張英楠,黃佳星,梁欣然,李 芽,于書海,王 鄭

(內(nèi)蒙古大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,中國內(nèi)蒙古呼和浩特010021)

受精是單倍體的精子和單倍體的卵子在雌性動物輸卵管內(nèi)相遇、識別、黏附并融合形成一個新的二倍體生物的過程[1]。一直以來,許多科學(xué)家都致力于揭示哺乳動物受精作用之謎。隨著體外受精技術(shù)的發(fā)展,受精在細(xì)胞層面已經(jīng)得到很好的闡述。精子在雌性生殖道內(nèi)獲得使卵細(xì)胞受精的能力,通過頂體反應(yīng)讓之前隱藏的受體蛋白質(zhì)暴露于表面。一旦受精,卵黃膜和透明帶都會發(fā)生生化改變,使卵子不會接受額外的精子,從而減少出現(xiàn)不能存活的多倍體胚胎的可能性。然而,精卵融合過程到底涉及到哪些受體蛋白質(zhì)？在介導(dǎo)精卵融合過程中這些蛋白質(zhì)又如何發(fā)生相互作用？相關(guān)的分子機(jī)制仍不十分明確。在以往的研究中,研究者提出了許多可能參與精卵質(zhì)膜融合的關(guān)鍵分子,如SPESP1(sperm equatorial segment protein 1)、CRISP2(cysteine-rich secretory protein 2)、TSSK6(testis-specific serine kinase 6)等[2～4]。但科學(xué)家們通過基因敲除實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),這些候選分子只是參與精卵的融合過程,并不是精卵融合必不可少的因素。目前通過基因敲除實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)IZUMO1、JUNO 和 CD9(cluster of differentiation antigen 9)為精卵融合過程中的必需蛋白質(zhì),且主要在精卵融合最初的黏附過程中共同發(fā)揮作用。本文對哺乳動物精卵融合必需蛋白質(zhì)IZUMO1-JUNO/CD9的結(jié)構(gòu)、功能和分子機(jī)制的研究進(jìn)展進(jìn)行闡述。

1 IZUMO1-JUNO復(fù)合物

1.1 IZUMO1蛋白

IZUMO1最早是通過精子單克隆抗體OBF13抑制精子與去透明帶的卵子結(jié)合而發(fā)現(xiàn)的[5～6]。IZUMO1是免疫球蛋白超家族的成員,屬于I型膜蛋白,由胞外區(qū)域的免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域、單次跨膜結(jié)構(gòu)域和短胞質(zhì)尾組成。CRISPR/Cas9介導(dǎo)的突變實(shí)驗(yàn)表明,短胞質(zhì)尾對于IZUMO1受精功能不是必需的:短胞質(zhì)尾能調(diào)節(jié)IZUMO1的表達(dá)量,但不參與IZUMO1易位和精卵融合過程[7]。哺乳動物IZUMO1家族蛋白的N-末端有一個含接近150個氨基酸的“IZUMO結(jié)構(gòu)域”,“IZUMO結(jié)構(gòu)域”含8個半胱氨酸殘基,決定IZUMO1的生物活性[8]。胞外區(qū)的免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域有一個相對保守的N-聚糖,它能夠在睪丸尾部保護(hù)IZUMO1不被降解[9]。單次跨膜結(jié)構(gòu)域和短胞質(zhì)尾具有睪丸組織特異性,在發(fā)生頂體反應(yīng)后的精子質(zhì)膜區(qū)表達(dá)[10]。Young等[11]發(fā)現(xiàn),IZUMO1的短胞質(zhì)尾區(qū)域在IZUMO1重新定位時會高度磷酸化。

在受精過程中,成熟的精子發(fā)生頂體反應(yīng)穿過透明帶,會使IZUMO1從頂體內(nèi)膜下重新定位到精子赤道段。而IZUMO1正確的重新定位對于精卵融合是至關(guān)重要的。Fukuda等[12]在2016年發(fā)現(xiàn),公牛冷凍精子的受精能力受損可能與IZUMO1的異常異位有關(guān)。Zhou等[13]認(rèn)為,IZUMO1重新定位還可以幫助卵母細(xì)胞選擇能夠進(jìn)行精卵融合的精子。

1.2 JUNO蛋白

2014年,Bianchi等[14]確認(rèn)了小鼠卵細(xì)胞的葉酸受體4(folate receptor 4,Folr4)就是IZUMO1的受體蛋白質(zhì)。由于葉酸受體4不具有和葉酸結(jié)合的能力,故而發(fā)現(xiàn)者建議將其更名為JUNO。JUNO是一種錨定蛋白,通過對JUNO進(jìn)行免疫染色定位發(fā)現(xiàn),JUNO在生發(fā)泡期(germinal vesicle,GV)的卵母細(xì)胞中表達(dá),并會繼續(xù)以類似的水平在卵母細(xì)胞成熟的后期階段表達(dá)[15]。

哺乳動物的IZUMO1和JUNO在正向選擇下共同進(jìn)化[16]。早在1976年Jaffe[17]就已經(jīng)發(fā)現(xiàn),在IZUMO1與JUNO相互作用后,卵子膜會迅速地去極化以阻止多精入卵。后來人們通過比較小鼠卵子膜阻止多精入卵的時間與JUNO在卵子上消失的時間發(fā)現(xiàn),在哺乳動物中也有IZUMO1與JUNO相互作用阻止多精入卵的現(xiàn)象[18]。而且,受精后JUNO會從卵黃膜表面快速消失以防止多精入卵,確保卵子在正常情況下只與一個精子結(jié)合。

1.3 IZUMO1-JUNO復(fù)合物的作用

在izumo1基因敲除實(shí)驗(yàn)中,敲除izumo1的雄性小鼠仍具有正常的交配行為,且射精形成正常陰道栓,但無法產(chǎn)生后代。而直接給卵子胞質(zhì)中人工注射izumo1-/-,精子能夠形成受精卵并進(jìn)一步發(fā)育[6]。這說明IZUMO1的功能似乎只與精卵膜融合有關(guān)。近年來研究發(fā)現(xiàn),表達(dá)IZUMO1的Cos7細(xì)胞與卵母細(xì)胞只能黏附而不能融合[8,19],野生型精子與表達(dá)JUNO的HEK293細(xì)胞的相互作用也是如此[20]。黏附是精卵融合的前提,IZUMO1-JUNO復(fù)合物在精卵黏附時具有相互作用。2015年Bianchi等[21]證明來自敘利亞金倉鼠的JUNO可以直接和人類的IZUMO1產(chǎn)生相互作用。這個實(shí)驗(yàn)結(jié)果再一次印證了人類和小鼠體內(nèi)的IZUMO1和JUNO在細(xì)胞間的黏附作用過程中是保守的[22]。

2 IZUMO1-JUNO識別系統(tǒng)

2.1 IZUMO1-JUNO復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)

2016年,科學(xué)家們通過測定IZUMO1的晶體結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn),在pH不同的環(huán)境下,人的IZUMO1為細(xì)長的棒狀或飛鏢形狀結(jié)構(gòu)[19,23～24]。IZUMO1由一個螺旋束狀的“IZUMO結(jié)構(gòu)域”和免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域組成,兩者之間是一個β-發(fā)夾體。“IZUMO結(jié)構(gòu)域”和免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域通過4個保守的二硫鍵牢固地錨定在β-發(fā)夾體上[19]。JUNO是內(nèi)為袋狀的球狀結(jié)構(gòu),其晶體結(jié)構(gòu)整體折疊成類似于葉酸受體FRα和FRβ的形狀,由折疊核心和3個表面暴露的柔韌區(qū)組成[19～20]。IZUMO1 的 β-發(fā)夾體與JUNO配體結(jié)合口袋的后表面結(jié)合[19]。IZUMO1與JUNO識別的方式為IZUMO1的α-螺旋結(jié)構(gòu)域與JUNO表面的槽產(chǎn)生相互作用[25];準(zhǔn)確來說,是JUNO上的Trp62與IZUMO1的核心區(qū)域——α-螺旋上的疏水殘基產(chǎn)生相互作用,以1︰1 的形式形成復(fù)合體[19～20]。

Aydin等[24]發(fā)現(xiàn),人類IZUMO1與JUNO形成高親和力復(fù)合物時,IZUMO1構(gòu)象在其N-末端結(jié)構(gòu)域內(nèi)發(fā)生如下變化:IZUMO1未與JUNO結(jié)合時采用單體精子膜表面的回旋構(gòu)象,綁定到JUNO卵子受體后,IZUMO1的4HB區(qū)域朝著卵母細(xì)胞膜遷移,而且IZUMO1的鉸鏈區(qū)在JUNO的作用下,將其穩(wěn)定的“鎖定”到直立位置。

2.2 IZUMO1-JUNO復(fù)合物的分子機(jī)制

IZUMO1和JUNO之間的相互作用親和力非常弱,其復(fù)合物單體半衰期約為0.5 s[26]。我們由此提出疑問:IZUMO1和JUNO之間如此弱的相互作用是怎樣將精子和卵母細(xì)胞“綁定”的呢？科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)IZUMO1在頂體內(nèi)是單體形態(tài),在精子表面能與其他蛋白質(zhì)形成復(fù)合物,且其N-末端結(jié)構(gòu)域具有形成二聚體的能力[27～28]。Inoue等[29]認(rèn)為,JUNO首先與單體IZUMO1結(jié)合,然后逐漸聚集在精子的接觸面,誘導(dǎo)IZUMO1二聚化來增強(qiáng)精子與卵母細(xì)胞之間的附著力。2016年Nishimura等[30]發(fā)現(xiàn),IZUMO1的結(jié)構(gòu)與瘧原蟲孢子階段表達(dá)的入侵蛋白質(zhì)SPECT1(sporozoite microneme protein essential for cell traversal 1)和TRAP(thrombospondin repeat anonymous protein)的結(jié)構(gòu)十分相似,推測IZUMO1以類似于某些病毒融合的方式,作為支架招募其他精子或卵伴侶蛋白,形成多蛋白質(zhì)融合。目前還不清楚觸發(fā)精卵融合是否需要IZUMO1-JUNO復(fù)合物,觸發(fā)精卵融合的機(jī)制有下列3種假設(shè):第一種是異型的IZUMO1與JUNO組成的復(fù)合物或IZUMO1二次構(gòu)象的改變觸發(fā)了精卵融合;第二種是在形成IZUMO1-JUNO復(fù)合物后,IZUMO1通過硫醇-二硫化物交換反應(yīng),使整個結(jié)構(gòu)朝向精子膜側(cè)彎曲且使IZUMO1二聚化,從而觸發(fā)精卵融合[29];第三種是卵細(xì)胞膜和精子膜經(jīng)歷系列變化形成融合孔,實(shí)現(xiàn)膜融合,從而觸發(fā)精卵融合[24]。

JUNO在與單體IZUMO1形成復(fù)合物時,通過PDI相關(guān)蛋白質(zhì)重建IZUMO1的整體結(jié)構(gòu)。這種重排可以克服并置膜之間的排斥,使得IZUMO1的N-末端折疊到分子的內(nèi)側(cè)。然后二聚體與卵母細(xì)胞其他受體結(jié)合,使并置的磷脂雙分子層更加靠近[28]。隨后JUNO迅速消失,IZUMO1不再與JUNO結(jié)合。有研究表明,IZUMO1在大多數(shù)缺乏JUNO的界面上,仍然可以和卵母細(xì)胞緊密結(jié)合[31]?？梢娐涯讣?xì)胞側(cè)會有其他未識別的IZUMO1受體參與精卵融合。

3 CD9與IZUMO1-JUNO的共同作用

2000年,3個獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)室通過基因敲除實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),卵母細(xì)胞上的四次跨膜蛋白CD9是精卵融合的必需蛋白質(zhì)[32～34]。CD9由4個跨膜結(jié)構(gòu)域、2個胞外環(huán)以及3個短胞質(zhì)片段組成[35]。精子上雖然也有CD9,但雄性小鼠精子在敲除cd9后仍可與正常卵子融合[36]。由此看出CD9對精卵融合的影響具有位置效應(yīng):只有卵母細(xì)胞上的CD9才是精卵融合必需的,精子上的CD9不參與此過程。卵母細(xì)胞上的CD9是介導(dǎo)精卵融合的必需蛋白質(zhì),但是基因敲除之后,仍然有極少數(shù)的雌性小鼠可以生育,這說明卵母細(xì)胞上可能還有其他的相關(guān)蛋白質(zhì),能夠在一定程度上彌補(bǔ)CD9的功能缺失[22]。研究表明,含CD9的結(jié)構(gòu)在成熟過程中從小鼠卵子中釋放出來,通過調(diào)節(jié)精子黏附位點(diǎn)來促進(jìn)精卵融合[37]。Ravaux等[38]研究發(fā)現(xiàn),精子鞭毛擺動引起的振蕩使CD9在卵黃膜聚集,為精卵融合提供條件;在精卵融合2～5 min后,大多數(shù)CD9離開卵子,推測這個過程與阻止多精入卵機(jī)制有關(guān)。

CD9與IZUMO1-JUNO復(fù)合物系統(tǒng)一樣,在精卵融合的黏附過程中發(fā)揮作用。敲除cd9的卵子表面有更多精子黏附,但最強(qiáng)烈的作用模式卻消失了,精子在卵周間隙積聚[39～41]。這說明CD9在黏附中的作用是給精卵之間提供足夠的黏附力,從而使精卵質(zhì)膜足夠拉近,為下一步的融合提供條件。2014年Chalbi等[22]發(fā)現(xiàn),IZUMO1識別JUNO后,CD9在JUNO驅(qū)動下開始在融合區(qū)域積累;但是在CD9缺失的情況下,精子仍黏附在卵母細(xì)胞上,表明CD9對于IZUMO1-JUNO復(fù)合物的形成不是必需的。此外,在CD9表型正常的卵母細(xì)胞上,CD9與JUNO順式結(jié)合(直接或間接),形成具有較慢動力學(xué)的蛋白質(zhì)復(fù)合物的一部分,在沒有CD9時,IZUMO1的富集加速[22]。

4 結(jié)論與展望

現(xiàn)代社會中,不孕不育率逐年上升。受精機(jī)制的揭示,不僅可以對人類不孕不育疾病的治療、避孕方法的改善等提供幫助,而且也可能會對家畜的繁育提供幫助。本研究小組始終認(rèn)為,精卵細(xì)胞的最終融合需要精子上的多個蛋白質(zhì)組成的復(fù)合體與卵細(xì)胞膜表面多個蛋白質(zhì)組成的復(fù)合體共同發(fā)揮作用。正如本文所論述的,IZUMO1、JUNO和CD9是介導(dǎo)精卵融合的必需蛋白質(zhì)。IZUMO1是精子上特異性表達(dá)的蛋白質(zhì),而JUNO是IZUMO1在卵細(xì)胞上的受體。CD9在IZUMO1-JUNO復(fù)合體的驅(qū)動下開始在二者接觸的區(qū)域積累并為精卵融合提供足夠的黏附力,而細(xì)胞融合也正好發(fā)生在這個位置。它們之間并不是獨(dú)立存在的,而是有關(guān)聯(lián)地共同介導(dǎo)完成細(xì)胞融合的過程,且它們都在精卵融合的黏附階段就開始發(fā)揮作用。雖然目前已經(jīng)鑒定出這3個精卵融合所必需的蛋白質(zhì),但我們對精卵融合的分子機(jī)制仍然所知甚少。

2013年Lorenzetti等[42]在構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠時,“意外”發(fā)現(xiàn)外來基因的插入導(dǎo)致小鼠17號染色體的部分缺失。該缺失導(dǎo)致了spaca6(sperm acrosome membrane-associated 6)基因表達(dá)的失活,而且其精子呈現(xiàn)出與izumo1基因缺失相類似的特點(diǎn),即可以完成頂體反應(yīng)并穿越透明帶,但由于無法與卵細(xì)胞膜融合從而集聚在卵周空間內(nèi)。SPACA6與IZUMO1具有非常相似的結(jié)構(gòu)特征,都屬于免疫球蛋白超家族的成員,Inoue等[28]推測其在精卵融合后期發(fā)揮作用。實(shí)際上,染色體的缺失會同時帶來大量核苷酸片段的缺失,這些大量片段的缺失有可能會對受精造成潛在影響,但是現(xiàn)在仍缺乏進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證據(jù)證明染色體的完整性為精卵融合所必需。2016年Krauchunas等[43]提出“受精突觸”的概念:精子與卵子間的相互作用,與T細(xì)胞和抗原呈遞細(xì)胞參與的免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)——免疫突觸在多方面具有相似性,這個框架或許對于我們了解受精的分子機(jī)制會有所幫助[44]。

本實(shí)驗(yàn)室前期采用酵母雙雜交的方法分別利用IZUMO1和JUNO對大鼠卵巢cDNA文庫進(jìn)行了篩選,發(fā)現(xiàn)了大量可能參與精卵融合的潛在蛋白質(zhì),但是驗(yàn)證這些蛋白質(zhì)是否真為體內(nèi)受精過程的“關(guān)鍵因子”,還需要投入大量的工作。從2000年幾乎3個實(shí)驗(yàn)室同時發(fā)現(xiàn)了CD9,到2005年IZUMO1被證實(shí)是受精必不可少的因子,再到2014年JUNO被發(fā)現(xiàn)是IZUMO1的受體,我們可以發(fā)現(xiàn)精卵融合相關(guān)蛋白質(zhì)的探索仍會是一個“漫長”的過程。當(dāng)然,新的研究手段的介入有望縮短這個進(jìn)程。比如:生物信息學(xué)的應(yīng)用可以減少多余實(shí)驗(yàn),使得基因可以被批量的分析。這在一定程度上加快了基因篩選的進(jìn)程。同時,CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)拓寬了受精研究的途徑。定向誘變將CRISPR/Cas9以及模板DNA導(dǎo)入受精卵成像,可以觀察所研究的因子如何在受精過程中發(fā)揮作用[45]?；蚝Y選和基因組編輯技術(shù)的綜合應(yīng)用,將為我們受精機(jī)制的研究提供新思路。總之,隨著對受精相關(guān)基因深入的研究以及對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的進(jìn)一步剖析,受精作用分子之謎的答案將會被逐一揭開。