吳

（1.四川理工學(xué)院釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川自貢643000；2.成都海關(guān)駐宜賓辦事處，四川宜賓644000）

“曲乃酒之骨”，大曲是白酒釀造中物系、微生物及酶系的載體，在白酒發(fā)酵過(guò)程中具有至關(guān)重要的糖化發(fā)酵生香的作用，其質(zhì)量與白酒品質(zhì)息息相關(guān)[1]。由于大曲制作過(guò)程中受原料、環(huán)境的影響較大，使得大曲中微生物情況十分復(fù)雜，其中含有大量不同種類的真菌和細(xì)菌，尤其是細(xì)菌類群極為豐富。

王曉丹等[2]對(duì)濃香型大曲中的酶系性能指標(biāo)和白酒中的微量成分進(jìn)行了檢測(cè)，探討了大曲酶系與白酒品質(zhì)的關(guān)系，總結(jié)出大曲糖化力高，而蛋白水解酶、酯化酶活力低，長(zhǎng)期使用，白酒質(zhì)量和產(chǎn)量必然出現(xiàn)下降的趨勢(shì)。高亦豹等[3]運(yùn)用PCR-DGGE技術(shù)對(duì)高溫和中溫大曲進(jìn)行細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果表明Weissella cibaria、L.helveticus、L.fermentum、L.panis 等 乳 酸菌在大曲中普遍存在，而Thermoactinomyces sanguinis僅存在于高溫曲中。梁晨等[4]通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)大曲貯存過(guò)程中原核微生物群落結(jié)構(gòu)及風(fēng)味成分的變化規(guī)律進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乳桿菌屬、芽孢桿菌屬、高溫放線菌屬等是大曲中的優(yōu)勢(shì)菌群，且大曲貯存有利于酸、醇、酯的積累且能降低異味物質(zhì)含量。目前白酒行業(yè)還沒(méi)有制定出相對(duì)統(tǒng)一的大曲質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，因?yàn)椴煌貐^(qū)、不同酒企所產(chǎn)大曲的各項(xiàng)指標(biāo)及其中微生物種類均存在較大差異，因此為了深入了解不同產(chǎn)地濃香型大曲的差異，本試驗(yàn)對(duì)四川3個(gè)地區(qū)的4個(gè)不同濃香型酒企所產(chǎn)大曲進(jìn)行質(zhì)量指標(biāo)的測(cè)定，并通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)分析其細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，并結(jié)合質(zhì)量指標(biāo)和細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行相關(guān)性分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大曲樣品分別取自宜賓（最高品溫60℃）、瀘州（最高品溫58℃）和遂寧（最高品溫均為55℃），每組樣品隨機(jī)取3個(gè)平行樣本，一部分置于-20℃冷藏用于大曲基因組的提取，另一部分4℃保存用于大曲質(zhì)量指標(biāo)的測(cè)定。

氯化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氫氧化鈉、可溶性淀粉、L-酪氨酸、干酪素、己酸、無(wú)水乙醇、葡萄糖（均為分析純）：成都市科龍化工試劑廠；硫酸、鹽酸（均為分析純）：重慶川東化工有限公司；福林試劑：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；飽和酚、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、十六烷基三甲基溴化銨（cetyltrimethylammonium bromide，CTAB）（均 為 分 析純）：北京索萊寶科技有限公司；三羥甲基氨基甲烷（Trisbase）（分析純）：美國(guó)Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Lynx6000型高效落地高速離心機(jī)、TSE240VULTS超低溫冰箱：美國(guó)Thermo公司；ChemiDoc XRS+型水平電泳儀：美國(guó)Bio-rad公司；UV-2000型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海尤尼柯有限公司；DZKW-4型恒溫水浴鍋：北京中興偉業(yè)儀器有限公司；BS-2F數(shù)控恒溫?fù)u床培養(yǎng)箱：常州精成國(guó)華儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 大曲質(zhì)量指標(biāo)的測(cè)定方法

大曲水分、酸度、淀粉含量、糖化酶活力、酯化力、液化酶活力、發(fā)酵力、酸性蛋白酶活力均參考文獻(xiàn)[5]中的方法步驟。其中糖化酶活力的定義為1 g絕干曲40℃，pH4.6的環(huán)境下反應(yīng)1 h后，將淀粉水解生成葡萄糖的毫克數(shù)，1 mg即1個(gè)酶活單位（U/g）。液化酶活力是指1 g絕干曲在60℃、pH 6的環(huán)境下反應(yīng)1 h后，液化可溶性淀粉的克數(shù)，1 g即1個(gè)酶活單位（U/g）。蛋白酶活力定義為1 g絕干曲在40℃、pH值為3.0條件下1 min水解干酪素產(chǎn)生1 μg酪氨酸所需的蛋白酶量為1個(gè)酶活力單位（U/g）。

1.3.2 大曲基因組的提取

將同一大曲的3個(gè)平行樣本等量混合后進(jìn)行DNA的提取，本試驗(yàn)采用改良的CTAB[6]法提取大曲中微生物的基因組。

1.4 數(shù)據(jù)處理

大曲質(zhì)量指標(biāo)的試驗(yàn)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用SPSS 19.0軟件中的一般線性模型單因素Duncan法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和相關(guān)性分析。將高通量測(cè)序所得序列與Silva數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，獲得操作分類單位（operational taxonomic units，OTU）分類。再利用SPSS 19.0軟件對(duì)大曲質(zhì)量指標(biāo)和微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同產(chǎn)地大曲的理化特征

水分、淀粉含量、酸度是衡量大曲質(zhì)量的重要指標(biāo)。通常質(zhì)量等級(jí)為一級(jí)的大曲水分含量要求低于13%，淀粉含量低于58%，酸度控制在0.9 mmol/10 g～1.3 mmol/10 g之間[1]。本試驗(yàn)通過(guò)比較4種不同地區(qū)大曲的理化特征，分析其差異，結(jié)果見(jiàn)圖1。

大曲水分含量的高低主要由制曲溫度、發(fā)酵情況和儲(chǔ)存時(shí)間等因素決定，較低的水分含量有利于降低微生物的生長(zhǎng)代謝使得大曲易于保存。由圖1可知4種濃香型大曲的水分含量均在10%～14%之間，從高到低依次是遂寧1、瀘州、遂寧2、宜賓曲樣，且水分差異均達(dá)到顯著水平（P＜0.05），其中僅遂寧1大曲水分含量超過(guò)13%，表明各大曲均得到了良好的儲(chǔ)存，這將有利于大曲中復(fù)雜的菌系得以保存。

圖1 不同產(chǎn)地大曲理化差異Fig.1 Physical and chemical indicators diversity of different regions’Daqu sample

大曲中淀粉是作為微生物生長(zhǎng)代謝的主要能量來(lái)源，其含量可以客觀反映在制曲過(guò)程中大曲的發(fā)酵情況。根據(jù)圖1的結(jié)果，4種大曲的淀粉含量在51%～59%之間，其淀粉含量高低依次是瀘州＞遂寧2＞遂寧1＞宜賓曲樣，且差異均達(dá)到顯著水平（P＜0.05），尤其是宜賓大曲的淀粉含量低于了52%。這說(shuō)明大曲中微生物代謝較旺盛，大曲發(fā)酵良好，有助于大曲中淀粉酶、糖化酶等酶的積累，同時(shí)隨著大曲載體進(jìn)入白酒釀造過(guò)程。

酸度的大小主要是由產(chǎn)酸微生物進(jìn)行有機(jī)酸代謝以及脂肪、淀粉和蛋白質(zhì)的降解[7]形成的，大曲酸度的大小在一定程度上揭示了產(chǎn)酸微生物的活躍性，也能在一定程度上反應(yīng)出脂肪酶和蛋白酶活力的大小。4種曲樣的酸度相差不大，均維持在0.9 mmol/10 g～1.06 mmol/10 g，符合一級(jí)大曲的酸度范圍，其中遂寧2曲樣的酸度最高，且顯著高于其他3種曲樣（P＜0.05），可能含有更豐富的產(chǎn)酸菌。

2.2 不同產(chǎn)地大曲的酶活

大曲中的微生物在經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的生長(zhǎng)代謝后能不斷積累豐富的酶系，這些酶系對(duì)釀酒原料的利用及白酒的呈香呈味起著重要的作用。通過(guò)對(duì)大曲酶活的檢測(cè)，能較好的反應(yīng)不同大曲之間的質(zhì)量差異，檢測(cè)結(jié)果及酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖2。

如圖2所示，4種曲樣的糖化酶活力在630 U/g～730 U/g之間，均具有較高水平，其中遂寧2和瀘州曲樣的糖化酶活力差異不顯著（P＞0.05），宜賓曲樣的糖化酶活力最高達(dá)到729.3 U/g，顯著高于其他3種曲樣；液化酶活力方面，4種曲樣均存在顯著的差異（P＜0.05），宜賓曲樣的液化酶活力最高，達(dá)1.75 U/g，而瀘州曲樣的液化酶活力最低，為1.00 U/g。遂寧兩個(gè)曲樣的液化酶活力在宜賓和瀘州曲樣之間。大曲中的液化酶和糖化酶主要是由霉菌產(chǎn)生，因此糖化酶和液化酶的酶活力的高低可側(cè)面反映出樣品中霉菌生長(zhǎng)繁殖的差異。大曲的糖化酶和液化酶能促進(jìn)原料中的淀粉轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵性糖，可大大提高原料利用率和出酒率，因此高活力的糖化酶和液化酶有利于產(chǎn)酒。結(jié)合圖1各大曲淀粉含量的差異可得，淀粉含量相對(duì)低的大曲，其糖化力和液化力均較高。

由酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算可得，吸光常數(shù)K=95.14，在95～100范圍內(nèi)，因此可作為常數(shù)用于計(jì)算酪氨酸含量。如圖2可得，遂寧1和瀘州曲樣酸性蛋白酶活力差異不顯著（P＞0.05），其余曲樣均差異顯著（P＜0.05），其中遂寧2曲樣的酶活最高，達(dá)到49.1 U/g，宜賓曲樣的酶活最低為28.8 U/g。白酒發(fā)酵是在酸性環(huán)境下進(jìn)行的，大曲中的酸性蛋白酶能在該條件下將原料中的蛋白質(zhì)水解成氨基酸，有助于美拉德反應(yīng)的產(chǎn)生及其他風(fēng)味物質(zhì)的生成，因此酸性蛋白酶活力的高低對(duì)白酒風(fēng)味的形成具有直接的影響。

圖2 不同產(chǎn)地大曲主要酶活差異Fig.2 The main enzyme activity diversity of different regions’Daqu sample

2.3 不同產(chǎn)地大曲的生化指標(biāo)

發(fā)酵力和酯化力是反映大曲產(chǎn)酒和生香能力的重要指標(biāo)，大曲酯化力越高則在白酒釀造過(guò)程中能產(chǎn)生更多的酯類化合物，發(fā)酵力反映了大曲中微生物的生長(zhǎng)繁殖和發(fā)酵速度，可以在一定程度上考察大曲的發(fā)酵性能。4種曲樣的酯化力和發(fā)酵力測(cè)定結(jié)果如圖3所示。

遂寧1和遂寧2曲樣的酯化力分別為11.2 mg/（g·100 h）和13.6 mg/（g·100 h），無(wú)顯著差異（P＞0.05），宜賓和瀘州曲樣的酯化力較遂寧兩個(gè)曲樣高，分別達(dá)到24.5 mg/（g·100 h）和31.4 mg/（g·100 h）且差異顯著（P＜0.05）。發(fā)酵力方面，宜賓、遂寧2和瀘州曲樣的發(fā)酵力并無(wú)顯著差異（P＞0.05），均在0.24 g/（g·72 h）左右，而遂寧1曲樣的發(fā)酵力達(dá)0.57 g/（g·72 h）顯著高于其他曲樣，表明其在接入到發(fā)酵液后微生物的繁殖旺盛，呼吸作用較強(qiáng)，產(chǎn)氣較多。

圖3 不同產(chǎn)地大曲生化指標(biāo)差異Fig.3 The biochemical indicators diversity of different regions’Daqu sample

2.4 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

2.4.1 各大曲樣品中細(xì)菌OTU分類

大曲樣品細(xì)菌Alpha多樣性指數(shù)見(jiàn)表1。

表1 大曲樣品細(xì)菌Alpha多樣性指數(shù)Table 1 Alpha diversity index of Daqu sample’s bacteria

OTU是在系統(tǒng)發(fā)生學(xué)或群體遺傳學(xué)研究中，為了便于進(jìn)行分析，通過(guò)歸類操作，將序列相似性大于等于97%分歸為同一OTU。由表1可知，遂寧1和遂寧2曲樣OTU數(shù)最高，分別為163個(gè)和162個(gè)，其次是宜賓曲樣（96個(gè)），最低的是瀘州取樣（79個(gè)）；此外4個(gè)曲樣的優(yōu)質(zhì)序列分別為18 157條、29 172條、33 850條和25 974條。結(jié)合各大曲樣品的OTU數(shù)量和Ace、Chao等多樣性指數(shù)可判斷，遂寧1和遂寧2曲樣中的細(xì)菌群落多樣性高于宜賓和瀘州曲樣。由于制曲工藝的差別，遂寧兩個(gè)曲樣的最高品溫均為55℃，而宜賓和瀘州曲樣的最高品溫分別達(dá)到60℃和58℃，因此遂寧曲樣細(xì)菌多樣性更豐富的原因可能是由于其生產(chǎn)品溫相對(duì)較低，進(jìn)而有利于各類微生物的生長(zhǎng)和保存。

2.4.2 大曲樣品中細(xì)菌屬的分類

大曲樣品中細(xì)菌屬類分布情況見(jiàn)表2。

表2 大曲樣品中細(xì)菌屬類分布情況Table 2 The distribution of bacterial genus Daqu samples

由表2所示，除去豐度低于1%的菌屬（others），4種曲樣中一共得到20個(gè)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬類，其中，宜賓曲樣的優(yōu)勢(shì)菌屬為魏斯氏菌屬（Weissella，25.23%）、芽孢桿菌屬（Bacillus，19.96%）、高溫放線菌屬（Thermoactinomyces，16.26%） 和 糖 多 孢 菌 屬（Saccharopolyspora，14.79%）；遂寧 1曲樣中葡萄球菌屬（Staphylococcus，26.38%）、Kroppenstedtia屬（12.77%）和芽孢桿菌屬（Bacillus，9.73%）所占比例較高；遂寧2曲樣占主導(dǎo)地位的菌屬為葡萄球菌屬（Staphylococcus，31.62%）、糖多孢菌屬（Saccharopolyspora，15.87%）、Kroppenstedtia屬（11.64%）和芽孢桿菌屬（Bacillus，9.48%）；此外，乳桿菌屬（Lactobacillus，28.96%）、魏斯氏菌屬（Weissella，27.66%）、高溫放線菌屬（Thermoactinomyces，13.12%）、片球菌屬（Pediococcus，7.39%）在瀘州曲樣中為優(yōu)勢(shì)菌屬。整體來(lái)看，宜賓和瀘州曲樣的占主導(dǎo)地位的細(xì)菌類群更為相似，魏斯氏菌屬、高溫放線菌屬等均占較高比例，與王彩虹[8]得到的濃香型大曲優(yōu)勢(shì)菌屬較為一致；但與之不同的是遂寧兩個(gè)曲樣中葡萄球菌屬、Kroppenstedtia屬、芽孢桿菌屬、糖多孢菌屬（Saccharopolyspor）均占其主導(dǎo)地位，各大曲之間細(xì)菌類群和而不同，可能正是由于這種微生物的差異性，導(dǎo)致不同產(chǎn)地的濃香型白酒各具特色。因?yàn)椴煌奈⑸镱惾簩?duì)白酒釀造具有不同的功能和影響，其代謝產(chǎn)物對(duì)白酒的風(fēng)味具有直接的影響，微生物釀造性能的不同是導(dǎo)致同一香型白酒各具特色的主要原因之一。如：魏斯氏菌屬（Weissella）屬于乳酸細(xì)菌，具有代謝乳酸的能力[9]，進(jìn)而生成乳酸乙酯，是白酒釀造中的主要微生物之一[10]。葡萄球菌屬（Staphylococcus）廣泛分布于土壤、空氣、水、灰塵中[11]，在釀造工業(yè)有多次報(bào)道[12-13]，但未見(jiàn)其在白酒生產(chǎn)中具有的功能研究。芽孢桿菌屬（Bacillus）因能形成芽孢而對(duì)環(huán)境具有極強(qiáng)耐受性，是白酒釀造中產(chǎn)酶生香的重要微生物之一[14]。糖多孢菌屬（Saccharopolyspora）屬于放線菌綱下的一類微生物[15]，能產(chǎn)生酶類、維生素、纖維素降解促進(jìn)因子等，是一類安全的生物資源菌，在濃香型大曲中普遍存在。高溫放線菌屬（Thermoactinomyces）具有耐高溫、生長(zhǎng)快的特點(diǎn)，通常中高溫大曲的生產(chǎn)品溫會(huì)超過(guò)55℃，因此高溫放線菌由于其耐高溫及其產(chǎn)蛋白酶和纖維素酶[16]的特性對(duì)大曲生產(chǎn)乃至白酒釀造過(guò)程中均具有重要作用。因此，大曲的生產(chǎn)過(guò)程，實(shí)際也是富集菌群，積累酶系的過(guò)程。

2.5 大曲微生物群落與質(zhì)量指標(biāo)的相關(guān)性分析

利用SPSS數(shù)據(jù)分析軟件，選擇在屬分類下樣品中豐度大于1%的菌屬與液化酶、糖化酶、酯化力、發(fā)酵力、蛋白酶、酸度進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析，研究大曲微生物群落結(jié)構(gòu)與各質(zhì)量指標(biāo)的相互關(guān)系，細(xì)菌群落結(jié)果如表3所示。

表3 大曲細(xì)菌群落與質(zhì)量指標(biāo)相關(guān)性分析Table 3 Daqu bacteria and quality indexs correlation analysis

由表3可知，在所考察的細(xì)菌屬中沒(méi)有與酸度、糖化酶和液化酶呈顯著相關(guān)的菌屬；與酯化力有顯著相關(guān)性（P＜0.05）的菌屬有魏斯氏菌屬（Weissella）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、片球菌屬（Pediococcus）、乳桿菌屬（Lactobacillus），其中魏斯氏菌屬（Weissella）與大曲酯化力呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），片球菌屬（Pediococcus）呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），葡萄球菌屬（Staphylococcus）與酯化力呈負(fù)極顯著相關(guān)（P＜0.01），乳球菌屬（Lactococcus）呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01），說(shuō)明大曲的酯化力高低是由復(fù)雜的微生物群落間共同作用的結(jié)果；與發(fā)酵力有顯著相關(guān)（P＜0.05）的菌屬為鏈霉菌屬（Streptomyces）和短狀桿菌屬（Brachybacterium），鏈霉菌屬（Streptomyces）呈正相關(guān)，短狀桿菌屬（Brachybacterium）呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01）；不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）與酸性蛋白酶活力呈極顯著正相關(guān)。因此，在進(jìn)一步的研究中，將重點(diǎn)關(guān)注那些與質(zhì)量指標(biāo)相關(guān)性顯著的菌群，以進(jìn)一步探討微生物對(duì)大曲質(zhì)量的影響。

3 結(jié)論

對(duì)4個(gè)不同酒廠曲樣的水分、淀粉、酸度、糖化酶活力、發(fā)酵力等質(zhì)量指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定和分析，結(jié)果表明宜賓曲樣的水分、淀粉含量和酸性蛋白酶活力顯著低于其它曲樣（P＜0.05），而糖化酶活力和液化酶活力顯著高于遂寧和瀘州曲樣（P＜0.05）；遂寧1曲樣的水分和發(fā)酵力顯著高于其它曲樣（P＜0.05），其糖化酶、液化酶和酸性蛋白酶活力均處于中上水平；遂寧2曲樣的酸度和酸性蛋白酶活力顯著高于其它曲樣（P＜0.05），而其他指標(biāo)在4個(gè)曲樣中處于中下水平；瀘州曲樣的淀粉含量和酯化力最高，且顯著高于遂寧和宜賓曲樣（P＜0.05），但液化酶和糖化酶活力較低，且液化酶活力顯著低于其他曲樣。綜合來(lái)看，不同產(chǎn)地的大曲樣品質(zhì)量指標(biāo)存在差異，但又各有所長(zhǎng)。通過(guò)對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析可得，遂寧兩個(gè)曲樣的細(xì)菌群落多樣性均高于宜賓、瀘州曲樣。微生物群落方面，宜賓和瀘州曲樣的占主導(dǎo)地位的細(xì)菌類群更為相似，魏斯氏菌屬、高溫放線菌屬等均占較高比例；而遂寧兩個(gè)曲樣中葡萄球菌屬、Kroppenstedtia屬、芽孢桿菌屬、糖多孢菌屬（Saccharopolyspor）均占其主導(dǎo)地位。結(jié)合大曲細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與各質(zhì)量指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，魏斯氏菌屬（Weissella）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）與大曲酯化力的相關(guān)性達(dá)到顯著水平（P＜0.05），片球菌屬（Pediococcus）、乳球菌屬（Lactococcus）與大曲酯化力的相關(guān)性達(dá)到極顯著水平（P＜0.01），因此可推斷大曲的酯化力高低是由復(fù)雜的微生物群落間共同作用的結(jié)果；鏈霉菌屬（Streptomyces）和短狀桿菌屬（Brachybacterium）與發(fā)酵力呈顯著相關(guān)（P＜0.05）；而酸性蛋白酶活力僅與不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）呈極顯著正相關(guān)。通過(guò)本研究能充分了解不同地區(qū)濃香型大曲的質(zhì)量指標(biāo)及細(xì)菌群落的差異，進(jìn)而加深對(duì)不同產(chǎn)地濃香型白酒特色風(fēng)格的認(rèn)識(shí)，從而推進(jìn)四川濃香型白酒行業(yè)的發(fā)展。