李 萍，俞希遠(yuǎn)，顧月清

(中國藥科大學(xué) 工學(xué)院，江蘇 南京 211198)

腫瘤，尤其是惡性腫瘤對人類的生命健康與財(cái)產(chǎn)造成了巨大的威脅，在我國，平均每8分鐘就有一位居民被查出患有惡性腫瘤，而由于我國居民健康意識的缺失，80%惡性腫瘤被確診時(shí)即已到達(dá)中晚期的癥狀表現(xiàn)，此時(shí)不僅治療的效果欠佳，甚至部分患者已經(jīng)失去了治療的意義[1]。因此，腫瘤的早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療在癌癥防治過程中的作用十分重要。研究表明，早期的癌癥經(jīng)過正規(guī)的治療，可達(dá)到較為理想的治療效果，甚至完全治愈。國家衛(wèi)生組織建議把癌癥早期篩查作為一種常規(guī)的居民體檢，以將惡性腫瘤癌扼殺在萌芽之中。2011年，世界衛(wèi)生組織提出，對于惡性腫瘤防治而言，40%可通過預(yù)防避免，40%可通過早期篩查提高生存率，20%可以帶癌生存。

目前，臨床上腫瘤診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”為活體組織檢查及病理切片，但是獲得活體組織存在許多困難，包括對患者的侵入性，以及帶來的固有臨床風(fēng)險(xiǎn)、潛在的手術(shù)并發(fā)癥和經(jīng)濟(jì)損失。此外，一些腫瘤本身不可進(jìn)行活檢，以及手術(shù)本身會增加腫瘤轉(zhuǎn)移的可能性，同時(shí)可能延遲治療，因此活體組織檢查不適合用于腫瘤的早期篩查[2]。

近年來，分子生物技術(shù)蓬勃發(fā)展，液體活檢的潛力及優(yōu)勢逐漸顯露出來。液體活檢具有便捷、無創(chuàng)或低創(chuàng)、異質(zhì)性低以及能提供較為全面的生物信息等優(yōu)勢，在腫瘤的篩查、診斷、治療、預(yù)后等階段均能發(fā)揮重要的監(jiān)測作用，從而引起了廣泛的臨床關(guān)注與研究。液體活檢的主要樣本來源是非侵入性的體液樣本，如血液、尿液、唾液等。用于腫瘤早期篩查的液體活檢常用標(biāo)志物有循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cell,CTC)，循環(huán)腫瘤DNA(circulating tumor DNA,ctDNA)，腫瘤相關(guān)外泌體(exosomes)，和循環(huán)腫瘤microRNA(circulating tumor MircoRNA,ctmiRNA)等。液體活檢的最大優(yōu)勢在于，可對微小病灶實(shí)現(xiàn)"實(shí)時(shí)監(jiān)測"。本文總結(jié)了循環(huán)腫瘤細(xì)胞、循環(huán)腫瘤DNA、腫瘤相關(guān)外泌體、循環(huán)腫瘤microRNA在腫瘤篩查與診斷中的應(yīng)用，為液體活檢技術(shù)進(jìn)一步用于腫瘤篩查與診斷提供一些參考。

1 循環(huán)腫瘤細(xì)胞

循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)是一種外周血中檢測到的由腫瘤部位(包括原發(fā)部位及轉(zhuǎn)移部位)釋放的腫瘤細(xì)胞。目前CTC的逃逸機(jī)制還不清晰，有研究表明可能是通過上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化機(jī)制逃避免疫系統(tǒng)，通過外周循環(huán)系統(tǒng)與淋巴系統(tǒng)進(jìn)入血管中，但是CTC僅存在于腫瘤患者體內(nèi)[3]。CTC的檢測和分子表征是轉(zhuǎn)化癌癥研究中最活躍的領(lǐng)域之一，已有超過400項(xiàng)臨床研究將CTC作為生物標(biāo)志物。CTC研究主要包括(a)腫瘤風(fēng)險(xiǎn)的早期篩查；(b)預(yù)測轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移進(jìn)展的風(fēng)險(xiǎn)(預(yù)后信息)；(c)治療實(shí)時(shí)監(jiān)測；(d)治療靶點(diǎn)和耐藥機(jī)制的鑒定。其中，對于腫瘤篩查，如胃癌、肺癌、前列腺癌篩查等，已有多項(xiàng)臨床試驗(yàn)證明其有效性優(yōu)于包括影像學(xué)在內(nèi)的腫瘤篩查與檢測手段。Ilie及其同事報(bào)道[4]，對患有慢性阻塞性肺部疾病(COPD)的肺癌患者，在臨床影像學(xué)診斷中未檢測到的肺癌時(shí)，即可檢測到CTC陽性(35)。該研究納入168例(68.6%)COPD患者和77例非COPD受試者(31.4%)，其中包括42名對照吸煙者和35名不吸煙的健康人。3%的COPD患者可檢測到CTC陽性(168名患者中的5名)，每年對這5名CTC陽性的患者進(jìn)行低劑量CT掃描監(jiān)測，分別在1至4年內(nèi)檢測到肺部結(jié)節(jié)，從而引導(dǎo)早期肺癌快速切除手術(shù)和組織病理學(xué)診斷。同時(shí)對照組中吸煙人群與不吸煙健康人中均未檢測到CTC陽性與肺部病變。闡明CTC可在腫瘤發(fā)展的更早階段檢測到病變。

CellSearch、微流控等系統(tǒng)是最常見的CTC分離手段。Jiang等[5]收集了21例非小細(xì)胞肺癌軟腦膜轉(zhuǎn)移患者的腦脊液樣本，利用CellSearch系統(tǒng)檢查到20例患者的腦脊液中CTC陽性。Kang[6]發(fā)現(xiàn)，在102例CTC水平大于2%的受試者中，99例受試者患有肺癌，而45例CTC水平低于2%的受試者中，28例為健康人，證明CTC可以作為一種有潛力的胃癌診斷標(biāo)志物。Fan等[7]對卵巢癌患者及良性卵巢疾病的受試者進(jìn)行CTC檢測，結(jié)果顯示，在71例卵巢癌患者中檢測到43例CTC陽性，而良性疾病患者中均未檢測到CTC；特別地，在晚期卵巢癌患者中，CTC的計(jì)數(shù)顯著高于Ⅰ-Ⅱ期患者，說明CTC檢測結(jié)果可輔助卵巢癌診斷。

2 循環(huán)腫瘤DNA

循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA)是指外周血中檢測到的與腫瘤相關(guān)的非細(xì)胞DNA(cell free DNA,cfDNA)，可能由CTC釋放，或是由死亡或脫落的腫瘤細(xì)胞釋放。臨床上與腫瘤篩查及檢測的ctDNA主要有兩類，DNA突變與DNA甲基化[8]。

與CTC類似，ctDNA臨床應(yīng)用的最大難題在于檢測技術(shù)的靈敏度與特異性不足。迄今為止，許多研究團(tuán)隊(duì)正致力于開發(fā)靈敏度高的ctDNA檢測技術(shù)。例如，Maximilian Diehn研究團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一種"腫瘤個體化表達(dá)深度測序"技術(shù)(CAPP-Seq)，用于非小細(xì)胞肺癌的早期診斷(NSCLC)[9]。其設(shè)計(jì)涵蓋多種cfDNA突變的檢測方法，在大于95%的腫瘤患者血液樣本中鑒定出突變，而檢測特異性可達(dá)到96%。雖然在大多數(shù)II-IV期NSCLC患者中檢測到ctDNA，但只有50%的早期NSCLC患者(I期)被鑒定出來。該檢測技術(shù)檢測到的I期腫瘤患者的ctDNA的豐度比晚期腫瘤患者低約10倍。在其他腫瘤中這種差異也存在。因此，需要進(jìn)一步改進(jìn)該技術(shù)，包括增大樣本容量，以獲得臨床認(rèn)可度更高的早期癌癥檢測靈敏度。

在一篇具有里程碑意義的論文中，Diehl等[10]表明，通過監(jiān)測手術(shù)后結(jié)直腸癌患者血漿中的腫瘤特異性突變(包括APC，TP53和KRAS)，監(jiān)測腫瘤復(fù)發(fā)的敏感性甚至可以達(dá)到100%。其他研究中，包括乳腺癌、肺癌、以及口腔鱗狀細(xì)胞癌，均發(fā)現(xiàn)KRAS，APC和TP53突變與腫瘤復(fù)發(fā)存在一致性關(guān)系[11]。

ctDNA的另一種常見形式，DNA甲基化，在腫瘤診斷中也具有很重要的意義。RASSF1A的表觀遺傳失活是癌癥中最常見的分子變化之一，表明RASSF1A甲基化是早期癌癥檢測的具有潛力的生物標(biāo)志物。其異常的啟動子高甲基化狀態(tài)可能在指示女性乳腺癌的高風(fēng)險(xiǎn)性[12]。同時(shí)，對于臨床上已發(fā)生轉(zhuǎn)移的晚期患者，ctDNA檢測的更大意義在于輔助監(jiān)測轉(zhuǎn)移灶的形成。在一項(xiàng)研究中，對手術(shù)切除卵巢和腸腫瘤，后產(chǎn)生骨轉(zhuǎn)移的患者進(jìn)行癌癥相關(guān)基因(包括TP53，PIK3CA和KRAS)進(jìn)行靶向深度測序，結(jié)果表明轉(zhuǎn)移灶源自最初的卵巢癌，從而輔助制定個體化的治療方案，避免了不必要的治療延遲[13]。

但是，對從未患癌的健康人而言，隨著年齡的增長，也可能發(fā)生DNA突變。例如，在年齡超過65歲的人群中有10%可檢測到體細(xì)胞突變[14]。因此，即使檢測到ctDNA，也無法確診腫瘤，更有報(bào)道顯示，ctDNA還與焦慮、輻射等因素相關(guān)[15]。

3 腫瘤相關(guān)外泌體

外泌體在腫瘤中的作用越來越受到研究者的重視。這種直接來源于細(xì)胞，并在細(xì)胞通訊中起到關(guān)鍵作用的細(xì)胞外囊泡，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、耐藥過程中均有著重要意義。外泌體是細(xì)胞釋放的小尺寸的囊泡(粒徑為30～150nm)。1979，首次從癌癥患者外周血中分離得到外泌體[16]。外泌體通過直接激活表面表達(dá)的配體或通過在細(xì)胞之間轉(zhuǎn)移分子而在細(xì)胞與細(xì)胞的通訊中發(fā)揮重要的作用。腫瘤細(xì)胞釋放的外泌體在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的機(jī)制是“雙刃劍”：既可以調(diào)節(jié)局部或全身環(huán)境，給腫瘤的生長和傳播創(chuàng)造條件，也可以調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)引發(fā)或抑制抗腫瘤反應(yīng)[17]。外泌體中富含各種蛋白質(zhì)、DNA、RNA和脂質(zhì)等。研究表明，細(xì)胞的RNA等遺傳信息主要通過外泌體在細(xì)胞間進(jìn)行傳遞[18]，由于外泌體穩(wěn)定的脂質(zhì)雙層膜，RNA等遺傳物質(zhì)可以穩(wěn)定地存在于外泌體中，進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)并參與細(xì)胞間信息傳遞。因此，外泌體中蛋白質(zhì)、核酸等物質(zhì)具有很高的診斷價(jià)值。溫等[19]從膽囊癌的外泌體中篩選出56種上調(diào)的差異miRNA和130 種下調(diào)的差異miRNA可作為液體活檢的標(biāo)志物，其中miR-552-3p上調(diào)最為顯著。提示外泌體的miRNA可用于腫瘤的早期篩查與診斷。Huang等[20]比較了非小細(xì)胞肺癌患者與普通肺炎患者肺組織中的外泌體的表皮生長因子受體的表達(dá) ( epidermal growth factor receptor,EGFR)，發(fā)現(xiàn)非小細(xì)胞肺癌患者的外泌體上EGFR陽性表達(dá)率高達(dá)80%，而肺炎患者肺組織的外泌體EGFR陽性表達(dá)率僅為2%，表明外泌體是一種理想的液體活檢的生物標(biāo)志物。

4 循環(huán)腫瘤microRNA

microRNA是一種內(nèi)源性的微小(18～24nt)非編碼(nc)RNA，主要作用為調(diào)節(jié)真核基因表達(dá)。迄今已經(jīng)鑒定出超過2500種人類microRNA[21]，且近三分之二的基因表達(dá)都會受到microRNA的調(diào)控[22]。目前，循環(huán)腫瘤miRNA(circulating tumor microRNA,ctmiRNA)的研究領(lǐng)域引起了很多研究者的興趣，并且已經(jīng)以指數(shù)速度增長，目前已發(fā)表2000多篇論文。多項(xiàng)研究表明，ctmiRNA可以通過腫瘤來源的外泌體調(diào)控非腫瘤細(xì)胞，從而在癌癥生物學(xué)中發(fā)揮作用，從而促進(jìn)腫瘤發(fā)展，ctmiRNA已被證明可調(diào)節(jié)體內(nèi)微環(huán)境的化學(xué)敏感性，血管生成和細(xì)胞侵襲[23]，傳遞與腫瘤相關(guān)的生物信息，調(diào)節(jié)腫瘤生長和轉(zhuǎn)移。研究者已發(fā)現(xiàn)多種ctmiRNA可作為腫瘤診斷的標(biāo)志物，如miR-10、miR-16、miR-21、miR-155、miR-141、miR-210、miR-221、miR-375等，在肺癌、卵巢癌、乳腺癌等多種腫瘤的早期篩查與診斷中發(fā)揮重要作用。Shimomura等[24]聯(lián)合檢測一組miRNA，包括miR-1246、miR-1307-3p、miR-4634、miR-6861-5p 以及miR-6875-5p，結(jié)果顯示該組合檢測乳腺癌的靈敏度達(dá)到97.3%，特異性為82.9%。

5 結(jié)語

雖然液體活檢目前仍舊不能替代組織活檢，但液體活檢技術(shù)的快速發(fā)展給多種腫瘤的早期篩查與無創(chuàng)診斷提供了可能，多項(xiàng)臨床研究也證明液體活檢技術(shù)的潛力，包括循環(huán)腫瘤細(xì)胞、循環(huán)腫瘤DNA、外泌體、循環(huán)miRNA在內(nèi)的腫瘤標(biāo)志物也極大地拓展了腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究。但是，仍需要大量的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證明液體活檢技術(shù)的臨床有效性，也需要更多新型技術(shù)富集低豐度的循環(huán)腫瘤細(xì)胞、循環(huán)腫瘤DNA、外泌體、miRNA等腫瘤標(biāo)志物，以支撐高靈敏度、高特異性的臨床診斷。