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(1.鄭州大學(xué) 物理工程學(xué)院 河南 鄭州 450001； 2.材料物理教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 河南 鄭州 450001)

0 引言

DNA是生物遺傳信息的載體，而腺嘌呤(A)、鳥(niǎo)嘌呤(G)、胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)四種DNA堿基則是DNA的基本組成部分，在基因的表達(dá)和復(fù)制過(guò)程中扮演著重要角色.由于DNA堿基分子溶解度很低且散射截面較小，因此采用常規(guī)拉曼散射方法很難對(duì)其進(jìn)行高靈敏度檢測(cè)、分析和研究.表面增強(qiáng)拉曼散射(SERS)技術(shù)為低濃度生物分子的檢測(cè)開(kāi)辟了一個(gè)新的方向.在過(guò)去十余年中，有關(guān)生物分子SERS探測(cè)的研究被廣泛報(bào)道，涉及的生物分子探測(cè)種類已經(jīng)包括核苷酸分子、蛋白質(zhì)、酶、DNA或RNA堿基等.通過(guò)對(duì)生物分子的SERS光譜進(jìn)行分析，可以獲得目標(biāo)探測(cè)分子的大量信息，如分子的吸附取向、原子或功能基團(tuán)的吸附行為、分子吸附于金屬表面時(shí)的結(jié)構(gòu)變化以及不同分子的共吸附狀態(tài)等.SERS檢測(cè)具有非常高的靈敏度，可實(shí)現(xiàn)對(duì)低濃度DNA堿基的有效探測(cè)，甚至可實(shí)現(xiàn)單分子檢測(cè).因此，通過(guò)對(duì)DNA堿基的檢測(cè)和吸附行為的研究，有可能進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)對(duì)DNA分子的直接檢測(cè)，并有望在未來(lái)用于對(duì)DNA的快速測(cè)序，因而具有重要的基礎(chǔ)研究?jī)r(jià)值和應(yīng)用前景.

在SERS探測(cè)中，目前最常用的活性基底是Ag的膠體和粗糙電極，二者通常采用化學(xué)液相法或電化學(xué)方法進(jìn)行制備.由于膠體粒子易于團(tuán)聚，而粗糙電極難于實(shí)現(xiàn)表面形貌和微觀結(jié)構(gòu)的大面積均勻性.因此，以其作為活性基底進(jìn)行SERS探測(cè)時(shí)，測(cè)量的穩(wěn)定性和重復(fù)性均不夠理想.為改變這一狀況，人們往往通過(guò)優(yōu)化制備工藝或采用模板法制備顆粒均勻的金屬納米體系加以補(bǔ)償.文獻(xiàn)[1-2]采用水熱腐蝕技術(shù)制備了一種硅的層次結(jié)構(gòu)，即硅納米孔柱陣列(Si-NPA).以Si-NPA作為襯底，采用簡(jiǎn)單的浸漬還原技術(shù)，在Si-NPA上制備了圖案化的Ag納米結(jié)構(gòu)陣列.在此基礎(chǔ)上，文獻(xiàn)[3-4]以Ag/Si-NPA為活性基底，對(duì)低濃度的DNA堿基腺嘌呤和熒光生物指示劑羅丹明6G(R6G)進(jìn)行了SERS檢測(cè).結(jié)果表明，Ag/Si-NPA是一種性能優(yōu)異的SERS活性基底，具有靈敏度高、穩(wěn)定性和可重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn).

本文以Ag/Si-NPA為活性基底，對(duì)腺嘌呤之外的其他三種DNA堿基(鳥(niǎo)嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶)在活性基底上的吸附行為和SERS增強(qiáng)效應(yīng)進(jìn)行研究.結(jié)果表明，Ag/Si-NPA能夠?qū)NA堿基實(shí)現(xiàn)低濃度檢測(cè)，對(duì)低濃度生物分子進(jìn)行高靈敏度SERS檢測(cè)具有很好的潛力.

1 實(shí)驗(yàn)方法

Si-NPA采用水熱腐蝕法制備，其具體制備過(guò)程和結(jié)構(gòu)表征見(jiàn)文獻(xiàn)[1-2].制備完成后，將Si-NPA置于空氣中20 h，通過(guò)自然氧化過(guò)程以改變Si-NPA的表面鈍化狀態(tài)，進(jìn)而控制Ag納米顆粒的沉積量和平均尺寸.隨后，將經(jīng)過(guò)自然氧化的Si-NPA在提前配制的濃度為0.01 mol/L的AgNO3溶液中浸漬沉積3 min，用去離子水充分清洗后在空氣中自然晾干，得到Ag/Si-NPA活性基底[3].

配制具有不同濃度的鳥(niǎo)嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶的水溶液用于SERS檢測(cè).首先，將Ag/Si-NPA活性基底在0.1 mol/L的KCl溶液中預(yù)處理20 min，以去除Ag/Si-NPA表面可能吸附的雜質(zhì)，而后用去離子水充分清洗干凈.用微量進(jìn)樣器取4 μL配制好的堿基溶液滴于半干的Ag/Si-NPA表面，室溫下自然干燥后進(jìn)行SERS探測(cè).

Ag/Si-NPA的結(jié)構(gòu)、成分和表面形貌分別通過(guò)X射線衍射儀(Rigaku D/MAX-3B)和場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡(JEOL JSM-6700F)進(jìn)行表征.SERS光譜由顯微拉曼光譜儀(Renishaw，RM2000)測(cè)得，激發(fā)波長(zhǎng)為633 nm，光斑直徑為1 μm，樣品表面照射功率為0.3 mW，設(shè)備波數(shù)分辨率為1.5 cm-1，光譜收集時(shí)間均設(shè)定為10 s.

圖1 Ag/Si-NPA的X射線衍射圖Fig.1 The XRD pattern of Ag/Si-NPA

2 結(jié)果與討論

2.1 Ag/Si-NPA的結(jié)構(gòu)成分與形貌表征

圖1給出了Ag/Si-NPA的X射線衍射圖.圖中觀察到5個(gè)衍射峰，分別位于38.10°、 44.30°、64.40°、77.40°和81.60°.通過(guò)與Ag的標(biāo)準(zhǔn)XRD圖譜進(jìn)行比對(duì)可以確定，5個(gè)衍射峰分別對(duì)應(yīng)于來(lái)自面心立方結(jié)構(gòu)Ag晶體不同晶面族的衍射，表明通過(guò)浸漬沉積法成功實(shí)現(xiàn)了金屬Ag在Si-NPA上的沉積生長(zhǎng).

通過(guò)掃描電鏡得到Si-NPA和Ag/Si-NPA的表面形貌如圖2所示.圖2(a)給出了Si-NPA的表面形貌，可以觀察到由近似等同、分離完好且垂直于樣品表面規(guī)則排列的火山口狀結(jié)構(gòu)組成的陣列.根據(jù)文獻(xiàn)[5]的研究結(jié)果，所觀察到的火山口狀結(jié)構(gòu)為微米尺度的、高度多孔化的硅柱，孔的平均直徑約為40 nm，孔壁由包裹二氧化硅的硅納米晶粒組成，平均粒徑約為3.4 nm.圖2(b)為Ag/Si-NPA的表面形貌.可以看出，通過(guò)浸漬沉積在Si-NPA表面形成了兩種Ag的結(jié)構(gòu)：一種是連續(xù)覆蓋于Si-NPA表面的Ag納米晶粒；另一種則是亞微米量級(jí)較大的Ag顆粒.后者存在于硅柱之間的谷底，相互連接形成一種手鏈結(jié)構(gòu).根據(jù)文獻(xiàn)[4]的表征結(jié)果，Ag納米晶粒和較大顆粒的平均尺寸分別約為47.9 nm和587 nm，對(duì)于DNA堿基的SERS探測(cè)具有較好的效果.

圖2 Si-NPA和Ag/Si-NPA的表面形貌Fig.2 Surface morphologies of Si-NPA and Ag/Si-NPA

2.2 鳥(niǎo)嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶的SERS探測(cè)

2.2.1鳥(niǎo)嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶的分子結(jié)構(gòu) 鳥(niǎo)嘌呤為嘌呤類的有機(jī)化合物，其分子結(jié)構(gòu)為由碳原子和氮原子組成的具有特征性的雙環(huán)結(jié)構(gòu)，在C2位帶有一個(gè)氨基，C6位與氧原子形成羰基.胞嘧啶則是一種嘧啶堿基，與鳥(niǎo)嘌呤的雙環(huán)結(jié)構(gòu)不同，其分子僅由一個(gè)六元環(huán)組成，在C4位帶有一個(gè)氨基，C3位與氧原子形成羰基.胸腺嘧啶為組成DNA的另一種嘧啶堿基，和胞嘧啶的結(jié)構(gòu)相似，也是僅由一個(gè)六元環(huán)構(gòu)成，在C5位帶有一個(gè)甲基，C2和C4位與氧原子形成羰基.

2.2.2鳥(niǎo)嘌呤的SERS探測(cè) 圖3為不同濃度鳥(niǎo)嘌呤溶液吸附于Ag/Si-NPA的SERS光譜.圖3(a)給出了鳥(niǎo)嘌呤固體粉末的常規(guī)拉曼光譜作為參比，圖3(b)和圖3(c)分別為濃度為10-5mol/L、10-6mol/L的鳥(niǎo)嘌呤溶液吸附于Ag/Si-NPA的SERS光譜.可以看出，所測(cè)得的SERS光譜與常規(guī)拉曼光譜的譜結(jié)構(gòu)基本一致，表明采用SERS光譜技術(shù)可以對(duì)低濃度鳥(niǎo)嘌呤溶液進(jìn)行有效探測(cè).

根據(jù)SERS表面選擇定則[7]，垂直于金屬表面的拉曼振動(dòng)模式將會(huì)得到顯著增強(qiáng)，而平行于金屬表面的拉曼振動(dòng)模式則增強(qiáng)效果較弱.在SERS光譜中觀察到強(qiáng)度明顯增加的、對(duì)應(yīng)于面內(nèi)振動(dòng)模式的拉曼峰，說(shuō)明鳥(niǎo)嘌呤分子吸附取向應(yīng)為垂直于Ag顆粒表面；而位于380 cm-1的拉曼峰經(jīng)比對(duì)，指認(rèn)為來(lái)自于C2N3C4C5和N7C8N9C4的環(huán)面扭轉(zhuǎn)振動(dòng)，表明鳥(niǎo)嘌呤分子并非完全地垂直吸附于基底表面，而是略有傾斜.

(a)鳥(niǎo)嘌呤固體粉末;(b) 10-5 mol/L鳥(niǎo)嘌呤溶液; (c) 10-6 mol/L鳥(niǎo)嘌呤溶液圖3 不同濃度鳥(niǎo)嘌呤溶液吸附于Ag/Si-NPA的SERS光譜Fig.3 The SERS spectra of guanine solutions with different concentrations adsorbed on Ag/Si-NPA

圖4(c)為鳥(niǎo)嘌呤溶液濃度降低至10-6mol/L時(shí)的SERS光譜.可以看出，隨著鳥(niǎo)嘌呤溶液濃度的降低，SERS光譜的強(qiáng)度降低，但其峰形和峰位未發(fā)生明顯變化.值得注意的是，歸屬于環(huán)呼吸振動(dòng)模式的拉曼峰的相對(duì)強(qiáng)度降低，表明隨著溶液濃度的降低，鳥(niǎo)嘌呤更趨向于平行吸附于基底表面.

(a) 胞嘧啶固體粉末;(b) 10-2 mol/L胞嘧啶溶液; (c) 10-6 mol/L胞嘧啶溶液圖4 不同濃度胞嘧啶溶液吸附于Ag/Si-NPA的SERS光譜Fig.4 The SERS spectra of cytosine solutions with different concentrations adsorbed on Ag/Si-NPA

圖4(c)為胞嘧啶溶液濃度降低至10-6mol/L時(shí)的SERS光譜.可以看出，隨著胞嘧啶溶液濃度的降低，環(huán)呼吸振動(dòng)模式對(duì)應(yīng)的拉曼峰的相對(duì)強(qiáng)度降低.另外，較低濃度時(shí)在972 cm-1處出現(xiàn)了歸屬于面外搖擺振動(dòng)的峰，表明當(dāng)溶液濃度降低時(shí)，胞嘧啶分子的吸附角度將會(huì)有所傾斜.

2.2.4胸腺嘧啶的SERS探測(cè) 圖5為不同濃度胸腺嘧啶溶液吸附于Ag/Si-NPA的SERS光譜.圖5(a)給出了作為參比的胸腺嘧啶固體粉末的常規(guī)拉曼光譜，圖5(b)和圖5(c)則分別對(duì)應(yīng)于濃度為10-2mol/L、10-6mol/L 的胸腺嘧啶溶液吸附于Ag/Si-NPA的SERS光譜.根據(jù)文獻(xiàn)[11-12]的理論計(jì)算結(jié)果，對(duì)SERS光譜中出現(xiàn)的主要拉曼峰進(jìn)行了指認(rèn).與鳥(niǎo)嘌呤和胞嘧啶不同，胸腺嘧啶的環(huán)呼吸振動(dòng)模式對(duì)應(yīng)的拉曼峰位有較大的頻移，由740 cm-1頻移至781 cm-1.文獻(xiàn)[13]研究結(jié)果表明，與環(huán)有關(guān)的振動(dòng)頻移歸因于金屬表面與π鍵之間的相互作用.因此，環(huán)呼吸振動(dòng)較大的頻移表明胸腺嘧啶的嘧啶環(huán)與Ag顆粒之間存在著一定的相互作用.

(a) 胸腺嘧啶固體粉末;(b) 10-2 mol/L胸腺嘧啶溶液; (c) 10-6 mol/L胸腺嘧啶溶液圖5 不同濃度胸腺嘧啶溶液吸附于Ag/Si-NPA的SERS光譜Fig.5 The SERS spectra of thymine solutions with different concentrations adsorbed on Ag/Si-NPA

通過(guò)對(duì)比不同濃度胸腺嘧啶溶液的SERS光譜，可以看出，隨著胸腺嘧啶溶液濃度的降低，環(huán)呼吸振動(dòng)峰的強(qiáng)度下降，表明隨著溶液濃度的降低，胸腺嘧啶分子的吸附角度將會(huì)有所傾斜.

2.3 DNA堿基SERS探測(cè)的普遍規(guī)律

通過(guò)以上分析可以看出，吸附于Ag/Si-NPA表面的堿基在SERS探測(cè)中有幾個(gè)普遍的規(guī)律.鳥(niǎo)嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶吸附于Ag/Si-NPA活性基底后，雖然收集到的SERS光譜中大多數(shù)拉曼峰位都有明顯的頻移，但光譜結(jié)構(gòu)與其固體粉末的常規(guī)拉曼光譜相比表現(xiàn)出明顯的一致性.在SERS光譜中最強(qiáng)的拉曼峰雖然峰位頻移略有不同，但均歸屬于面內(nèi)環(huán)呼吸振動(dòng)，鳥(niǎo)嘌呤和胞嘧啶拉曼峰的頻移較小，胸腺嘧啶的峰位頻移較大，與環(huán)有關(guān)的振動(dòng)頻移歸因于金屬表面與π鍵之間的相互作用.因此，環(huán)呼吸振動(dòng)拉曼峰的頻移表明三種堿基均是略有傾斜地吸附于基底表面，與胞嘧啶和鳥(niǎo)嘌呤相比，胸腺嘧啶的傾斜角度更小.

圖6 鳥(niǎo)嘌呤(G)、胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)的幾何結(jié)構(gòu)以及吸附于Ag/Si-NPA上最可能的空間結(jié)構(gòu)和取向Fig.6 The geometric construction of guanine(G), cytosine(C), thymine(T), and the most probable space configuration and orientation of the molecules adsorbed on Ag/Si-NPA

3 結(jié)論

通過(guò)SERS的方法研究了三種DNA堿基(鳥(niǎo)嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶)在低濃度時(shí)的吸附行為.以Ag/Si-NPA為SERS的活性基底，對(duì)不同濃度的DNA堿基進(jìn)行了SERS探測(cè)，并與堿基固體粉末的常規(guī)拉曼光譜進(jìn)行了對(duì)比分析.通過(guò)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，三種DNA堿基均是略微傾斜地吸附于基底表面，但傾斜角度不同，胸腺嘧啶的傾斜角度要小于鳥(niǎo)嘌呤和胞嘧啶的傾斜角度.不同堿基的吸附位點(diǎn)相似，都是通過(guò)羰基和氮原子吸附于Ag原子表面.另外，隨著溶液濃度的降低，堿基分子更趨向平行吸附于基底表面.研究結(jié)果表明，Ag/Si-NPA是一種具有潛力的SERS活性基底，可實(shí)現(xiàn)對(duì)低濃度生物分子的探測(cè)，有望應(yīng)用于DNA快速測(cè)序工程.