(南京師范大學(xué)食品科學(xué)與工程系,江蘇南京 210097)

隨著生活水平的提高,人們對食品品質(zhì)和食品安全越來越重視。食品添加劑的安全性越來越受人們關(guān)注,因此占主導(dǎo)地位但有一定危害的化學(xué)防腐劑的使用量逐漸減少,而天然防腐劑成為近年來的熱點(diǎn),其中生物保鮮是常用的化學(xué)防腐劑的替代方法。生物防腐劑的有效發(fā)展可作為化學(xué)防腐劑的替代途徑,生物防腐劑通過微生物的新陳代謝產(chǎn)生抑菌物質(zhì)起到防腐保鮮的作用[1]。細(xì)菌素已被用于治療傳染病、預(yù)防胃腸道疾病、維持人體健康以及作為食品工業(yè)中的防腐劑[2]。目前乳酸菌細(xì)菌素研究的較多,但在商業(yè)中成熟應(yīng)用較少[3-4]。相比而言,學(xué)者對產(chǎn)生抑菌物質(zhì)的多粘類芽孢桿菌關(guān)注相對較少,因?yàn)槎嗾愁愌挎邨U菌屬細(xì)菌能夠產(chǎn)生多種不同化學(xué)結(jié)構(gòu)的抗菌多肽,所以對產(chǎn)細(xì)菌素的多粘類芽孢桿菌的研究顯得更有意義[5]。廣譜抑菌性多粘類芽孢桿菌具有廣泛的抑菌性,抑菌成分多為多糖、多肽、蛋白質(zhì)等。抑菌機(jī)理多為作用于目的菌的細(xì)胞壁、細(xì)胞膜等,從而達(dá)到抑菌的效果。

國內(nèi)外學(xué)者從不同的環(huán)境中分離篩選出產(chǎn)細(xì)菌素的芽孢桿菌。如Kavitha等[6]在水稻的根際土壤中篩選出一株優(yōu)良多粘類芽孢桿菌VLB16,對稻紋枯病菌的生長具有良好的抑制作用。Balaiah等[7]從發(fā)酵番茄果實(shí)中分離到一株芽孢桿菌NP75,對革蘭氏陽性細(xì)菌有顯著的抑菌活性。Yang等[8]篩選出一株多粘類芽孢桿菌Jsa-9,其產(chǎn)生的細(xì)菌素對食品中的優(yōu)勢腐敗菌有良好的抑制作用。Kim等[9]從韓國東大麥根際分離出一株多粘類芽孢桿菌E681,具有促進(jìn)植物生長和抑制植物病害的能力。目前國內(nèi)外研究的多粘類芽孢桿菌抑菌普較窄,且多應(yīng)用于生物防治,在食品防腐中應(yīng)用極少。為獲得新穎、抑菌活性更為穩(wěn)定的細(xì)菌素,本文擬從不同環(huán)境中的湖泥、土壤中分離篩選具有廣譜抑菌作用的多粘類芽孢桿菌菌株,進(jìn)而為生物保鮮新品種的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

湖泥和根系土壤 取自玄武湖、中山陵景區(qū)、南京清涼山、南京國防園、南京師范大學(xué)隨園校區(qū);金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、賴氨酸芽孢桿菌(Lysinibacillus)、大腸埃希氏桿菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis) 均由南京師范大學(xué)實(shí)驗(yàn)室保藏;LB肉湯、LB瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 BR,南京騰春生物試劑有限公司;胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K、氯化鈉、革蘭氏染色試劑盒、蔗糖 AR,南京騰春生物試劑有限公司;DNA抽提試劑盒、通用引物 上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

CJ-2S型超凈工作臺 天津市泰斯特儀器有限公司;生化培養(yǎng)箱LRH-250A 廣東省醫(yī)療器械廠;自動高壓滅菌鍋HVE-50 南京博惠科學(xué)儀器有限公司;ALLEGRA64R臺式高速冷凍離心機(jī) 美國Beckman Coulter 公司;電子分析天平AUY220 日本ShiMADzu;Phs-3C精密pH計(jì) 上海三信儀表廠;DK-8D電熱恒溫水槽 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;TH2-C恒溫?fù)u床 太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠;2720 thermal cycle PCR儀 上海巴玖實(shí)業(yè)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 芽孢桿菌的分離純化 取1 g分離樣品于9 mL無菌生理鹽水中,混勻后于80 ℃水浴30 min,殺死營養(yǎng)細(xì)胞,10-1～10-7梯度稀釋,取梯度稀釋液100 μL涂布于LB固體培養(yǎng)基,觀察細(xì)菌菌落的形態(tài)特征,對疑似菌落進(jìn)行革蘭氏染色[10],挑取產(chǎn)芽孢的革蘭氏陽性單菌落于LB固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)36 h后,保存于4 ℃冰箱備用。

將已分離的菌株置于LB肉湯液體培養(yǎng)基中180 r/min、37 ℃搖床培養(yǎng)24 h,發(fā)酵液經(jīng)過10000 r/min離心15 min,棄沉淀,0.22 μm的濾膜過濾上清去除菌體,獲得拮抗液。利用平板打孔法測定抑菌活性,取大腸桿菌培養(yǎng)液(1.0×108CFU·mL-1)均勻涂布于固體培養(yǎng)基表面,于每個孔中加入100 μL拮抗液,培養(yǎng)24 h,觀察抑菌作用,記錄抑菌圈直徑[11-12]。

1.2.2 H2O2作用的排除 H2O2作用的排除參照張艾青等[13]方法,利用H2O2受熱分解的特性,取菌株發(fā)酵產(chǎn)物于80 ℃水浴加熱10 min,參照1.2.1測定除去H2O2的上清液對大腸桿菌的抑菌直徑。

1.2.3 蛋白酶的處理 取排除H2O2作用的拮抗液,分別加入蛋白酶k、胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶,使酶的終濃度為2 mg/mL,在酶的最適pH下,37 ℃保溫2 h,再將pH調(diào)回至6.8±0.2,以不加酶液的拮抗液作為對照,參照1.2.1測定蛋白酶和非蛋白酶處理后上清液對大腸桿菌的抑菌直徑。

1.2.4 菌株鑒定 根據(jù)目標(biāo)菌的形態(tài)特征結(jié)合革蘭氏染色,并依照《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教程》[14]提供的途徑進(jìn)行生理生化實(shí)驗(yàn),參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》[15]做出初步鑒定。之后進(jìn)行16S rRNA序列同源性分析鑒定[16],把得到的測序結(jié)果利用NCBI的Gen Bank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST分析,按照序列同源性選擇不同模式菌株,利用MEGA6.06軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,從而確定菌株XW4的種屬。

1.2.5 溫度和pH對細(xì)菌素的影響

1.2.5.1 溫度對細(xì)菌素的影響 菌體培養(yǎng)物以2%的接種量接入50 mL LB培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)24 h,取上清液分別于60、80、100、120 ℃水浴中處理30 min,冷卻至室溫后,參照1.2.1測定上清液對指示菌大腸桿菌的抑菌直徑[17]。

1.2.5.2 pH對細(xì)菌素的影響 菌體培養(yǎng)物以2%的接種量接入50 mL LB培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)24 h,獲得拮抗液,用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)無細(xì)胞發(fā)酵上清液pH,使其pH分別為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0,37 ℃保溫2 h后,再調(diào)回至初始pH6.8±0.2,參照1.2.1測定上清液對大腸桿菌的抑菌直徑[17]。

相對抑菌率(%)=[(對照組擴(kuò)展直徑-處理組擴(kuò)展直徑)/對照組擴(kuò)展直徑]×100

1.2.6 細(xì)菌素抑菌譜 以主要的食源性致病菌大腸桿菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和克氏原鰲蝦優(yōu)勢腐敗菌賴氨酸芽孢桿菌(Lysinibacillus)做為指示菌,活化后稀釋到1.0×108CFU·mL-1,涂布接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基表面,參照1.2.1測定上清液對各指示菌的抑菌直徑[17]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)中每組數(shù)據(jù)均進(jìn)行3次重復(fù),數(shù)據(jù)用Excel 2007軟件處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 多粘類芽孢桿菌菌株的篩選

利用高溫水浴殺死營養(yǎng)細(xì)胞體的方法,從樣品中共分離出103株產(chǎn)芽孢細(xì)菌,通過革蘭氏染色和芽孢染色后,發(fā)現(xiàn)其中87株菌同時具有革蘭氏陽性、產(chǎn)芽孢、桿狀細(xì)胞的特點(diǎn),初步確定這87株菌屬于芽孢桿菌屬細(xì)菌。

2.2 抑菌物質(zhì)產(chǎn)生菌株的篩選

利用瓊脂擴(kuò)散法,以大腸桿菌為指示菌,對從湖泥中分離的87株芽孢桿菌屬細(xì)菌進(jìn)行抑菌活性檢測,選取一株抑菌效果最好的菌株將其命名為XW4,結(jié)果如圖1所示。由圖1可見,XW4對大腸桿菌有抑制作用,能形成抑菌圈,圖1中該細(xì)菌素抑菌圈平均直徑為(17.86±0.33) mm,打孔直徑為6 mm;選用XW4菌株作為進(jìn)一步試驗(yàn)的測試菌。

圖1 菌株對指示菌的抑菌作用Fig.1 The antimicrobial effect of the selected strain

2.3 排除H2O2的抑菌作用

細(xì)菌生長代謝過程所產(chǎn)有機(jī)酸、H2O2以及菌體細(xì)胞常常也具有抑菌作用,初步篩選的XW4需進(jìn)一步確定其抑菌活性是否為細(xì)菌素所致。由于拮抗液的制作過程包含過濾除菌環(huán)節(jié),故排除菌體細(xì)胞的影響;此外,在發(fā)酵前后上清液的pH無顯著變化為6.8±0.2,排除酸的干擾;加熱法分解H2O2,結(jié)果如圖2所示。由圖可知上清液排除H2O2后仍然具有顯著抑菌作用,抑菌圈直徑平均為(16.88±0.71) mm,和處理前相比抑菌性變化不大,初步判斷H2O2不是XW4的抑菌物質(zhì)。

圖2 H2O2 排除后的抑菌作用Fig.2 The antimicrobial effect of Bacillus XW4 after eliminating H2O2

2.4 對蛋白酶的敏感性

為確定XW4的抑菌物質(zhì)是否為蛋白或肽類,分別用木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶k、胃蛋白酶對上清液進(jìn)行處理,抑菌結(jié)果見圖3。圖3表明,拮抗液中加入不同蛋白酶后,加蛋白酶k與對照相比抑菌圈直徑顯著減小,抑菌活性降低;而木瓜蛋白酶和胰蛋白酶、胃蛋白酶對上清液抑菌活性的影響較小,抑菌圈相對抑菌率為6.82%、5.89%、11.00%,與對照組相比差異不顯著;蛋白酶k對其抑菌活性的影響較大,其相對抑菌率為50.5%。從酶處理的結(jié)果來看,說明XW4所產(chǎn)抑菌物質(zhì)為蛋白類的細(xì)菌素物質(zhì)。由于細(xì)菌素的氨基酸組成特征不同,造成細(xì)菌素對蛋白酶的敏感型不同。

圖3 蛋白水解酶對芽孢桿菌XW4細(xì)菌素活性的影響Fig.3 The effect of proteolytic enzyme on the activitiy of bacteriocin from Bacillus XW4注：圖中不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.5 菌株鑒定

2.5.1 菌株XW4菌體形態(tài)學(xué)觀察 由圖4可觀察到菌落成圓形,直徑大小0.9～1.7 mm,白色菌落,半透明,表面光滑濕潤,革蘭氏染色呈陽性,放大倍數(shù)為100時顯微鏡觀察下細(xì)胞形狀為長桿狀。

圖4 菌株XW4的形態(tài)特征Fig.4 The morphological characteristic of train XW4

2.5.2 生理生化特征 菌株XW4的生理生化測定結(jié)果見表1。由表1可知,菌株XW4能還原硝酸鹽、水解淀粉等。根據(jù)鑒定結(jié)果查表,并結(jié)合革蘭氏染色觀察結(jié)果,可初步確定XW4菌株屬于多粘類芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa)。

表1 芽孢桿菌XW4的生理生化特征 Table 1 Biochemical characteristic of Bacillus XW4

注:“+”表示為陽性;“-”表示為陰性。

2.5.3 細(xì)菌16S rDNA基因序列分析和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建 測試菌株XW4經(jīng)過擴(kuò)增電泳后得到大約1498 bp的序列。將測序的結(jié)果輸入到Genebank中,使用Blast功能對目的序列與Genebank庫中的已有數(shù)據(jù)序列進(jìn)行同源性比對[18]。Clustal X 1.8對齊之后使用MEGA 5.0計(jì)算序列相似性,構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,發(fā)育樹結(jié)果見圖5。軟件進(jìn)行序列分析后,菌株XW4與同源性搜索后關(guān)系最近的前2株來自多粘類芽孢桿菌的親緣性最高,與菌株P(guān)aenibacilluspolymyxaKRO58350.1處于同一個小分支,親緣關(guān)系最接近。結(jié)合菌落形態(tài)學(xué)特征和生理生化鑒定的結(jié)果,菌株XW4被鑒定為多粘類芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa)。

圖5 菌株XW4的16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 The developmental phylogenetic tree of XW4 based on 16S rDNA

2.6 溫度和pH對細(xì)菌素的影響

2.6.1 溫度對細(xì)菌素的影響 經(jīng)過不同溫度處理后結(jié)果如圖6所示。由圖6可知,菌株XW4的拮抗液經(jīng)60、80和100 ℃處理30 min后,對大腸桿菌的抑菌活性基本無影響,抑菌圈直徑保持在(16±0.30) mm范圍內(nèi);經(jīng)120 ℃處理30 min后仍具有一定的抑菌性,表明XW4所產(chǎn)細(xì)菌素有顯著的熱穩(wěn)定性。研究發(fā)現(xiàn)地衣芽孢桿菌產(chǎn)生的桿菌素490是一種新型的食品抗菌劑,在熱處理和貯藏過程中表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性,在高溫下也具有殺菌活性[19]。蘇云金芽孢桿菌HD868所產(chǎn)細(xì)菌素在90 ℃時相對耐熱,但煮沸30 min后未檢測到菌素活性[20]。地衣芽孢桿菌MKU3所產(chǎn)細(xì)菌素在100 ℃ 維持10 min時穩(wěn)定,在121 ℃時15 min失去活性[21]。蘇云金桿菌SF361產(chǎn)生的細(xì)菌素，其活性在50 ℃維持30 min時穩(wěn)定,在80 ℃以上時，維持10 min，其活性降低到無法檢測到的水平[22]。解淀粉芽孢桿菌J4產(chǎn)生的細(xì)菌素在80 ℃、20 min穩(wěn)定,在100 ℃、15 min失活[23]?？莶菅挎邨U菌sly-3產(chǎn)生的細(xì)菌素在100 ℃的溫度下保存60 min不會失去任何活性[24]。綜上所述與已報(bào)道的菌株相比XW4產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)熱穩(wěn)定性突出,有良好的應(yīng)用前景。

圖6 溫度處理對多粘類芽孢桿菌XW4抑菌效果的影響Fig.6 Effect of temperature on the activity of bacteriocin from Paenibacillus polymyxa XW4

2.6.2 pH對細(xì)菌素的影響 不同pH條件下菌株XW4的拮抗液對大腸桿菌的抑菌活性變化情況如圖7所示,由圖7可知,XW4所產(chǎn)細(xì)菌素在相對較寬的pH范圍(pH3.0～11.0)內(nèi)抑菌活性穩(wěn)定,pH9.0～11.0的堿性環(huán)境中抑菌活性相對其他報(bào)道耐受性較強(qiáng)。處于pH7.0的中性條件下抑菌活性最強(qiáng),低于或高于此值的偏酸或偏堿環(huán)境時,抑菌活性會不同程度遞減。pH3.0的偏酸環(huán)境時,抑菌活力減少到77.04%,pH11.0的偏堿環(huán)境中,抑菌活力減少到79.75%。偏堿環(huán)境下的抑菌效果強(qiáng)于偏酸環(huán)境下的抑菌效果。而相關(guān)研究多有報(bào)道偏堿環(huán)境下的抑菌效果弱于偏酸環(huán)境下的抑菌效果。蘇云金芽孢桿菌菌株BUPM103中提取的一種新的細(xì)菌素F103在pH3.0～10.0范圍內(nèi)活性均穩(wěn)定[25]?？藙谑涎挎邨U菌GM17產(chǎn)生的細(xì)菌素在pH3.0～9.0范圍內(nèi)活性均穩(wěn)定[26]?？莶菅挎邨U菌H27產(chǎn)生的細(xì)菌素在pH3.0～9.0范圍內(nèi)活性均穩(wěn)定,在pH10及以上時無活性[27]。多粘類芽孢桿菌JB05-01-1產(chǎn)生的抗菌物質(zhì),活性在2～9的pH范圍內(nèi)均穩(wěn)定[28]。因此，該細(xì)菌素的這一特性不但有利于其在弱酸性、中性,而且在堿性食品中都可作為防腐劑的使用。

圖7 pH對多粘類芽孢桿菌XW4抑菌效果的影響Fig.7 Effect of pH on the activitiy of bacteriocin from Paenibacillus polymyxa XW4

2.7 細(xì)菌素抑菌譜

通過平板打孔法檢測菌株XW4抑菌普,結(jié)果見圖8。結(jié)果表明,該拮抗液抑菌譜較廣,分別對G-菌(如大腸桿菌)和G+菌(如金黃色葡萄球菌)均有良好抑菌作用,抑菌圈的直徑均為(17±0.86) mm;對克氏原鰲蝦優(yōu)勢腐敗菌賴氨酸芽孢桿菌有顯著的抑制作用,抑菌圈直徑為(18±0.47) mm;對食品中常見腐敗菌枯草芽孢桿菌抑菌效果良好,抑菌圈直徑為(17±0.37) mm。表明菌株XW4所產(chǎn)細(xì)菌素具有廣譜抑菌性,對克氏原鰲蝦優(yōu)勢腐敗菌賴氨酸芽孢桿菌有顯著的抑制作用。多粘類芽孢桿菌XW4所產(chǎn)細(xì)菌素對食品中的常見優(yōu)勢腐敗菌有顯著抑制的作用,表明其在生物保鮮方面的應(yīng)用有良好的前景。

圖8 多粘類芽孢桿菌XW4所產(chǎn)細(xì)菌素的抑菌譜 Fig.8 Inhibition spectrum of bacteriocin produced by Paenibacillus polymyxa XW4

3 結(jié)論

本研究從湖泥中分離得到1株不僅對食物中的腐敗菌及致病菌具有顯著抑菌作用，而且對水產(chǎn)中克氏原鰲蝦優(yōu)勢腐敗菌具有良好抑菌作用的芽孢桿菌菌株XW4,經(jīng)生理生化試驗(yàn)和16S rDNA鑒定為多粘類芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa)。抑菌物質(zhì)具有顯著的熱穩(wěn)定性,100 ℃ 處理30 min后活性仍為原來的79.63%,120 ℃ 處理30 min后抑菌活性為原來的31.82%。抑菌活性在pH3.0～11.0范圍內(nèi)穩(wěn)定,XW4的抑菌物質(zhì)在堿性環(huán)境中穩(wěn)定性與已報(bào)道的相比更好,在堿性環(huán)境中活性減弱幅度較小且抑菌效果顯著,利用這一特性可作為堿性食品保鮮劑。經(jīng)蛋白酶k處理后抑菌活性顯著降低,初步可以推測抑菌活性物質(zhì)為蛋白質(zhì)類的細(xì)菌素。該抑菌物質(zhì)抑菌譜較廣,包括大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌,且抑菌效果顯著。因此，本實(shí)驗(yàn)室從克氏原鰲蝦分離出的優(yōu)勢腐敗菌，其細(xì)菌素有顯著的抑菌效果,為生物保鮮行業(yè)的廣泛應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。本研究將會進(jìn)一步分析菌株XW4的抑菌物質(zhì)結(jié)構(gòu)、安全性和抑菌機(jī)理,為其商業(yè)化應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。