鄭婷婷，張文杰，嚴(yán)亮，龔?fù)瘳?，王雪峰，廖?guó)周，谷大海，范江平，*

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南昆明650201；2.普洱茶研究院，云南普洱665000）

多糖（polysaccharide）是由10個(gè)及以上單糖通過糖苷鍵形成的多羥基醛酮類的高分子聚合物。多糖的來源廣泛，主要來源于高等光合植物、真菌、藻類、細(xì)菌等，與蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸一起被視為生物體內(nèi)重要的4種生物大分子物質(zhì)[1]。現(xiàn)代研究表明，多糖具有抗氧化、抗輻射、降血糖、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫等多種生物活性，由于藥用真菌多糖及食用菌多糖具有顯著的免疫調(diào)節(jié)作用和抗腫瘤活性，因此可作為營(yíng)養(yǎng)保健品及治療藥物的重要來源[2-3]。

黃皮疣柄牛肝菌[Leccinum crocipodium（Letellier.）Watliag]，滇中稱為黃癩頭，屬真菌界（Fungi），擔(dān)子菌門（Basidiomycota），傘菌綱（Agaricomycetes），牛肝菌目（Boletales），牛肝菌科（Boletaceae），疣柄牛肝菌屬（Leccinellum）。夏秋季生闊葉林下，分布廣泛，屬樹木外生菌根菌[4-5]。研究表明，黃皮疣柄牛肝菌含有豐富的蛋白質(zhì)，粗纖維、礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分及多酚、多糖等生物活性成分[6]。目前對(duì)黃皮疣柄牛肝菌的研究主要集中在營(yíng)養(yǎng)成分的分析及多酚生物活性的研究[7]，對(duì)黃皮疣柄牛肝菌多糖的研究較少。多糖的提取方法較多，熱水提取法作為多糖提取最常規(guī)的方法之一，具有設(shè)備簡(jiǎn)單，易于操作，成本低廉且對(duì)天然活性物質(zhì)結(jié)構(gòu)影響較小等優(yōu)點(diǎn)。因此，本試驗(yàn)采用熱水法提取黃皮疣柄牛肝菌多糖，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)曲面法進(jìn)行優(yōu)化，得出最佳提取工藝條件，以期為黃皮疣柄牛肝菌多糖活性的深入研究及其開發(fā)利用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮黃皮疣柄牛肝菌：云南易門康源菌業(yè)有限公司；葡萄糖：天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；苯酚：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；濃硫酸：云南楊林工業(yè)開發(fā)區(qū)汕滇藥業(yè)有限公司。所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

HWS28型電熱恒溫水浴鍋：上海一恒科技有限公司；UV-2450型紫外分光光度計(jì)：島津儀器（蘇州）有限公司；HC-3018R高速冷凍離心機(jī)：安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；FW135型粉碎機(jī)：天津泰斯特儀器有限公司；FST-PF-UP普利菲爾實(shí)驗(yàn)室超純水機(jī)：上海富詩(shī)特儀器設(shè)備有限公司；Mettler-Toledo MS104TS分析天平：上海微川精密儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 熱水法提取黃皮疣柄牛肝菌多糖

鮮菌除雜清洗—切片—冷凍干燥—打粉—過80目篩—備用。取0.5 g粉末，以去離子水為溶劑，以一定的液料比、提取溫度和提取時(shí)間熱水提取黃皮疣柄牛肝菌多糖。提取液經(jīng)4 000 r/min離心10 min，取上清，采用苯酚硫酸法測(cè)定多糖含量，計(jì)算提取率。

1.3.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

配置濃度為100 μg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液 0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mL 于 25 mL比色管中，分別補(bǔ)水至1 mL，然后加入5%的苯酚溶液1 mL，搖勻，迅速加入濃硫酸5 mL，搖勻，沸水浴15 min，取出后迅速冷卻至室溫。以去離子水作為空白對(duì)照，在490 nm波長(zhǎng)下測(cè)吸光度，以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：y=0.009 6x-0.003 5，R2=0.999 8。

1.3.3 黃皮疣柄牛肝菌多糖提取率測(cè)定

取1 mL上清液定容于100 mL容量瓶，精確吸取1 mL溶液于比色管，依次加入1 mL 5%的苯酚溶液，搖勻，濃硫酸5 mL，搖勻，沸水浴15 min，取出后迅速冷卻至室溫。以去離子水作為空白對(duì)照，在490 nm處用分光光度計(jì)測(cè)量吸光度。根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算多糖提取率。計(jì)算公式如下：

多糖提取率/%=[（C×V×N）×10-3/m]×100

式中：C為測(cè)得的多糖溶液濃度，μg/mL；V為多糖溶液測(cè)定體積，mL；N為樣品稀釋倍數(shù)；m為樣品質(zhì)量，mg。

1.3.4 熱水法提取黃皮疣柄牛肝菌多糖單因素試驗(yàn)

在熱水法提取黃皮疣柄牛肝菌多糖的過程中，影響多糖提取率最重要的因素為液料比、提取溫度、提取時(shí)間。本試驗(yàn)中，考察提取溫度 40、50、60、70、80 ℃；液料比 10 ∶1、20 ∶1、30 ∶1、40 ∶1、50 ∶1（mL/g）；提取時(shí)間1、2、3、4、5 h對(duì)黃皮疣柄牛肝菌多糖提取率的影響。每組試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

1.3.5 響應(yīng)面優(yōu)化最佳提取工藝

響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)[8-9]：依照單因素試驗(yàn)結(jié)果，通過Design-Exert8.0.6軟件，采用Box-henhnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，采用三因素三水平響應(yīng)面分析法測(cè)定不同參數(shù)對(duì)響應(yīng)值Y—多糖提取率（%）的影響，以確定最優(yōu)提取條件。因素及水平見表1。

表1 響應(yīng)面分析因素水平編碼表Table 1 Response surface analysis factor level coding table

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

本試驗(yàn)設(shè)計(jì)采用Design-Exert8.0.6軟件，圖形制作采用GraphPad Prism 5軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 提取溫度對(duì)黃皮疣柄牛肝菌多糖提取率的影響

固定液料比為 30 ∶1（mL/g）、提取時(shí)間 3 h，考察提取溫度對(duì)黃皮疣柄牛肝菌多糖提取率的影響，結(jié)果見圖1。

由圖1可知，在40℃～50℃范圍內(nèi)，隨著溫度的升高多糖的提取率逐漸增加，當(dāng)溫度達(dá)到50℃時(shí)，多糖的提取率最高，當(dāng)溫度超過50℃后，多糖的提取率開始下降。這是由于黃皮疣柄牛肝菌多糖對(duì)高溫較敏感，用較高的溫度浸提破壞了多糖的結(jié)構(gòu)，造成多糖提取率下降。因此，適宜的提取溫度為50℃左右。

2.1.2 液料比對(duì)黃皮疣柄牛肝菌多糖提取率的影響

液料比對(duì)黃皮疣柄牛肝菌多糖提取率的影響結(jié)果如圖2所示。

圖1 提取溫度對(duì)多糖提取率的影響Fig.1 The effect of extraction temperature on the extraction rate of polysaccharides

圖2 液料比對(duì)多糖提取率的影響Fig.2 The effect of liquid ratio on the extraction rate of polysaccharides

由圖 2 可知，當(dāng)液料比在 10∶1（mL/g）至 30∶1（mL/g）時(shí)，多糖提取率隨液料比的升高而升高。而當(dāng)液料比超過30∶1（mL/g）時(shí)多糖提取率呈下降趨勢(shì)，這可能是因?yàn)槿軇┥贂r(shí)，多糖不能充分溶出導(dǎo)致提取率偏低，溶劑增加有利于多糖的溶出，但是過多的溶劑會(huì)增加后續(xù)蒸發(fā)濃縮時(shí)間，造成多糖損失[10-11]，因此選擇 30 ∶1（mL/g）的液料比較為合適。

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)黃皮疣柄牛肝菌多糖提取率的影響

提取時(shí)間對(duì)黃皮疣柄牛肝菌多糖提取率的影響結(jié)果見圖3。

由圖3可知，在一定范圍內(nèi)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)多糖提取率表現(xiàn)為先增大后減小，提取時(shí)間為3 h時(shí)，多糖的提取率最高。這是因?yàn)槎虝r(shí)間的提取不利于多糖的充分溶解，從而導(dǎo)致提取率較低，長(zhǎng)時(shí)間的提取易使多糖降解導(dǎo)致提取率下降。因此，選擇最適提取時(shí)間為3 h。

圖3 提取時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響Fig.3 The effect of extraction time on the extraction rate of polysaccharides

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化黃皮疣柄牛肝菌多糖提取工藝

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

運(yùn)用Design-Exert8.0.6軟件，采用Box-henhnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，依據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取提取溫度、液料比、提取時(shí)間3個(gè)對(duì)多糖提取率影響較大的因素，采用三因素三水平響應(yīng)面分析法，確定最佳提取工藝。響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Experimental design and results of response surface

2.2.2 回歸模型建立與方差分析

運(yùn)用Design-expert軟件對(duì)表2中的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合，建立二次多項(xiàng)式回歸模型。獲得熱水法提取黃皮疣柄牛肝菌多糖提取溫度（A）、液料比（B）和提取時(shí)間（C）與多糖提取率（Y）的二次多項(xiàng)回歸方程為：

回歸模型方差分析見表3。

表3 回歸模型方差分析表Table 3 The table of regression model variance analysis

結(jié)合表3，可判斷回歸方程中各個(gè)自變量對(duì)黃皮疣柄牛肝菌多糖提取率的影響。由表3可知，模型相關(guān)系數(shù)R2=0.967 1，調(diào)整決定系數(shù)R2Adj=0.908 0，表明該模型擬合程度良好[12]。失擬項(xiàng)P＞0.05，說明實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值之間無(wú)失擬存在，說明該數(shù)字模型具有較好的預(yù)測(cè)性，可用于分析和預(yù)測(cè)黃皮疣柄牛肝菌多糖最佳提取條件。由F值的大小可以判斷，各因素對(duì)多糖提取率影響大小為：液料比＞提取時(shí)間＞提取溫度。

2.2.3 響應(yīng)曲面分析

響應(yīng)面圖形是響應(yīng)值Y與對(duì)應(yīng)的因素構(gòu)成的一個(gè)三維空間在二維平面上的等高線圖，響應(yīng)面圖形分析是將一個(gè)因素固定在零水平，對(duì)其中另外兩個(gè)因素進(jìn)行分析。通過響應(yīng)面圖形可以直觀看出各因素對(duì)響應(yīng)值Y的影響[13-14]。各因素交互作用對(duì)黃皮疣柄牛肝菌多糖提取率影響的響應(yīng)曲面圖見圖4。

如圖4，由溫度和液料比兩者的交互作用可知，當(dāng)溫度不變時(shí)，黃皮疣柄牛肝菌多糖的提取率隨著液料比的增大先上升后下降，當(dāng)液料比不變時(shí)，多糖提取率隨著溫度的升高先上升后下降。

由時(shí)間和溫度兩者的交互作用可知，溫度不變時(shí)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，多糖提取率逐漸上升，之后表現(xiàn)為下降。在提取過程中過高的溫度和過長(zhǎng)的提取時(shí)間會(huì)導(dǎo)致多糖的降解，從而影響多糖的提取率[15]。因此，在多糖的提取過程中溫度不宜過高時(shí)間不宜過長(zhǎng)。

圖4 各因素交互作用對(duì)多糖提取率影響的響應(yīng)曲面圖Fig.4 Response surface diagram of the effect of various factors on the extraction rate of polysaccharides

由液料比和提取時(shí)間的交互作用可知，時(shí)間一定時(shí)，隨著液料比的增加多糖提取率表現(xiàn)為先上升后下降，說明適宜的液料比升溫快，細(xì)胞壁易破裂使多糖溶出。而液料比增加，一定時(shí)間內(nèi)多糖不能完全溶出，多糖提取率反而降低。因此，熱水法提取多糖需要適宜的液料比和提取時(shí)間。

2.2.4 最優(yōu)工藝參數(shù)確定

運(yùn)用Design-expert軟件分析得到最大提取率（Y）時(shí)，與其對(duì)應(yīng)的黃皮疣柄牛肝菌多糖的最佳提取條件為液料比33.41∶1（mL/g），提取溫度50.73℃、提取時(shí)間3.08 h，此條件下多糖提取率理論值為16.91%。采取最佳提取條件驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果，根據(jù)試驗(yàn)條件，優(yōu)化工藝條件為液料比34∶1（mL/g），提取溫度51℃，提取時(shí)間3.1 h，測(cè)得3次驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果平均值為16.67%，與理論值接近。因此，響應(yīng)面優(yōu)化得到的黃皮疣柄牛肝菌多糖提取率工藝參數(shù)是可行的。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)以黃皮疣柄牛肝菌為原料，采用熱水法提取黃皮疣柄牛肝菌多糖，考察料液比、提取溫度和提取時(shí)間對(duì)黃皮疣柄牛肝菌多糖提取率的影響，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面優(yōu)化得到熱水提取法最佳工藝參數(shù)為：液料比34∶1（mL/g），提取溫度51℃，提取時(shí)間3.1 h。該方法操作簡(jiǎn)單，提取率高，且避免了高溫提取對(duì)多糖結(jié)構(gòu)的破壞，易于對(duì)后續(xù)黃皮疣柄牛肝菌多糖的分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定及生物活性研究奠定一定的試驗(yàn)基礎(chǔ)。