孫克娜 綜述，劉曉斐 審校

1.濰坊醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系，山東濰坊261053；2.中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九六醫(yī)院實(shí)驗(yàn)診斷科，山東濟(jì)南250031

宮頸癌（cervical cancer，CC）在女性生殖道惡性腫瘤中居于首位，在女性主要死亡原因中居第四位[1-2]。2018 年的調(diào)查表明我國(guó)是宮頸癌發(fā)生的高危國(guó)家[1]，面臨著較重的宮頸癌診治負(fù)擔(dān)。目前宮頸癌的篩查手段主要有液基薄層細(xì)胞學(xué)檢測(cè)（thinprep cytologic test，TCT）、人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）DNA 檢測(cè)、陰道鏡檢查和宮頸活檢。臨床主要應(yīng)用鱗狀細(xì)胞癌抗原（squamous cell carcinoma antigen，SCCA）作為篩查宮頸癌的血清腫瘤標(biāo)志物，它在晚期及復(fù)發(fā)的患者血清中升高明顯，但在早期患者血清中無明顯升高。早期診斷、及時(shí)和恰當(dāng)?shù)闹委熆擅黠@提高宮頸癌的治愈率，降低病死率。因此，急需尋找敏感而有效的早期診斷宮頸癌方法。

蛋白質(zhì)組學(xué)作為一種新型的研究方法，可以動(dòng)態(tài)、整體、定量觀察疾病發(fā)生發(fā)展中蛋白質(zhì)的種類和數(shù)量的改變，有助于研究者們尋找腫瘤早期診斷和預(yù)后的特異性標(biāo)志物以及藥物治療靶標(biāo)。但是，蛋白質(zhì)組學(xué)作為一個(gè)完整系統(tǒng)，其特性和活動(dòng)在很大程度上仍然難以解釋。目前，先進(jìn)的質(zhì)譜技術(shù)讓我們對(duì)蛋白質(zhì)組學(xué)有了前所未有的認(rèn)識(shí)，包括組成、結(jié)構(gòu)、功能和調(diào)控，同時(shí)，也為復(fù)雜的生物學(xué)過程和表現(xiàn)提供了理論依據(jù)[3]。

1 基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜

基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（matrix- assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）是用激光照射樣品與基質(zhì)形成的共結(jié)晶薄膜，基質(zhì)從激光中吸收能量傳遞給生物分子。電離過程是將質(zhì)子轉(zhuǎn)移到生物分子或從生物分子中得到質(zhì)子，而使生物分子電離的過程，離子質(zhì)荷比與其飛行時(shí)間成正比[4]。它是一種軟電離技術(shù)，適用于混合物及生物大分子的檢測(cè)。MALDI-TOF-MS 對(duì)分析物溶液中的鹽和洗滌劑有很高的耐受性[5]，可用于分析各種來源的小型有機(jī)或大型生化化合物[6]，已被證明是一種有價(jià)值的癌癥診斷工具。與傳統(tǒng)技術(shù)相比，MALDI-TOF-MS 具有準(zhǔn)確度高、檢測(cè)范圍廣、兼容性好等優(yōu)點(diǎn)，可以與熒光雙向電泳、磁珠等技術(shù)結(jié)合使用[7]。缺點(diǎn)主要是需要預(yù)處理、再現(xiàn)性差、信噪比和靈敏度低[8]；在檢測(cè)血清樣品時(shí)，受樣品基質(zhì)的干擾較為嚴(yán)重，尤其是相對(duì)分子質(zhì)量低于500 的小分子多肽。

在MALDI-TOF-MS 基礎(chǔ)上發(fā)展的可視化基質(zhì)輔助激光解析吸附質(zhì)譜分析成像（MALDIMSI）可將多種類型的化合物直接可視化和繪制到基質(zhì)涂層組織切片上。該技術(shù)具有客觀、準(zhǔn)確、快速和所需標(biāo)本量少等優(yōu)點(diǎn)。除蛋白質(zhì)和多肽外，MALDI-MSI 還可用于其他多種類型分子的研究[9]，以發(fā)現(xiàn)新的診斷相關(guān)生物標(biāo)志物，特別是在腫瘤學(xué)研究領(lǐng)域[10-11]，有助于深入了解細(xì)胞癌變的機(jī)制[12]。以9-氨基吖啶為基質(zhì)的MALDI 可直接檢測(cè)癌組織中的蛋白質(zhì)、低質(zhì)量代謝物和脂質(zhì)，包括乳酸、丙酮酸、琥珀酸和富馬酸，其組織積累與特定綜合征代謝物相關(guān)。通過蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)數(shù)據(jù)庫中的途徑信息，可以鑒定出具有與已知腫瘤生物學(xué)一致的不同代謝特征的腫瘤組織樣品內(nèi)的區(qū)域[11]。此外，Longuespée[13]強(qiáng)調(diào)基于LC-MS/MS 發(fā)現(xiàn)生物標(biāo)記物數(shù)據(jù)的潛力，可以更好地指導(dǎo)MALDI 成像物質(zhì)的識(shí)別。

1.1 MALDI-TOF-MS 在宮頸癌診斷中的應(yīng)用

MALDI-TOF-MS 是近年來宮頸癌蛋白質(zhì)組學(xué)研究最為熱門的質(zhì)譜技術(shù)，已取得了突破性進(jìn)展。在宮頸腺癌組織中篩選出3 個(gè)低表達(dá)（抑制素、PTEN、乳鐵蛋白）和4 個(gè)高表達(dá)（谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶、HIPK2、CD44、半乳凝集素7）的差異蛋白質(zhì)，Western 印跡結(jié)果（抑制素和PTEN 的表達(dá)變化情況）與蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果相一致[14]。在宮頸鱗癌組織中發(fā)現(xiàn)mimecan、主動(dòng)脈平滑肌肌動(dòng)蛋白和lumican 表達(dá)增加，而角蛋白、Ⅱ型細(xì)胞骨架5、過氧化物酶1 和14-3-3 蛋白表達(dá)水平明顯降低[15]。這2 項(xiàng)研究分別針對(duì)宮頸腺癌和鱗癌，這些差異表達(dá)蛋白可能是宮頸癌發(fā)生的相關(guān)蛋白，可以作為宮頸癌早期診斷的潛在標(biāo)志物，這也充分說明MALDI-TOF-MS 技術(shù)在癌癥患者活體組織中發(fā)現(xiàn)異常蛋白具有實(shí)驗(yàn)可行性。組織學(xué)標(biāo)志物研究可以為病理診斷提供分子依據(jù)，減少人為因素的干擾，能夠更好地區(qū)分癌組織和癌旁組織。

1.2 MALDI-TOF-MS 在宮頸癌發(fā)生和發(fā)展機(jī)制研究中的應(yīng)用

近幾年，很多國(guó)內(nèi)外學(xué)者熱衷于信號(hào)傳導(dǎo)通路研究領(lǐng)域，致力于分析宮頸癌發(fā)生和發(fā)展機(jī)制。Pappa 等[16]通過雙向電泳對(duì)正常宮頸細(xì)胞（HCK1T）和HPV 陰性（C33A）、SiHa（HPV16+）、HeLa（HPV18+）宮頸癌細(xì)胞的蛋白進(jìn)行分離，經(jīng)MALDI-TOF-MS 篩選出113 種差異表達(dá)的蛋白質(zhì)。生物信息學(xué)分析顯示，肌動(dòng)蛋白的細(xì)胞骨架信號(hào)通路明顯失調(diào)，并且通過免疫印跡進(jìn)一步驗(yàn)證了肌動(dòng)蛋白絲切蛋白1（cofilin-1）在C33A 和HeLa 細(xì)胞中顯著上調(diào)。絲切蛋白1 具有核定位信號(hào)，可以對(duì)肌動(dòng)蛋白進(jìn)行切斷和解聚，在肌動(dòng)蛋白動(dòng)力學(xué)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。這項(xiàng)研究首次發(fā)現(xiàn)了絲切蛋白1 與宮頸癌的發(fā)生機(jī)制有關(guān)，為宮頸癌細(xì)胞骨架信號(hào)通路的研究提供了新的思路。Kontostathi 等[17]為了研究宮頸癌細(xì)胞系分泌蛋白在癌癥發(fā)生中的作用，采用同樣的方法發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)ig-h3（βig-h3）和過氧化物酶2（PRDX2）在宮頸癌細(xì)胞系中的表達(dá)顯著增加。這項(xiàng)研究與之前Monge 等[18]報(bào)道的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β與子宮癌發(fā)生和發(fā)展有關(guān)的研究結(jié)果相一致。Kontostathi 等進(jìn)一步采用生物信息學(xué)方法，發(fā)現(xiàn)宮頸癌細(xì)胞系中轉(zhuǎn)錄因子NRF2 是表達(dá)差異蛋白的調(diào)節(jié)因子。為了驗(yàn)證這一生物信息學(xué)預(yù)測(cè)，采用免疫印跡和多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）方法檢測(cè)了NRF2 的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)與HCK1T 相比，NRF2 在SiHa 和C33A 細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)。需要指出的是，異常的NRF2 介導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)（OSR）是癌癥發(fā)生的一個(gè)顯著特征[19]。作為一種重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，NRF2 可以保護(hù)人體細(xì)胞免受氧化損傷，但NRF2 介導(dǎo)的氧化反應(yīng)也是調(diào)節(jié)宮頸癌細(xì)胞系分泌蛋白的重要途徑。該實(shí)驗(yàn)為后續(xù)開展宮頸癌研究提供了新途徑，致力于發(fā)現(xiàn)該途徑蛋白質(zhì)之間的相互作用，將為理想標(biāo)志物的篩選和機(jī)制研究提供理論基礎(chǔ)。

1.3 MALDI-TOF-MS 在宮頸癌治療研究中的應(yīng)用

最近，在HeLa 和侵襲性HeLa-15 細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)孕酮受體膜組分1（PGRMC1）能夠調(diào)控宮頸癌細(xì)胞的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移，是宮頸癌潛在的治療靶點(diǎn)[20]。Chen 等[21]在手術(shù)預(yù)后研究中發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)酮酶（TKT）和纖維蛋白原α鏈前體（FGA）是評(píng)估CC 患者手術(shù)預(yù)后的血清標(biāo)志物。迄今，在宮頸癌治療過程中能夠用于臨床的標(biāo)志物非常少，因此臨床應(yīng)用價(jià)值還須進(jìn)一步探討。宮頸鱗癌新輔助化療（NAC）在縮小腫瘤、控制微轉(zhuǎn)移、減少陽性淋巴結(jié)的數(shù)量和選擇手術(shù)方面具有重要意義。但是，在治療過程中，宮頸癌患者對(duì)大部分化學(xué)治療劑具有抵抗性，降低了該療法的有效性。Guo 等[22]為了尋找SCC 患者對(duì)NAC 反應(yīng)的預(yù)測(cè)標(biāo)志物，采用二維凝膠電泳對(duì)接受NAC 的宮頸鱗癌患者的癌灶蛋白進(jìn)行分離，將差異表達(dá)的12 個(gè)蛋白點(diǎn)通過MALDI-TOF 進(jìn)行檢測(cè)。NAC 無應(yīng)答者與NAC響應(yīng)者相比，7 個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)上調(diào)，5 個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)下調(diào)。這些蛋白質(zhì)參與細(xì)胞代謝、遷移和凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等多種細(xì)胞過程。最后，通過免疫印跡鑒定了3 個(gè)蛋白，驛蛋白1（stathmin1）、Hsp70 和丙酮酸激酶同種型M2，并且發(fā)現(xiàn)Hsp70 的過表達(dá)有抑制順鉑的效果。該研究發(fā)現(xiàn)了許多候選蛋白質(zhì)參與化療耐藥/敏感性的調(diào)控，其中Hsp70 可能是預(yù)測(cè)宮頸鱗癌患者化療療效的潛在標(biāo)志物。

2 表面增強(qiáng)激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜

2002 年，田中耕一發(fā)明了表面增強(qiáng)激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（surface enhanced laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry，SELDI-TOF-MS），由蛋白質(zhì)芯片、激光吸收離子化質(zhì)譜設(shè)備和人工智能數(shù)據(jù)分析處理軟件三部分組成，其檢測(cè)原理是利用激光脈沖輻射使芯片表面結(jié)合能量，吸收分子的分析物，解析成帶電離子，質(zhì)荷比不同的離子在磁場(chǎng)中飛行時(shí)間不同，經(jīng)計(jì)算機(jī)軟件處理后形成模擬圖譜。質(zhì)譜圖和離子流圖相結(jié)合可直觀顯示獲得的蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量、含量、等電點(diǎn)、磷酸化位點(diǎn)、糖基化位點(diǎn)等信息。SELDI-TOF-MS 應(yīng)用簡(jiǎn)便，高通量，自動(dòng)化，能夠不經(jīng)處理直接點(diǎn)樣檢測(cè)標(biāo)本中的多種蛋白質(zhì)。但它對(duì)高分子量蛋白質(zhì)不敏感，僅限于對(duì)低分子量肽的分析[23]。隨著標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)條件和蛋白資料庫的不斷完善，再結(jié)合基因組積累的大量信息，相信SELDI-TOF-MS 必將成為臨床常規(guī)診斷和基礎(chǔ)理論研究的重要技術(shù)手段。

2.1 SELDI-TOF-MS 在宮頸癌診斷中的應(yīng)用

近年來，隨著蛋白質(zhì)組學(xué)研究的不斷深入，運(yùn)用SELDI-TOF-MS 技術(shù)檢測(cè)宮頸癌患者的特異多肽標(biāo)志物，為宮頸癌的診斷、治療效果及預(yù)后復(fù)發(fā)的評(píng)估提供了新的思路。梁衛(wèi)江等[24]采用SELDI-TOF-MS 研究宮頸鱗癌患者血清差異蛋白質(zhì)與SCCA 之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)m/z4172、3397、2741和6086 在宮頸鱗癌SCCA 正常組和升高不同水平組中反復(fù)出現(xiàn)，這些蛋白質(zhì)可作為宮頸癌早期標(biāo)志物進(jìn)行深入研究，具有重要的臨床應(yīng)用前景和研究?jī)r(jià)值。SELDI-TOF-MS 樣品來源廣泛，血液、尿液和組織液等均可作為檢測(cè)對(duì)象。在血清標(biāo)本中，蔡思娜等[25]采用SELDI-TOF-MS 結(jié)合弱陽離子磁珠檢測(cè)了25 例健康女性志愿者和24 例SCCA 正常的宮頸癌患者血清，篩選出4 個(gè)顯著性差異的多肽峰。通過建立聯(lián)合診斷數(shù)據(jù)模型進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其診斷宮頸癌的敏感性和特異性分別為91.67%、96%，達(dá)到了比較理想的結(jié)果。在尿液標(biāo)本中，Mu 等[23]通過SELDI-TOF-MS 對(duì)比經(jīng)木菠蘿甘露糖結(jié)合（champedak mannose binding，CMB）凝集素捕獲宮頸癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌和健康者的尿糖肽，發(fā)現(xiàn)m/z1201 能將卵巢癌與宮頸癌和子宮內(nèi)膜癌區(qū)別開來，敏感性和特異性均為100%，而m/z1449 能將子宮內(nèi)膜癌與其他2 種癌癥區(qū)分開。尿糖肽m/z1201 和1449 可作為早期診斷宮頸癌、卵巢癌和子宮內(nèi)膜癌的潛在生物標(biāo)志物。這些研究證明了SELDI-TOF-MS 在臨床診斷方面的優(yōu)勢(shì)及其可行性。但目前大多數(shù)研究標(biāo)本量較少，需要增加標(biāo)本量做進(jìn)一步的驗(yàn)證。

2.2 SELDI-TOF-MS 在宮頸癌治療研究中的應(yīng)用

在宮頸癌治療過程中通過SELDI-TOF-MS 分析，證實(shí)SCCA 可以用來判斷臨床分期和指導(dǎo)臨床手術(shù)[26]。SCCA 的臨床應(yīng)用不再局限于篩選宮頸癌患者和評(píng)估化療療效，可以有效地避免TCT和病理診斷取材的限制，月經(jīng)經(jīng)期也可以進(jìn)行檢測(cè)，減少了診斷時(shí)間，提高了患者的生存周期。另外，Van 發(fā)現(xiàn)m/z2698.9、3953.2 和15254.8 與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)[27]。放化療是治療晚期宮頸癌的一個(gè)主要手段，在評(píng)估治療效果的研究中，Harima等[28]通過SELDI-TOF-MS 對(duì)評(píng)估良好的宮頸癌患者和已死亡宮頸癌患者的2 組血清與健康體檢者的血清分別進(jìn)行比較，篩選出m/z8918（已死亡患者明顯低于對(duì)照組和評(píng)估良好的患者），然后采用肽質(zhì)量指紋圖譜和串聯(lián)質(zhì)譜方法鑒定出與該肽峰最匹配的蛋白是載脂蛋白CⅡ（ApoC-Ⅱ），并通過ELISA 進(jìn)一步驗(yàn)證和確認(rèn)。眾所周知，基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）是腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵介質(zhì)，參與細(xì)胞增殖、分化、血管生成和細(xì)胞遷移。ApoC-Ⅱ作為MMP 的新型底物，對(duì)宮頸癌進(jìn)展的調(diào)控具有重要作用。

3 結(jié)語

雖然SELDI-TOF-MS 和MALDI-TOF-MS 功能強(qiáng)大，可用于篩選新型生物標(biāo)志物，但也面臨著一系列的難題。例如，質(zhì)譜儀價(jià)格昂貴，對(duì)操作人員的要求高，使該項(xiàng)技術(shù)很難在基層開展。最重要的問題是，要簡(jiǎn)化蛋白質(zhì)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測(cè)的步驟，滿足高通量蛋白質(zhì)組學(xué)研究的需要。另外，目前腫瘤標(biāo)志物的研究樣本量較少，不能對(duì)各個(gè)年齡、各個(gè)民族進(jìn)行充分驗(yàn)證，還需要深入研究。蛋白質(zhì)圖譜揭示了基因所編碼的蛋白質(zhì)的表達(dá)、蛋白質(zhì)的修飾以及蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用。隨著質(zhì)譜技術(shù)和生物信息學(xué)的不斷發(fā)展，我們可以對(duì)尿液、血清、組織等多種類型標(biāo)本的蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)行分析，獲得更多的生物學(xué)信息。我們還可以通過生物信息學(xué)技術(shù)不斷完善蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫，進(jìn)而分析癌癥患者發(fā)生癌變的機(jī)制和關(guān)鍵步驟，探索出有針對(duì)性的預(yù)防和治療方案，為疾病的早期診斷和預(yù)后判斷提供有效的手段。