺支氣管上皮組織和細(xì)胞產(chǎn)生直接或間接的影響[8]。 傅里葉變換紅外（fourier transform infrared reflection，F(xiàn)TIR）光譜技術(shù)是研究生物組織和細(xì)胞分子結(jié)構(gòu)和化學(xué)基團(tuán)的有效手段，具有靈敏度高、分析速度快、無(wú)損檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)[9]，被廣泛地應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)、食品工業(yè)、藥品檢測(cè)等多個(gè)領(lǐng)域[10-12]。 化學(xué)計(jì)量學(xué)方法是基于統(tǒng)計(jì)學(xué)、計(jì)算機(jī)科學(xué)等學(xué)科的方法和原理，挖掘與處理數(shù)據(jù)信息，獲取復(fù)雜分析體系中的有用信息[13]。 紅外光譜結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法能最大限度地提取光譜信息，具有分析效率高，分析結(jié)果的重復(fù)性和再現(xiàn)性?xún)?yōu)于常規(guī)分析方法等特點(diǎn)。目前，該方法已成功地應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，如血痕形成時(shí)間推斷、血痕種屬鑒別、復(fù)雜性死因鑒定以及皮膚電損傷鑒定等[14-18]。 因此，本研究運(yùn)用FTIR技術(shù)結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)原理算法對(duì)燒死和非燒死肺組織支氣管上皮進(jìn)行分析，旨在為燒死法醫(yī)學(xué)鑒定和研究提供新的輔助性手段。

1 材料與方法

1.1 樣本收集和準(zhǔn)備

收集10 例燒死尸體肺組織，其中男性7 例，女性3 例，平均年齡39.5 歲；20 例非燒死案例肺組織，其中男性11 例，女性9 例，平均年齡41.8 歲，死因包括心血管疾病、顱腦損傷、失血性休克。 以上案例來(lái)源于司法鑒定科學(xué)研究院及內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)教研室。 每例肺組織在左右肺上下葉至少取材4 塊，大小為10 mm×10 mm×3 mm。 經(jīng)4%甲醛固定后常規(guī)制作蠟塊。 對(duì)于肺組織樣本，行連續(xù)切片，一張厚度4 μm，鋪于普通玻璃載玻片上，另一張厚10 μm，鋪于氟化鋇載玻片上。 所有切片常規(guī)方法脫蠟。 將普通玻璃載玻片上的組織行常規(guī)HE 染色。 氟化鋇載玻片上的組織無(wú)需染色，直接進(jìn)行光譜掃描。

1.2 光譜的采集和預(yù)處理

應(yīng)用傅里葉變換紅外光譜儀（Nicolet6700，Thermo Fisher Scientific，美國(guó)）、紅外顯微鏡（Niclot continuum microscope, Thermo Fisher Scientific，美國(guó)）及其配備工作站OMNIC 8.0 采集肺組織支氣管上皮細(xì)胞區(qū)域的紅外光譜。 掃描條件：透射模式，經(jīng)液氮冷卻，室溫，掃描范圍為4 000～900 cm-1，光柵直徑50×50 μm2，掃描次數(shù)為32 次，分辨率為8 cm-1。 每個(gè)樣本檢測(cè)前在氟化鋇載玻片的空白區(qū)域進(jìn)行背景掃描。 燒死組，先在肺組織HE 染色切片上確定肺支氣管上皮區(qū)域，然后于氟化鋇載玻片組織對(duì)應(yīng)區(qū)域采集外光譜；對(duì)照組，直接收集肺支氣管上皮紅外光譜。 應(yīng)用Matlab R2016a（MathWork，美國(guó)）軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)預(yù)處理。 光譜使用9 點(diǎn)SG 平滑轉(zhuǎn)化為二階導(dǎo)數(shù)變換，然后進(jìn)行多元散射校正消除因組織厚度不均導(dǎo)致光譜差異的影響，增強(qiáng)與成分含量相關(guān)的光譜信息。 在本研究中，選取1 800～1000cm-1的生物指紋區(qū)光譜。包括酰胺Ⅰ帶（1600～1690cm-1），酰胺Ⅱ和Ⅲ帶蛋白質(zhì)（1480～1575cm-1,1229～1 301 cm-1）[19]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用PLS Toolbox8.5.2 的Matlab R2016a軟件進(jìn)行主成分分析（principal component analysis,PCA）和偏最小二乘判別分析（partial least squares for discriminant analysis，PLS—DA）。

2 結(jié)果

顯微鏡檢查結(jié)果：與對(duì)照組相比，燒死組肺臟組織支氣管黏膜上皮杯狀細(xì)胞增多，黏液分泌增加，支氣管黏膜充血，細(xì)胞核固定呈柵欄狀排列（圖1）。

圖1 支氣管黏膜上皮組織（HE×40，標(biāo)尺長(zhǎng)度：25 μm）

比較燒死組與對(duì)照組平均光譜，與對(duì)照組相比，燒死組酰胺Ⅰ帶寬度增加且吸收峰高度較低（圖2A）。 燒死組和對(duì)照組光譜數(shù)據(jù)經(jīng)二階導(dǎo)數(shù)變換處理后，酰胺Ⅰ帶、酰胺Ⅱ帶呈現(xiàn)多個(gè)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)吸收峰。 對(duì)照組支氣管上皮的光譜特征在1 651cm-1和1 547cm-1附近， 而燒死組支氣管上皮的光譜特征是在1 689cm-1和1 624cm-1附近。（圖2B）。

圖2 燒死組與對(duì)照組平均光譜和二階導(dǎo)數(shù)變換后吸光度的比較

為進(jìn)一步觀察蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化，對(duì)二階導(dǎo)數(shù)光譜進(jìn)行PCA 分析。 圖3 為PC1 和PC2 得分散點(diǎn)圖，圖中橫坐標(biāo)表示每個(gè)樣本第一主成分得分值， 縱坐標(biāo)表示每個(gè)樣本的第二主成分得分值，前兩個(gè)主成分的累計(jì)可信度已達(dá)78.84 %。 PC1、PC2的得分散點(diǎn)圖顯示，燒死組分布在y 軸的左側(cè)，對(duì)照組分布在y 軸右側(cè)，且兩組樣本間沒(méi)有出現(xiàn)重疊。 此外，從樣本分布的疏密程度來(lái)看，對(duì)照組樣本分布相對(duì)集中，燒死組樣本更加分散（圖3A）。 PC1 的載荷因子圖顯示， 沿著PC1 1 624 cm-1和1 689 cm-1對(duì)燒死組光譜貢獻(xiàn)比較大，在1 651 cm-1和1 547 cm-1對(duì)于對(duì)照組貢獻(xiàn)比較大（圖3B）。

十折交叉驗(yàn)證結(jié)果顯示，當(dāng)潛變量為3 的時(shí)候，交互驗(yàn)證的校正標(biāo)準(zhǔn)偏差值最小，確定最佳潛變量數(shù)為3（圖4A）。使用3 個(gè)潛變量用于建立初始PLS 模型。 PLS-DA 內(nèi)部交叉驗(yàn)證對(duì)燒死組預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，燒死組樣本分布在預(yù)測(cè)值1 周?chē)?，?duì)照組樣本分布在0 周?chē)?，并且燒死組樣本全本分布在紅色分界線以上，分類(lèi)準(zhǔn)確率為100 %（圖4B）。

圖3 PCA 結(jié)果

圖4 交叉驗(yàn)證結(jié)果

3 討論

燒死是法醫(yī)鑒定工作中較為常見(jiàn)的一種死因，然而，受火災(zāi)現(xiàn)場(chǎng)的復(fù)雜性和破壞性以及其他因素影響，常規(guī)輔助檢查方法受到限制，為法醫(yī)工作者帶來(lái)了巨大挑戰(zhàn)。 因此，燒死尸體的鑒定和研究仍需一種更加簡(jiǎn)便、可靠的手段。 致死性燒傷支氣管皮上皮可表現(xiàn)出生活反應(yīng)，如熱呼吸道綜合癥，顯示呼吸道黏膜凝固性壞死，細(xì)胞核變長(zhǎng)呈柵欄狀排列等。 可見(jiàn)圖像提供關(guān)于細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化的信息，但沒(méi)有分子信息。 而FTIR 顯微光譜技術(shù)可以精確檢測(cè)生物組織中的化學(xué)組分及分子結(jié)構(gòu)，并且操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)效率高，已被廣泛地應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)、食品工業(yè)、藥品檢測(cè)等多個(gè)領(lǐng)域。 本研究的目的是利用FTIR 技術(shù)結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法，對(duì)燒死與非燒死尸體肺組織特征光譜進(jìn)行比較分析，力圖尋找一種新的方法，為燒死和死后焚尸的法醫(yī)學(xué)鑒定提供科學(xué)支持。

本研究選取光譜指紋區(qū)波段1 800～1 000 cm-1進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。 酰胺Ⅰ帶為最常用的蛋白質(zhì)分析帶，一般在1 650 cm-1附近，幾乎完全由肽腱的C=O伸縮振動(dòng)產(chǎn)生。 酰胺I 帶的吸收光譜通常是相同的，并且對(duì)蛋白質(zhì)構(gòu)象的改變特別敏感[20]。本實(shí)驗(yàn)中燒死組和對(duì)照組平均光譜在酰胺Ⅰ帶峰形具有明顯差異，峰高偏差和變形表明蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化，這可能是由于熱作用導(dǎo)致的支氣管上皮細(xì)胞蛋白變性[21-22]。二階導(dǎo)數(shù)變換是解決譜帶重疊的常用方法，其中負(fù)峰直接與非衍生譜的中心峰對(duì)齊[23]。 二階導(dǎo)數(shù)變換后燒死組在酰胺I 帶附近出現(xiàn)1 624、1 659、1 689 cm-1三個(gè)特征性吸收峰，三個(gè)特征峰所對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)分別為β-折疊、α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角，在酰胺II 帶附近出現(xiàn)1 547cm-1對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)為α-螺旋[24]。說(shuō)明了燒死肺組織確實(shí)存在客觀的改變。 有研究利用紅外光纖傳感器探測(cè)熱變性過(guò)程中牛血清白蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)變化主要是隨著溫度升高α-螺旋逐漸減少，β-轉(zhuǎn)角和β-折疊增多[25]。

PCA 是一種無(wú)監(jiān)督的統(tǒng)計(jì)方法，經(jīng)常被用來(lái)分析數(shù)據(jù)集之間的差異和相似性，能夠?qū)⒏呔S度數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為低維，同時(shí)保留最重要的分類(lèi)信息，分類(lèi)結(jié)果通過(guò)樣本在一組正交的主成分上投影來(lái)表示[26]。本實(shí)驗(yàn)PCA 結(jié)果顯示，燒死組和對(duì)照組樣本點(diǎn)沿著PC1 完全分開(kāi)，PC1 占總變異的71.94 %，可表征大部分的數(shù)據(jù)特征。 從樣本分布的疏密程度來(lái)看，對(duì)照組樣本分布相對(duì)集中，表明所有正常組織的化學(xué)成分更加相似，而燒死組樣本光譜分布更加分散，表明燒死組樣本支氣管上皮組織差異較大，原因可能是支氣管黏膜所受的損傷程度不同。 與主成分相關(guān)聯(lián)的載荷因子反映變量對(duì)PCA 的貢獻(xiàn)度[27]。 PC1的載荷因子1 624 cm-1（β-折疊）和1 689 cm-1（β-轉(zhuǎn)角）對(duì)PCA 貢獻(xiàn)較高，且燒死組呈正相關(guān)；1 651cm-1和1 547 cm-1（α-螺旋）同樣對(duì)PCA 有較高貢獻(xiàn)度，但是與對(duì)照組呈正相關(guān)，而與燒死組呈負(fù)相關(guān)。 這表明燒死和非燒死組樣本中的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)含量存在顯著差異， 這是光譜數(shù)據(jù)分類(lèi)的客觀依據(jù)。這些蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化可能與焦耳熱引起的蛋白質(zhì)變性有關(guān)，隨著溫度升高α-螺旋逐漸減少，β-轉(zhuǎn)角和β-折疊增多[28]。 本研究展示了FTIR 光譜結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)識(shí)別致死性燒傷支氣管上皮蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化的能力，進(jìn)一步反映了其對(duì)燒死支氣管上皮細(xì)微分子變化的高敏感性。

PLS-DA 是一種具有偏最小二乘回歸性質(zhì)的有監(jiān)督分類(lèi)技術(shù)，是有效的多元分類(lèi)手段，以一組測(cè)量數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，利用偏最小二乘回歸的預(yù)測(cè)值來(lái)實(shí)現(xiàn)分類(lèi)[29]。 利用PLS-DA 對(duì)燒死組和對(duì)照組63 條訓(xùn)練集樣本光譜進(jìn)行判別分析。 在模型建立前，關(guān)鍵的一步是潛變量的選取，潛變量是原始變量的線性組合，可以用來(lái)描述一組解釋變量（即，光譜數(shù)據(jù)的矩陣）。潛變量若選擇過(guò)少模型會(huì)出現(xiàn)欠擬合，選擇太多會(huì)引入噪聲，模型會(huì)出現(xiàn)過(guò)擬合[30]。 通常采用交叉驗(yàn)證進(jìn)行潛變量數(shù)的選取[31]。因此，本研究應(yīng)用10 個(gè)交叉驗(yàn)證組執(zhí)行交叉驗(yàn)證，最終選取3 個(gè)潛變量用來(lái)建立PLS-DA 預(yù)測(cè)模型。 本實(shí)驗(yàn)中燒死組和對(duì)照組樣本被準(zhǔn)確的識(shí)別，模型分類(lèi)準(zhǔn)確率達(dá)到100%。評(píng)價(jià)判別模型的最好方法是對(duì)模型進(jìn)行外部驗(yàn)證，但由于實(shí)踐中樣本量不足，本實(shí)驗(yàn)只選用內(nèi)部交叉驗(yàn)證的方法來(lái)驗(yàn)證模型性能。 所以，下一步研究需要收集更多的樣本，提高該模型的預(yù)測(cè)能力。

綜上所述，本研究初步探討了燒死和非燒死尸體支氣管上皮組織的光譜學(xué)變化，并通過(guò)PCA 分析了燒死組與對(duì)照組之間的差異，建立了PLS-DA 判別模型，對(duì)燒死樣本進(jìn)行分類(lèi)，為下一步模型參數(shù)的優(yōu)化以及燒死樣本的預(yù)測(cè)奠定了基礎(chǔ)，為燒死案件的法醫(yī)學(xué)鑒定提供科學(xué)依據(jù)，也為其他死因的法醫(yī)學(xué)研究提供了參考。