,2,*

(1.徐州工程學(xué)院食品(生物)工程學(xué)院,江蘇徐州 221018; 2.江蘇省食品資源開發(fā)與質(zhì)量安全重點(diǎn)建設(shè)實(shí)驗(yàn)室,江蘇徐州 221018)

蟬花(Cordycepscicadae)是麥角菌科真菌大蟬草的分生孢子階段,即蟬棒束孢菌及其寄主山蟬幼蟲的干燥體,為我國傳統(tǒng)的中藥材?，F(xiàn)代藥理研究表明,蟬花具有調(diào)節(jié)免疫[1]、抗腫瘤[2]、腎保護(hù)[3-4]、神經(jīng)保護(hù)[5-6]、抗菌[7]、肝保護(hù)[8]、降血糖[9]等功能。

多糖為蟬花的主要活性成分之一。人工蟬花孢梗束粗多糖能明顯延長雌雄果蠅的壽命,顯著提高雌雄果蠅的SOD活性,降低雄性果蠅體內(nèi)MDA含量[10-11]。謝飛等[12]研究表明野生蟬花多糖對(duì)體外培養(yǎng)的Hela細(xì)胞具有抑制作用,并能有效抑制S180荷瘤小鼠腫瘤的生長。宋佳敏等[13]發(fā)現(xiàn)金蟬花多糖具有較好的體外清除自由基能力。上述報(bào)道大多是利用蟬花粗多糖開展相關(guān)生物活性研究,而對(duì)純化后的蟬花多糖進(jìn)行活性評(píng)價(jià)的報(bào)道甚少。

環(huán)磷酰胺為廣譜烷化劑類抗腫瘤藥物,對(duì)白血病和實(shí)體瘤均有療效,也是目前應(yīng)用最多的免疫抑制劑之一。環(huán)磷酰胺在肝臟中經(jīng)細(xì)胞色素P450酶系水解為磷酰胺氮芥和丙烯醛,前者發(fā)揮其藥理作用,后者毒副作用較大,可引起骨髓抑制以及生殖系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、肝臟等損傷[14]。環(huán)磷酰胺可引起肝細(xì)胞壞死,肝小葉中心充血,并伴隨氨基轉(zhuǎn)移酶升高[15-16]。環(huán)磷酰胺致肝損傷模型已被廣泛應(yīng)于評(píng)價(jià)受試物的肝保護(hù)作用[17-19]。但有關(guān)蟬花孢梗束多糖對(duì)環(huán)磷酰胺致肝損傷小鼠的保護(hù)作用的研究未見報(bào)道。

本研究采用DE-52離子交換纖維素及葡聚糖G-100凝膠柱層析純化蟬花孢梗束多糖。以清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)自由基能力、還原力、清除羥基自由基能力和螯合鐵離子能力為指標(biāo),評(píng)價(jià)了蟬花孢梗束多糖純化組分的抗氧化活性。采用環(huán)磷酰胺致肝損傷小鼠模型評(píng)價(jià)了蟬花孢梗束多糖純化組分的保肝作用,旨在為蟬花孢梗束多糖的開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蟬花 徐州工程學(xué)院食品(生物)工程學(xué)院人工栽培;DE-52離子交換纖維素、葡聚糖G-100 General Electric公司;丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Alanine aminotransferase,ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Aspartate aminotransferase,AST)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、過氧化氫酶(Catalase,CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase,GSH-Px)、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)測試盒 南京建成生物工程研究所;昆明小鼠 許可證號(hào):SCXK魯20140007,(20±2) g,濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司;水飛薊賓 天津天士力圣特制藥有限公司;其他試劑 均為國產(chǎn)分析純。

723C型可見分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司;LGJ-18A 冷凍干燥機(jī) 北京四環(huán)科學(xué)儀器廠;HL-2恒流泵 上海嘉鵬科技有限公司;TGL-16臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 長沙湘儀有限公司;Synergy2多功能酶標(biāo)儀 BioTek公司;2.6 cm×30 cm、2.6 cm×60 cm層析柱 上海廈美生化科技發(fā)展有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蟬花孢梗束粗多糖的制備 采用Zheng等[20]報(bào)道的方法。蟬花子實(shí)體清洗后切成薄片,置于50 ℃烘箱中烘干至恒重。粉碎后過60目篩,取100 g樣品粉末,加20倍體積蒸餾水,90 ℃提取2 h,過濾,濃縮至原體積的1/20,4 ℃醇沉(乙醇終濃度80%)12 h脫脂。3000 r/min離心10 min,收集沉淀,環(huán)己烷、無水乙醇各洗滌2次,揮干乙醇,得粗多糖。Sevag試劑(氯仿∶正丁醇=4∶1)脫蛋白,重復(fù)5次。透析48 h(截留相對(duì)分子質(zhì)量:8000～14000 Da),濃縮后冷凍干燥。

1.2.2 蟬花孢梗束粗多糖的純化 粗多糖的純化采用Zheng等[20]的方法。稱取200 mg粗多糖加入5 mL去離子水,緩慢上樣至已平衡的DE-52離子交換纖維素層析柱(2.6 cm×30 cm)。采用去離子水、0.1、0.3和0.5 mol/L NaCl溶液梯度洗脫,流速3.0 mL/min,分級(jí)收集,每種洗脫液各收集20管,10 mL/管。苯酚硫酸法[21]測收集管吸光度,收集不同洗脫梯度相應(yīng)的組分,得初步純化產(chǎn)品。

稱取50 mg初步純化樣品加入2 mL去離子水,再用葡聚糖G-100凝膠色譜柱(2.6 cm×60 cm)進(jìn)一步純化,去離子水洗脫,流速0.5 mL/min,分部收集,10 mL/管,硫酸苯酚法檢測各管吸光度,分別收集不同的組分,濃縮后-50 ℃冷凍干燥,得純化產(chǎn)品。

1.2.3 抗氧化活性檢測

1.2.3.1 DPPH自由基清除能力測定 DPPH自由基清除率測定采取Wu等[22]的方法。分別取不同質(zhì)量濃度(0.1～4 g/L)的蟬花孢梗束多糖溶液1.5 mL,加入1.5 mL DPPH溶液(0.2 mmol/L,溶于95%乙醇),混勻,在室溫下避光靜置0.5 h,測定517 nm處吸光度。抗壞血酸(0.05～4 g/L)做陽性對(duì)照。

清除率(%)=[1-(Am-An)/A0]×100

式(1)

式中:A0為對(duì)照組吸光度,1.5 mL蒸餾水加1.5 mL含0.2 mmol/L DPPH的95%乙醇;Am為樣品組吸光度,1.5 mL樣品液加1.5 mL含0.2 mmol/L DPPH的95%乙醇;An為空白組吸光度,1.5 mL樣品液加1.5 mL 95%乙醇。

1.2.3.2 還原力測定 采用Oyaizu[23]報(bào)道的鐵氰化鉀法。分別取不同質(zhì)量濃度(0.05～4 g/L)樣液2 mL,加入2 mL磷酸緩沖液(0.2 mol/L,pH6.6),1%鐵氰化鉀溶液2 mL,混勻,50 ℃水浴20 min,再加入10%三氯乙酸溶液2 mL,搖勻,3000 r/min離心10 min。離心后取2 mL上清液,依次加入去離子水2 mL,0.1%三氯化鐵0.4 mL,混勻,50 ℃水浴10 min,測定700 nm處吸光度?？瞻捉M采用去離子水取代樣品,抗壞血酸(0.01～1 g/L)做陽性對(duì)照。

1.2.3.3 羥基自由基清除能力測定 采用鄰二氮菲比色法[24],樣液質(zhì)量濃度為0.1～6 g/L,抗壞血酸(0.1～6 g/L)做陽性對(duì)照,測定536 nm處吸光度。

損傷管:取0.5 mL鄰二氮菲無水乙醇溶液(0.75 mmol/L),加入1 mL磷酸鹽緩沖液(0.15 mmol/L,pH7.4)和0.5 mL去離子水,混勻后加入0.5 mL 0.75 mmol/L FeSO4,0.5 mL 0.01% H2O2,37 ℃水浴1 h,測吸光度記為A損。

未損傷管:以0.5 mL去離子水代替0.01% H2O2,測吸光度記為A未損。

樣品管:在0.5 mL鄰二氮菲無水乙醇溶液(0.75 mmol/L)中加入1 mL磷酸鹽緩沖液(0.15 mmol/L,pH7.4)和0.5 mL樣液混勻,再加0.5 mL硫酸亞鐵(0.75 mmol/L),混勻后加0.5 mL 0.01% H2O2,37 ℃水浴1 h,測吸光度記為A樣。

圖1 蟬花孢梗束粗多糖在DE-52纖維素層析柱與葡聚糖 G-100層析柱上的洗脫曲線Fig.1 Elution curve of crude polysaccharides from synnemata of Cordyceps cicadae by DE-52 cellulose chromatography and Sephadex G-100 column

樣品參比:1 mL磷酸鹽緩沖液(0.15 mol/L,pH7.4)與0.5 mL樣液混合,再加1.5 mL去離子水,測吸光度,記為A參。

空白參比:1 mL磷酸鹽緩沖液(0.15 mmol/L,pH7.4)與2 mL去離子水混合,作為空白調(diào)零,記為A空。

清除率(%)=[(A樣-A參)-(A損-A空)]/(A未損-A損)×100

式(2)

式中:A樣、A參、A損、A空和A未損分別為樣品組、樣品參比、損傷組、空白對(duì)照組和未損傷組吸光度。

1.2.3.4 鐵離子螯合能力鐵離子鰲合能力測定 采用Decker等[25]的方法,并稍加修改。在1 mL不同質(zhì)量濃度(0.01～10 g/L)的樣液中分別加入3.7 mL 55%乙醇,0.1 mL氯化亞鐵(2 mmol/L)和0.2 mL菲啰嗪(5 mmol/L),混勻,靜置 20 min,測定562 nm處吸光度?？瞻讓?duì)照組使用55%乙醇。陽性對(duì)照組為EDTA(0.01～10 g/L)。鐵離子螯合率計(jì)算公式如下:

鐵離子螯合率(%)=[(Ai-Aj)/Ai]×100

式(3)

式中:Ai和Aj分別為空白組、樣品(或陽性對(duì)照)的吸光度。

1.2.4 小鼠分組與處理 小鼠飼養(yǎng)溫度20～23 ℃;相對(duì)濕度為44%～54%。經(jīng)一周預(yù)飼養(yǎng)后,隨機(jī)分為正常組、模型組、陽性組和蟬花孢梗束多糖低、中、高劑量組。每組10只,雌雄各半。除正常組外,其余組腹腔注射80 mg/kg環(huán)磷酰胺,連續(xù)3 d。造模后,陽性組灌胃150 mg/kg水飛薊賓,蟬花孢梗束多糖低、中、高劑量組分別灌胃25、50和100 mg/kg的蟬花孢梗束多糖BGS-2,每天一次,連續(xù)14 d。空白組、模型組每日灌胃等量生理鹽水。

1.2.5 生化指標(biāo)檢測 末次灌胃24 h后,小鼠眼眶采血,3000 r/min離心10 min,收集血清,按照試劑盒說明書測定血清中ALT和AST酶活。頸椎脫臼處死小鼠,取肝臟,加生理鹽水,制成10%肝組織勻漿,按照試劑盒說明書測定肝組織中SOD、CAT、GSH-Px活性和MDA含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行分析,結(jié)果使用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,顯著性分析采用Dunnett-t檢驗(yàn)法。

2 結(jié)果與分析

2.1 蟬花孢梗束多糖的分離純化結(jié)果

蟬花孢梗束粗多糖在DE-52纖維素柱上的洗脫曲線如圖1所示。其中0.5 mol/L NaCl洗脫液沒有洗脫得到多糖組分。F1、F2和F3分別為去離子水、0.1和0.3 mol/L NaCl溶液的洗脫組分。上述洗脫組分再用葡聚糖G-100凝膠色譜柱進(jìn)一步純化,所得三個(gè)純化組分分別命名為BGS-1、BGS-2和BGS-3,根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.0101x+0.0039(R2=0.9975),計(jì)算得到多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為96.34%、98.65%和90.43%。

2.2 蟬花孢梗束多糖體外抗氧化活性分析

2.2.1 清除DPPH自由基能力的測定結(jié)果 DPPH自由基清除試驗(yàn)是一種常用的評(píng)價(jià)抗氧化能力方法[26]。由圖2可知,在測定的質(zhì)量濃度范圍(0.1～1 g/L)之內(nèi),各組分的DPPH自由基清除率與質(zhì)量濃度成正相關(guān)。在質(zhì)量濃度為2 g/L時(shí),BGS-1、BGS-2和BGS-3對(duì)DPPH自由基的清除率分別為87.86%、90.25%、78.13%,BGS-2的清除率為最高。半數(shù)有效濃度(half maximal effective concentration,EC50)可作為評(píng)價(jià)抗氧化能力的重要參數(shù),如某種物質(zhì)的EC50值低于10 g/L,則表明其具有很好的抗氧化活性。BGS-1、BGS-2和BGS-3清除DPPH自由基的EC50值分別為0.53、0.45、0.64 g/L。由此可以看出,蟬花孢梗束多糖三個(gè)純化組分均具有較強(qiáng)的清除DPPH自由基能力,強(qiáng)弱順序?yàn)锽GS-2>BGS-1>BGS-3?？箟难崆宄鼶PPH自由基的EC50值為0.12 g/L,表明蟬花孢梗束多糖清除DPPH自由基能力低于抗壞血酸。

圖2 蟬花孢梗束多糖對(duì)DPPH自由基的清除能力Fig.2 DPPH free radicals scavenging ability of polysaccharides from synnemata of Cordyceps cicadae

2.2.2 還原力的測定結(jié)果 抗氧化物質(zhì)的抗氧化活性與其自身的還原力有直接的關(guān)系[27]。由圖3可知,隨著樣品質(zhì)量濃度的增加,蟬花孢梗束多糖各組分的還原力也相應(yīng)增大。在質(zhì)量濃度為0.1 g/L時(shí),BGS-1、BGS-2和BGS-3的吸光度分別為0.193、0.247和0.125,抗壞血酸的吸光度為0.532。在質(zhì)量濃度為4 g/L時(shí),三個(gè)組分的吸光度分別為1.045、1.147和0.945。由圖3可知,蟬花孢梗束多糖表現(xiàn)出較強(qiáng)的還原力,三個(gè)多糖組分還原力的強(qiáng)弱順序?yàn)锽GS-2>BGS-1>BGS-3。

圖3 蟬花孢梗束多糖的還原力Fig.3 Reducing power of polysaccharides from synnemata of Cordyceps cicadae

2.2.3 清除羥基自由基能力的測定結(jié)果 由圖4可知,在0.1～6 g/L的質(zhì)量濃度測定范圍之內(nèi),蟬花孢梗束多糖的羥基自由基清除率隨著質(zhì)量濃度的升高而增大,蟬花孢梗束多糖的清除能力略高于抗壞血酸。在質(zhì)量濃度為0.1 g/L時(shí),BGS-1、BGS-2和BGS-3的清除率分別是19.34%、25.67%和15.12%。在質(zhì)量濃度達(dá)到6 g/L時(shí),蟬花孢梗束多糖與抗壞血酸的羥基自由基清除率趨于平緩,其中BGS-1、BGS-2和BGS-3的清除率分別為89.03%、89.67%、85.17%,抗壞血酸的清除率為73.56%。BGS-1、BGS-2和BGS-3清除羥基自由基的EC50值分別為0.97、0.73和1.29 g/L,抗壞血酸的EC50值為1.62 g/L,可以看出,蟬花孢梗束多糖較抗壞血酸表現(xiàn)出更高的羥基自由基清除能力,BGS-2清除羥基自由基能力最強(qiáng)。

圖4 蟬花孢梗束多糖對(duì)羥基自由基的清除能力Fig.4 Hydroxyl free radicals scavenging ability of polysaccharides from synnemata of Cordyceps cicadae

2.2.4 鐵離子螯合能力的測定結(jié)果 鐵離子在生物體內(nèi)能通過Fenton反應(yīng)發(fā)生脂質(zhì)過氧化,并導(dǎo)致羥基自由基的產(chǎn)生,因此鐵離子鰲合能力也是評(píng)價(jià)抗氧化活性的常用指標(biāo)[28]。由圖5可以發(fā)現(xiàn),隨著樣品質(zhì)量濃度的增加,各組分的鐵離子鰲合率也相應(yīng)增加,在質(zhì)量濃度為3 g/L時(shí),EDTA的鐵離子螯合率已達(dá)到98.27%,而BGS-1、BGS-2和BGS-3的螯合率為53.21%、69.77%和45.33%。BGS-1、BGS-2和BGS-3螯合鐵離子的EC50值分別為2.68、2.06和3.29 g/L,強(qiáng)弱順序?yàn)锽GS-2>BGS-1>BGS-3。各組分的EC50值均高于EDTA(0.14 g/L),但都低于10 g/L,表明各個(gè)組分具有較高的鐵離子螯合能力。

圖5 蟬花孢梗束多糖的鐵離子螯合能力Fig.5 Ferrous ions chelating ability of polysaccharides fractions from synnemata of Cordyceps cicadae

表1 蟬花孢梗束多糖BGS-2對(duì)環(huán)磷酰胺致肝損傷小鼠肝臟SOD、CAT、GSH-Px活性和MDA含量的影響Table 1 Effects of polysaccharide fraction(BGS-2)from synnemata of Cordyceps cicadae on liver SOD, CAT,GSH-Px activities and MDA levels in cyclophosphamide-induced mice

綜上所述,蟬花孢梗束多糖各組分均具有較好的清除DPPH自由基能力、還原力、清除羥基自由基能力和鐵離子螯合能力,其中BGS-2的抗氧化活性最強(qiáng),因此選擇BGS-2進(jìn)一步開展體內(nèi)生物活性研究。

2.3 BGS-2對(duì)環(huán)磷酰胺致肝損傷小鼠的保護(hù)作用

2.3.1 BGS-2對(duì)血清ALT和AST活性的影響 如圖6所示,模型組小鼠血清ALT和AST活性均極顯著高于正常組(P<0.01),表明環(huán)磷酰胺攝入造成了小鼠肝細(xì)胞的損傷。低、中、高劑量BGS-2小鼠血清ALT和AST活性均極顯著低于模型組(P<0.01)。BGS-2劑量越高,兩種轉(zhuǎn)氨酶活性下降的程度亦越高。陽性對(duì)照組小鼠血清ALT和AST活性亦極顯著低于模型組(P<0.01)。

環(huán)磷酰胺代謝過程中產(chǎn)生的活性氧及代謝產(chǎn)物可損害生物膜,導(dǎo)致血清ALT和AST活性升高[29]。低、中和高劑量BGS-2均能極顯著降低環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的小鼠血清ALT和AST活性,表明BGS-2對(duì)環(huán)磷酰胺致小鼠肝損傷具有較好保護(hù)作用。

圖6 蟬花孢梗束多糖BGS-2對(duì)環(huán)磷酰胺 致肝損傷小鼠血清ALT和AST含量的影響Fig.6 Effects of polysaccharide fraction(BGS-2)from synnemata of Cordyceps cicadae on serum ALT and AST levels in cyclophosphamide-induced mice注:結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示(n=10); **與模型組相比,差異極顯著(P<0.01); ##與正常組相比,差異極顯著(P<0.01);表1同。

2.3.2 BGS-2對(duì)肝組織中抗氧化酶和MDA含量的影響 如表1所示,模型組小鼠肝臟SOD、CAT和GSH-Px活性均極顯著低于正常組(P<0.01),脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA含量極顯著高于正常組(P<0.01),表明環(huán)磷酰胺的攝入造成了小鼠肝臟抗氧化防御系統(tǒng)的損傷,亦進(jìn)一步說明環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)肝損傷小鼠造模成功。BGS-2低劑量組小鼠肝臟中SOD、CAT和GSH-Px活性均極顯著高于模型組(P<0.01),MDA含量極顯著低于模型組(P<0.01)。BGS-2劑量越高,抗氧化酶上升與MDA下降的程度亦越高。150 mg/kg水飛薊賓(陽性對(duì)照組)亦能極顯著提高抗氧化酶活性(P<0.01),降低MDA含量(P<0.01)。

環(huán)磷酰胺的代謝產(chǎn)物丙烯醛可刺激機(jī)體產(chǎn)生大量的活性氧,過量的活性氧使SOD、CAT和GSH-Px等抗氧化酶耗竭或活性下降;此外,丙烯醛可攻擊細(xì)胞內(nèi)的生物大分子,引起脂質(zhì)氧化損傷,MDA含量可反映脂質(zhì)過氧化的程度[30-32]。BGS-2能極顯著提高環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的小鼠肝臟SOD、CAT和GSH-Px活性,降低MDA含量,表明蟬花孢梗束多糖可提高機(jī)體抗氧化能力,減少脂質(zhì)過氧化的發(fā)生。結(jié)合蟬花孢梗束多糖的體外抗氧化活性,可初步認(rèn)為BGS-2可能是通過提高體內(nèi)抗氧化酶活性、直接清除自由基和螯合金屬離子等途徑發(fā)揮其對(duì)環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)肝損傷的保護(hù)作用。

3 結(jié)論

蟬花孢梗束多糖組分BGS-1、BGS-2和BGS-3均表現(xiàn)出較好的體外抗氧化活性,且隨著質(zhì)量濃度的增加而增大。BGS-2的體外抗氧化能力最高,清除DPPH自由基、清除羥基自由基、螯合鐵離子的EC50值分別為0.45、0.73和2.06 g/L。BSG-2能極顯著降低環(huán)磷酰胺致肝損傷小鼠血清ALT和AST活性(P<0.01),極顯著提高小鼠肝臟SOD、CAT和GSH-Px活性,降低MDA含量(P<0.01),表明蟬花孢梗束多糖具有緩解環(huán)磷酰胺致小鼠肝損傷作用。BGS-2可能通過提高體內(nèi)抗氧化酶活性、直接清除自由基和螯合金屬離子等途徑發(fā)揮其對(duì)環(huán)磷酰胺致小鼠肝損傷的保護(hù)作用。有關(guān)蟬花孢梗束多糖BGS-2的抗氧化、肝保護(hù)作用機(jī)制及其構(gòu)效關(guān)系需進(jìn)一步研究。