相小超, 焦豐龍, 張養(yǎng)軍, 錢小紅, 秦偉捷

(軍事醫(yī)學(xué)研究院生命組學(xué)研究所, 北京蛋白質(zhì)組研究中心, 國家蛋白質(zhì)科學(xué)中心(北京) 蛋白質(zhì)組學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 102206)

蛋白質(zhì)組學(xué)研究器官、組織或細(xì)胞內(nèi)所有蛋白質(zhì)及其動(dòng)態(tài)變化規(guī)律,本質(zhì)上是在大規(guī)模水平上、從整體角度研究蛋白質(zhì)的特征、動(dòng)態(tài)變化、表達(dá)水平、翻譯后修飾以及蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用等的一門科學(xué)[1]。而從組學(xué)層面對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行研究,仍受多種因素的限制,例如不同蛋白質(zhì)表達(dá)量差異巨大、翻譯后修飾的官能團(tuán)種類繁多、動(dòng)態(tài)范圍廣及蛋白質(zhì)本身的空間結(jié)構(gòu)復(fù)雜等[2],因此,在表達(dá)譜的深度覆蓋、翻譯后修飾的準(zhǔn)確鑒定及蛋白質(zhì)組的定量等方面,現(xiàn)在的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)還存在很多缺陷。為此,近年來,研究者們嘗試將各種功能材料應(yīng)用到蛋白質(zhì)組學(xué)分析中,對(duì)樣品預(yù)處理的分離技術(shù)進(jìn)行優(yōu)化,從而達(dá)到高靈敏度鑒定,高準(zhǔn)確性分析,高通量表達(dá),精確測量生物樣本中蛋白質(zhì)表達(dá)量變化的目的。本文對(duì)功能材料的介紹主要從應(yīng)用于蛋白質(zhì)酶切的功能材料、用于轉(zhuǎn)錄因子富集的功能材料、用于翻譯后修飾蛋白質(zhì)組研究的功能材料以及蛋白質(zhì)組定量研究的功能材料這四個(gè)方面進(jìn)行綜述,并對(duì)功能材料在蛋白質(zhì)組學(xué)方法研究中的應(yīng)用進(jìn)展予以展望,可為功能材料在蛋白質(zhì)組學(xué)方法研究中的應(yīng)用提供參考。

1 功能材料在蛋白質(zhì)酶切中的應(yīng)用

目前,基于生物質(zhì)譜的“bottom-up”研究策略是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的最常用手段,在此策略下,蛋白質(zhì)先被酶切成肽段,再進(jìn)行質(zhì)譜分析,根據(jù)譜圖分析結(jié)果,對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行定量定性分析[3]。因此,酶切是基于質(zhì)譜蛋白質(zhì)組分分析的關(guān)鍵步驟,而傳統(tǒng)溶液酶切時(shí)間較長、酶切效率低,并且存在自切現(xiàn)象,影響了蛋白質(zhì)組學(xué)的深度覆蓋研究,而固定化酶技術(shù)由于可以大幅度提高酶解速度,增加酶活性和穩(wěn)定性,避免蛋白酶自切片段的產(chǎn)生而改善譜圖質(zhì)量,并可反復(fù)使用,得到了廣泛關(guān)注[4]。固定化酶是在一定的空間范圍內(nèi)起催化作用,并能反復(fù)和連續(xù)使用的酶。在固定化酶技術(shù)中,載體材料上的活性基團(tuán)、微環(huán)境、載體的形狀等因素,會(huì)影響載體與酶的親和力,影響固定化酶活力、穩(wěn)定性、重復(fù)使用性及可回收性[5]。所以對(duì)載體材料的研究也變得至關(guān)重要。

磁性納米材料具有比表面積大、可增強(qiáng)酶活性和穩(wěn)定性、磁響應(yīng)性強(qiáng)、易在表面修飾多種功能基團(tuán)等優(yōu)點(diǎn),是固定化酶常用的載體材料,用于蛋白質(zhì)組學(xué)方法的研發(fā)中以應(yīng)對(duì)蛋白質(zhì)組研究面臨的各種挑戰(zhàn)[6]。酶切是蛋白質(zhì)分析方法中的關(guān)鍵步驟之一,為了解決蛋白質(zhì)組分析中快速、完全酶切的問題,楊屹課題組[7]建立了一種新型固定化酶反應(yīng)器,利用磁性納米粒子作為固定化酶載體,通過DNA定向固定化技術(shù)成功地固定堿性磷酸酶(ALP),并利用DNA鏈置換反應(yīng)將胰蛋白酶(trypsin)在溫和條件下置換ALP,從而將胰蛋白酶固定化,實(shí)現(xiàn)了酶的替換。實(shí)驗(yàn)表明,該固定化酶反應(yīng)器具有較好的選擇性和較高的酶切效率,重復(fù)使用10次仍可保持原酶活性的86%。該反應(yīng)器具有高磁響應(yīng)性,便于回收固定酶和重復(fù)使用,節(jié)約實(shí)驗(yàn)成本,可將其廣泛應(yīng)用于各種酶促反應(yīng)中。呂永琴等[8]制備了一種可重復(fù)使用的酶固定化載體AuNP@Fe3O4納米顆粒,該載體由涂覆一層金納米顆粒(AuP)的磁性Fe3O4納米顆粒組成,金納米顆粒充當(dāng)中間配體,然后將胰蛋白酶可逆地固定在該載體上。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,基于該載體材料的固定化胰蛋白酶反應(yīng)器可以在15 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的完全酶切,還可以在蛋白質(zhì)酶切后,利用磁鐵對(duì)納米材料進(jìn)行回收重復(fù)使用。李笑迎等[9,10]還利用孔徑介于2～50 nm的一類介孔材料具有較高的載酶量、較大的比表面積、可調(diào)節(jié)孔徑、良好的化學(xué)穩(wěn)定性等優(yōu)點(diǎn),對(duì)其在固定脂肪酶中的應(yīng)用進(jìn)行了研究,他們先以三乙烯四胺為固化劑,在聚乙二醇介質(zhì)中通過環(huán)氧樹脂聚合反應(yīng)誘導(dǎo)相分離制備出環(huán)氧樹脂大孔聚合物,再以制備好的環(huán)氧樹脂大孔聚合物為模板,制得了毫米級(jí)尺寸的大孔/介孔多級(jí)孔SiO2材料。這種材料是由連續(xù)SiO2納米薄膜構(gòu)建的,不僅具有三維連續(xù)貫通的大孔孔道,而且孔壁上存在大量介孔,能有效提高酶活性,增加載酶量,能使固定化酶易從體系中分離和重復(fù)使用,操作過程簡單且固定化成本降低,是固定化酶的優(yōu)良載體。Singer等[11]制備了具有大孔的功能化介孔二氧化硅納米粒子材料(LP-MSN),并通過銅催化的1,3-偶極環(huán)加成反應(yīng),將兩種不同的乙炔功能化酶(sp-碳酸酐酶和sp-辣根過氧化物酶)固定在獲得的LP-MSN材料的孔中。合成的LP-MSN尺寸范圍約為100 nm,有大至12 nm的孔徑,成為活躍的、穩(wěn)定的、可重復(fù)使用的酶-二氧化硅系統(tǒng),可在幾個(gè)循環(huán)的活性測定期間中保持高活性。錢小紅課題組[12]利用溫敏聚合物對(duì)外界溫度具有響應(yīng)能力的性能,制備了一種新型的基于可溶性溫敏聚合物的固定化胰酶反應(yīng)器,即將N-丙烯酰甘氨酰胺(NAGA)作為溫度響應(yīng)基團(tuán),合成了具有最高臨界溶解溫度響應(yīng)能力的N-丙烯酰甘氨酰胺共聚十一烯醛(poly(NAGA-co-UnAl))溫敏聚合物,再將該溫敏聚合物作為載體材料,制備得到新型可溶性溫敏固定化胰蛋白酶。他們又通過控制反應(yīng)體系溫度使固定化酶對(duì)蛋白質(zhì)樣本實(shí)現(xiàn)了酶解和分離,有效解決了固定化蛋白酶酶解時(shí)存在的固液界面?zhèn)髻|(zhì)阻力和空間位阻的問題,縮短了酶解時(shí)間,提高了酶解效率,實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明該材料在固定化酶技術(shù)應(yīng)用中具有潛力。

功能材料在蛋白質(zhì)酶切過程中的應(yīng)用實(shí)例說明隨著各具特色新型載體的出現(xiàn),將借此制備出各種高效固定化酶反應(yīng)器,為蛋白質(zhì)組深度覆蓋及定量分析發(fā)揮作用。

2 功能材料在轉(zhuǎn)錄因子富集中的應(yīng)用

轉(zhuǎn)錄因子(transcription factor, TF)作為一種具有特殊結(jié)構(gòu),能行使調(diào)控基因表達(dá)功能的蛋白質(zhì)分子,在蛋白質(zhì)表達(dá)中起著至關(guān)重要的作用。但是目前的技術(shù)手段仍不能有效得到深度覆蓋轉(zhuǎn)錄因子。將功能材料用于轉(zhuǎn)錄因子富集中,發(fā)展高效、高特異性的轉(zhuǎn)錄因子富集技術(shù),對(duì)蛋白質(zhì)組學(xué)、基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究至關(guān)重要。為此,謝輝等[13]為了解決轉(zhuǎn)錄因子豐度低、難以直接進(jìn)行質(zhì)譜鑒定的問題,基于磁性功能材料和效應(yīng)元件設(shè)計(jì)了可以高效富集肺癌組織的轉(zhuǎn)錄因子富集技術(shù)(TFRE)。他們利用轉(zhuǎn)錄因子能與序列特異性DNA元件結(jié)合的特點(diǎn),合成了含有大多數(shù)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的DNA序列,并將此序列鍵合在載體上,然后在體外擴(kuò)增生物素標(biāo)記的PCR引物,從而得到生物素標(biāo)記的DNA序列。再以生物素和親和素之間的獨(dú)特結(jié)合特性為基礎(chǔ),將“DNA誘餌”偶聯(lián)到鏈霉親和素標(biāo)記的磁珠上,然后再與預(yù)先制備好的組織核蛋白一起孵育,得到DNA-蛋白復(fù)合物,再經(jīng)電泳和膠內(nèi)酶解之后進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明TFRE技術(shù)可以高效地對(duì)肺癌組織中的轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行富集。謝輝等[14-16]還開發(fā)了一種高靈敏度、高選擇性、高通量等優(yōu)點(diǎn)的TOT(TFRE on Tip)技術(shù),可用于富集鑒定內(nèi)源性TFs。這種技術(shù)是將級(jí)聯(lián)串聯(lián)轉(zhuǎn)錄因子效應(yīng)元件(catTFRE)作為親核試劑富集轉(zhuǎn)錄因子,規(guī)模化定量內(nèi)源性TFs,解決了catTFRE單獨(dú)應(yīng)用存在的問題,能更高效、更精確、高通量地反映信號(hào)變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,TOT技術(shù)可從微量樣本中篩選TFs,達(dá)到高效富集內(nèi)源性TFs的目的,在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等功能研究中起到關(guān)鍵作用。這些應(yīng)用實(shí)例表明功能材料在生物學(xué)研究中可發(fā)揮獨(dú)特作用。

3 功能化材料在翻譯后修飾蛋白質(zhì)組研究中的應(yīng)用

蛋白質(zhì)翻譯后修飾(PTMs)是通過對(duì)蛋白質(zhì)側(cè)鏈和末端進(jìn)行化學(xué)修飾或者是被蛋白水解酶酶切來改變蛋白質(zhì)性質(zhì)的共價(jià)加工過程[17]。PTMs包括磷酸化、糖基化、乙?；⒓谆?、泛素化、類泛素化等多種修飾[18]。PTMs可以通過調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的活性、親疏水性、穩(wěn)定性和空間結(jié)構(gòu),從而影響蛋白質(zhì)的功能,最終改變細(xì)胞的表型特征和生物學(xué)功能,參與調(diào)節(jié)機(jī)體的許多生命活動(dòng),如基因表達(dá)、細(xì)胞分化與凋亡、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等,也與多種腫瘤的發(fā)展密切相關(guān)[19]。但大多數(shù)發(fā)生翻譯后修飾的蛋白質(zhì)通常具有豐度低、動(dòng)態(tài)范圍寬以及結(jié)構(gòu)復(fù)雜等特點(diǎn),因此對(duì)蛋白質(zhì)翻譯后修飾進(jìn)行規(guī)模化分析面臨著巨大的挑戰(zhàn)。對(duì)復(fù)雜生物樣品中翻譯后修飾蛋白質(zhì)和肽段進(jìn)行選擇性富集,是實(shí)現(xiàn)翻譯后修飾蛋白質(zhì)組學(xué)規(guī)?；治鲨b定的關(guān)鍵步驟。

蛋白質(zhì)磷酸化修飾是一種非常重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾,蛋白質(zhì)通過磷酸化修飾可以調(diào)控蛋白質(zhì)的生物活性、影響信號(hào)傳遞過程[20]。但由于磷酸化修飾蛋白質(zhì)豐度低、動(dòng)態(tài)范圍廣,且酶解后磷酸化肽段離子化效率低,使得直接對(duì)磷酸化修飾蛋白質(zhì)酶切樣品進(jìn)行質(zhì)譜分析變得十分困難,需要對(duì)樣品中的磷酸化肽段進(jìn)行選擇性的富集[21]。目前有許多方法應(yīng)用于磷酸化肽段富集,如固相萃取/固相微萃取、金屬氧化物親和色譜、固定金屬離子親和色譜、離子交換色譜、基于抗原-抗體相互作用的免疫親和富集方法等,但這些常用的方法存在磷酸肽富集特異性差、材料與溶液分離不完全、樣品損失、富集操作繁瑣、耗時(shí)長等不足,為了解決這些不足,研究者們不斷設(shè)計(jì)和制備新型富集材料,尋找具有更好富集特性的功能富集材料[22]。

金屬氧化物色譜法(MOAC)是磷酸肽富集的一種常用方法。近年來,多種金屬氧化物(如TiO2、ZrO2、Al2O3等)被用于磷酸肽的選擇性富集。二氧化鈦是目前較為成熟的金屬氧化物富集材料。錢小紅課題組[21]構(gòu)建了TiO2串聯(lián)反相填料的離心式富集裝置,結(jié)合抗體免疫沉淀,將磷酸肽的富集和分離有機(jī)結(jié)合。通過用自制的TiO2和反相填料裝填小柱將磷酸肽從復(fù)雜樣品中分離出來,并將富集產(chǎn)物分離成不同餾分,降低了體系的復(fù)雜程度,再通過抗體特異性地富集酪氨酸磷酸肽,提高了富集的選擇性,減少了樣品的損失和人力物力的損耗。

研究人員還發(fā)現(xiàn)基于多金屬氧酸鹽(POM)的磁性材料在蛋白質(zhì)吸附方面具有較大的應(yīng)用潛力。POM是過渡金屬離子的高氧化態(tài)(如釩(V)、鉬(Mo)、鎢(W)等)與氧形成的納米級(jí)金屬-氧簇類化合物?；赑OM具有豐富的化學(xué)位點(diǎn)和顯著的金屬氧化物表面特征,賈瓊等[23]制備了多金屬氧酸鹽/殼聚糖磁性復(fù)合材料,再結(jié)合基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)檢測手段,用于對(duì)磷酸肽的檢測分析。實(shí)驗(yàn)通過對(duì)β-酪蛋白酶解液中磷酸化肽的富集性能考察表明,這種磁性復(fù)合材料可以有效地對(duì)磷酸化肽進(jìn)行富集,避免非磷酸化肽段的影響。馮鈺锜等[24]也對(duì)金屬氧化物材料進(jìn)行研究改進(jìn),采用液相沉積法制備了納米氧化鋯沉積棉花纖維(ZrO2-CF)材料,對(duì)材料表征,并將其應(yīng)用于磷酸化多肽的選擇性富集。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,脫脂牛奶酶解物經(jīng)過ZrO2-CF富集后,非磷酸化多肽被有效去除,有9個(gè)磷酸化多肽被檢測到,較直接用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間(MALDI-TOF/TOF)質(zhì)譜分析(檢測到6個(gè)磷酸化多肽),質(zhì)譜信號(hào)更強(qiáng),靈敏性更高。

固定金屬親和色譜(IMAC)是目前廣泛應(yīng)用的一種磷酸肽富集方法,其原理是帶正電的金屬離子與帶負(fù)電的磷酸基團(tuán)發(fā)生相互作用而結(jié)合[25]。制備IMAC的核心是螯合金屬離子的基質(zhì)材料制備,根據(jù)基質(zhì)材料性質(zhì)不同可分為納米材料、微球色譜基質(zhì)、棉纖維、分子印跡材料、整體材料、共價(jià)有機(jī)骨架材料等[26]。馮鈺锜等[27]選擇表面有大量羥基的棉花作為材料進(jìn)行功能化修飾,在棉花的纖維表面修飾聚多巴胺(PDA),然后利用兒茶酚羥基固定Ti4+,設(shè)計(jì)合成了一種固定金屬親和色譜(IMAC)材料Cotton@PDA-Ti4+。該材料具有良好的生物相容性,機(jī)械性能穩(wěn)定,化學(xué)性能穩(wěn)定,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,Cotton@PDA-Ti4+可以有效地將磷酸化多肽從非磷酸化多肽的體系中分離出來,有較高的富集效率。Dai等[28]還將DOTA(1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷四乙酸)作為螯合配體涂覆在TiO2納米材料表面,螯合鋯離子Zr4+,形成了新的IMAC材料TiO2@DOTA-Zr。該材料具有較大的比表面積和較強(qiáng)的親和力位點(diǎn),同時(shí)DOTA與Zr4+之間極強(qiáng)的結(jié)合相互作用力增加了固定Zr4+的數(shù)目,有效減少了金屬離子的損失,增強(qiáng)了對(duì)磷酸肽的富集選擇性,成功應(yīng)用于富集脫脂牛奶和人血清樣品的胰蛋白酶消化物中的磷酸肽。李嫣等[29]通過溶劑熱反應(yīng)合成Fe3O4微球,再在表面上進(jìn)行多巴胺的自聚合反應(yīng),通過利用PDA的羥基和氨基結(jié)合各種金屬離子(Ti4+、Nb5+、Zr4+、Ce4+、Ga3+、Y3+、In3+和Fe3+),成功合成了涂覆有各種金屬離子的Fe3O4@PDA微球。對(duì)磁性微球進(jìn)行表征后,基于磷酸肽與金屬離子的結(jié)合親和力,對(duì)磷酸肽進(jìn)行富集,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,不同的金屬離子在選擇性、靈敏度和真實(shí)復(fù)雜樣品的富集能力方面表現(xiàn)不同,而Fe3O4@PDA-Nb5+和Fe3O4@PDA-Ti4+相較于其他離子具有更好的磷酸肽富集能力。王和平等[30]通過將鈦離子直接固定在富含TpPa-2COF的富氮骨架中,制備了鈦離子修飾的共價(jià)有機(jī)骨架材料TpPa-2-Ti4+,用于磷酸肽的特異性富集。該材料對(duì)于β-酪蛋白磷酸化多肽的檢測限低至4 fmol,提高了選擇性(β-casein∶bovine serum albumin (BSA)=1∶100, m/m),同時(shí)實(shí)現(xiàn)了對(duì)磷酸肽的高靈敏度、高選擇性的富集。

蛋白質(zhì)糖基化修飾也是一種重要的翻譯后修飾,它以各種方式廣泛參與基本生物學(xué)過程,包括基因轉(zhuǎn)錄、基因表達(dá)、蛋白質(zhì)翻譯調(diào)控、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白質(zhì)降解、受體激活等[31]。由于糖肽豐度低、糖鏈結(jié)構(gòu)復(fù)雜、糖基化位點(diǎn)的微觀不均一性、糖肽的離子化效率差以及肽段的質(zhì)譜信號(hào)受到非糖肽的信號(hào)抑制,導(dǎo)致直接用質(zhì)譜分析糖基化蛋白面臨許多挑戰(zhàn)[32]。因此質(zhì)譜分析糖基化蛋白或糖肽前對(duì)復(fù)雜生物樣品中的糖蛋白或糖肽進(jìn)行選擇性分離富集是成功鑒定糖蛋白或糖肽的關(guān)鍵。近年來,許多方法被應(yīng)用于在復(fù)雜生物體系中選擇性的分離和富集糖蛋白或糖肽,主要有凝集素親和色譜法、肼化學(xué)法、硼酸化學(xué)法和親水相互作用色譜法等[33,34]。許多材料也被應(yīng)用于糖蛋白或糖肽的富集和分離,主要有磁性微球[35]、磁性納米顆粒[36,37]、氧化石墨烯[38]、介孔材料[39]、金屬有機(jī)骨架材料(MOFs)、共價(jià)有機(jī)骨架材料(COFs)[40]等。

氧化石墨烯功能材料便是一例。氧化石墨烯是在石墨烯的基面和邊緣連接上大量含氧基團(tuán)形成的,是一種性能優(yōu)良的新型二維碳納米材料,具有較好的導(dǎo)電導(dǎo)熱性能、有較大的比表面積和表面豐富的含氧官能團(tuán),在糖肽富集中有較好的應(yīng)用[41]。為了解決應(yīng)用于凝集素富集的功能化材料存在負(fù)載量偏低以及富集效率有限等問題,錢小紅等[42]將麥胚凝集素(WGA)和伴刀豆凝集素A(Con-A)的自由氨基與GO(氧化石墨烯)表面的羧基通過偶聯(lián)反應(yīng)鍵合在GO表面,成功合成了高負(fù)載量的氧化石墨烯固定化凝集素GO-WGA和GO-ConA(固載量>1.90 mg/mg)。這兩種固定化凝集素可以針對(duì)不同糖型的糖蛋白進(jìn)行富集,而且材料制備容易,富集操作簡單,負(fù)載量高。蔣波等[43]通過在聚乙烯亞胺修飾的氧化石墨烯表面負(fù)載金納米顆粒,然后通過形成Au-S鍵在表面固定4-巰基苯硼酸,合成了4-巰基苯硼酸功能化氧化石墨烯復(fù)合物(GO/PEI/Au/4-MPB復(fù)合材料),并將其用于糖肽的選擇性富集和分離。研究結(jié)果表明,該復(fù)合材料在N-糖肽的捕獲中顯示出高的選擇性和靈敏度,而且該材料具有較強(qiáng)的親水性,與胰蛋白酶BSA特異性結(jié)合,在復(fù)雜生物樣本中有較好的應(yīng)用前景。該實(shí)驗(yàn)室還使用聚乙烯亞胺作為還原劑和固定試劑,在磁性氧化石墨烯上鍵合金納米顆粒合成了親水性GO/Fe3O4/Au/PEG納米復(fù)合材料,然后通過硫醇末端聚乙二醇固定化實(shí)現(xiàn)對(duì)糖肽的高選擇性富集。該材料具有二維結(jié)構(gòu)和優(yōu)異的親水性,可以從人血清中鑒定出255種糖肽,證明了該材料在糖基化分析中的應(yīng)用潛力[44]。

另外,磁性微球是一種新型的磁性功能材料,是通過適當(dāng)方法將磁性無機(jī)粒子與有機(jī)高分子結(jié)合形成的具有一定磁性及特殊結(jié)構(gòu)的復(fù)合微球。磁性微球具有可控的磁學(xué)性能、超順磁性、具有生物相容性、表面易被官能團(tuán)修飾、材料簡單易獲得等優(yōu)點(diǎn),能實(shí)現(xiàn)樣本溶液與材料的快速分離,被廣泛應(yīng)用于糖肽的富集[45]。鄧春暉等[46]將葡萄糖-6-磷酸作為官能化基團(tuán)連接到Fe3O4磁性微球表面上,成功制備了親水性Fe3O4@G6P微球,并將其作為新型親水性探針,成功地選擇性富集了復(fù)雜生物樣品(人血清和人唾液)中的N-糖肽,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,該材料對(duì)于糖肽具有優(yōu)異的富集性能,靈敏度高(0.5 fmol/μL),選擇性高(horseradish peroxidase (HRP)∶BSA=1∶100, m/m),重復(fù)性好(至少10倍),在基于MS策略的糖肽富集中有很好的應(yīng)用前景。王富強(qiáng)等[47]通過將硼酸分子共價(jià)結(jié)合到硅烷化的Fe3O4@mTiO2微球表面上,制備得到了硼酸修飾的磁性Fe3O4@mTiO2微球,該材料B-Fe3O4@mTiO2同時(shí)具有超順磁性和介孔。而且為了提高材料的富集效率和使用效率,研究人員開發(fā)了一種將B-Fe3O4@mTiO2與聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)納米珠一起使用的協(xié)同方法,用于高度特異性和有效地富集N-糖肽/糖蛋白。富集糖肽結(jié)果表明,與單獨(dú)應(yīng)用B-Fe3O4@mTiO2相比,協(xié)同方法可以檢測到更多數(shù)量的糖肽,信噪比顯著增加,靈敏度大大提高,而且測定糖肽的回收率高達(dá)92.1%。

金屬有機(jī)骨架(metal organic frameworks, MOFs)材料,也稱多孔配位聚合物,是一類以金屬離子為中心、有機(jī)物為配體的新型多孔骨架材料,由于具有多孔性、較大的比表面積、可設(shè)計(jì)的結(jié)構(gòu)、可調(diào)的孔徑等優(yōu)點(diǎn),使得MOFs在糖肽的富集應(yīng)用中有獨(dú)特的優(yōu)勢[48]?；诖?張祥民等[49]利用外延生長策略成功制備了Fe3O4@Mg-MOF-74核-殼納米粒子,該材料具有一維通道結(jié)構(gòu)、合適的孔徑、親水性和生物相容性等優(yōu)點(diǎn)。使用該納米粒子進(jìn)行富集后,在1 μL消化的人血清中,對(duì)應(yīng)于125種糖蛋白和18種糖肽的441個(gè)N-糖基化位點(diǎn)可以被成功檢測到,證明材料具有高的富集效率和選擇性。白玉等[50]通過簡單常規(guī)的兩步方法合成了半胱氨酸功能化的金屬有機(jī)骨架,先將Au納米顆粒原位加載到氨基衍生的MOF上,然后再進(jìn)行L-半胱氨酸固定。由于該納米復(fù)合材料具有較大的比表面積和超高親水性,在模型糖蛋白和Hela細(xì)胞裂解物中富集N-糖肽時(shí)表現(xiàn)優(yōu)異。而且通過使用這種復(fù)合材料,從細(xì)胞裂解物中可以鑒定出對(duì)應(yīng)于1 069個(gè)N-糖肽和614個(gè)N-糖蛋白的1 123個(gè)N-糖基化位點(diǎn)。結(jié)果證明,半胱氨酸功能化的金屬有機(jī)骨架材料結(jié)合能力大(150 mg/g, IgG消化至材料)、選擇性良好(IgG和BSA消化的摩爾比為1∶50)、回收率高(超過80%)和檢測限低(1 fmol),在糖肽富集中有很好的應(yīng)用前景。

共價(jià)有機(jī)骨架材料(covalent organic frameworks, COFs)是由有機(jī)結(jié)構(gòu)單元通過共價(jià)鍵形成微孔/介孔結(jié)構(gòu)的一類新型高分子材料,由于具有大的比表面積、極低的骨架密度、可調(diào)的孔結(jié)構(gòu)、良好的酸堿穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性等顯著優(yōu)點(diǎn),被廣泛應(yīng)用于糖肽富集中[51]。錢小紅等[52]通過溶劑熱反應(yīng),在磁性納米粒子表面上原位生長TpPa-1共價(jià)有機(jī)骨架,構(gòu)建具有超順磁性的海膽型復(fù)合材料Fe3O4@TpPa-1,將該材料用于親水富集時(shí),可以分別從IgG和HRP消化物中檢測到37種和22種糖肽,可以從人血清消化物中檢測到對(duì)應(yīng)于114種糖蛋白的228種糖肽,證明了這種新材料的富集效率高,檢測限低(28 fmol),在糖蛋白組學(xué)研究中有很好的應(yīng)用。馬玉芳等[53]利用1,3,5-三甲基間苯三酚和對(duì)苯二胺的席夫堿反應(yīng)合成TpPa-1共價(jià)有機(jī)骨架材料,并將其成功地用作N-糖肽富集的親水性多孔材料。這種材料對(duì)糖肽有很好的特異性和選擇性,可以有效消除非糖肽的干擾,有利于進(jìn)行糖肽的質(zhì)譜檢測。而且由于材料中具有強(qiáng)的共價(jià)鍵,該材料具有良好的穩(wěn)定性,可以重復(fù)使用至少10次,在N-糖肽富集中有良好的應(yīng)用前景。這些功能材料的成功應(yīng)用進(jìn)一步表明其在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的應(yīng)用潛力。

4 功能材料在蛋白質(zhì)組定量研究中的應(yīng)用

18O標(biāo)記是目前廣泛應(yīng)用的一種蛋白質(zhì)定量標(biāo)記方法,18O標(biāo)記方法具有操作簡單、無副產(chǎn)物、條件溫和等優(yōu)勢,但是也存在標(biāo)記不完全、效率低、18O和16O發(fā)生反向交換、標(biāo)記易丟失等問題[54]。為了解決這些問題,研究人員開始研究能在定量中輔助18O標(biāo)記設(shè)計(jì)的功能材料。錢小紅等[55]將毛發(fā)狀非交聯(lián)聚合物鏈雜化磁性納米粒子作為基質(zhì),利用原子轉(zhuǎn)移自由基聚合技術(shù),開發(fā)了一種新型的固定化胰蛋白酶,用于實(shí)現(xiàn)簡單快速的18O標(biāo)記和蛋白質(zhì)組定量。在他們的標(biāo)記策略中,游離胰蛋白酶被PHMN-胰蛋白酶替代,其在標(biāo)記僅1 min后就可以通過磁體方便地與標(biāo)記的肽分離,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,兩種標(biāo)準(zhǔn)參考肽ENO-1和ENO-2具有兩個(gè)18O原子的完全標(biāo)記,在3次試驗(yàn)中的平均標(biāo)記效率分別為96.7%和96.5%,并且未發(fā)生18O和16O的反向交換,該固定化胰蛋白酶成功實(shí)現(xiàn)了簡單快速的18O標(biāo)記。這表明功能材料也可在定量蛋白質(zhì)組研究中發(fā)揮作用。

5 結(jié)束語

對(duì)于功能材料在蛋白質(zhì)組學(xué)中的應(yīng)用的研究從未停止,由早期的單一材料發(fā)展到復(fù)合材料,從直接使用自然界中的已有材料到對(duì)已有材料進(jìn)行改性和使用新型材料來有效提高蛋白質(zhì)組的分析效率,改善分析方法選擇性、靈敏度和易操作性。盡管如此,為了功能材料能在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中發(fā)揮更好的作用,對(duì)功能材料的選擇應(yīng)用,還需要綜合考慮多方面因素,包括功能材料的來源難易程度、理化性質(zhì)、工藝成本和可修飾特點(diǎn)等。另外,隨著材料學(xué)和生物工程技術(shù)的發(fā)展,更多性能優(yōu)良的功能材料將不斷被應(yīng)用到蛋白質(zhì)組學(xué)研究中,這不僅擴(kuò)展了功能材料的應(yīng)用范圍,也必將滿足蛋白質(zhì)組學(xué)不斷提出的新挑戰(zhàn)、新問題,促進(jìn)蛋白質(zhì)組學(xué)研究邁向更高層次。