孫夢玲，王彬，陳友明，薛暉

（江蘇省淡水水產研究所，江蘇 南京 210017）

克氏原螯蝦（Procambarus clarkii）俗稱小龍蝦，屬節(jié)肢動物門（Arthropoda），甲殼綱（Crstacea），十足目（Decapoda），是目前我國養(yǎng)殖最廣的淡水螯蝦品種[1]，在我國長江中下游地區(qū)廣泛養(yǎng)殖，其肉質鮮美，營養(yǎng)豐富，深受消費者的青睞。2017年江蘇省小龍蝦養(yǎng)殖面積約1 400 000×667 m2，總產值達450億元，在產業(yè)不斷發(fā)展壯大的同時，病害的發(fā)生成為了阻礙其發(fā)展的重要原因之一。

白斑綜合征病毒（white spot syndrome virus，WSSV）是一種具有囊膜的桿狀病毒[2]，地理分布廣、流行范圍大、傳染性強、發(fā)病時間短，目前尚無有效的藥物能夠控制疫情，是中國明對蝦（Fenneropenaeus chinensis）、凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）、擬穴青蟹（Scylla paramamosain）養(yǎng)殖中的主要病原[3-4]。研究表明WSSV具有廣泛的宿主，可以感染甲殼綱十足目的大部分動物[4]。近年來發(fā)現(xiàn)在克氏原螯蝦養(yǎng)殖中也廣泛流行，給克氏原螯蝦養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失[5]。

1 材料與方法

該次調查共選取金湖、泗洪、盱眙、高淳、武進、及揚中為病害監(jiān)測點及樣品采集點，各測報點定期匯報最新病情，同時實地走訪發(fā)病塘口，了解發(fā)病歷史、發(fā)病季節(jié)及發(fā)病癥狀。在每個采集點隨機選取養(yǎng)殖戶5戶進行樣品采集，采樣時間為2018年4月至2018年6月，每月采集樣本1次，每批次每個養(yǎng)殖戶塘口隨機選取克氏原螯蝦10只，將活體置于保溫箱內帶回實驗室。在實驗室內，直接取活體鰓組織約100 mg，用于PCR檢測，剩余部分收集于eppendorf管內并編號后置于-80℃冰箱儲存。

Takara universial genomic DNA抽提試劑盒購于南京浩嘉生物醫(yī)藥有限公司，PCR反應Mix購于南京唯贊生物科技，100 bp DNA ladder購于南京唯贊生物科技，PCR儀為Biometra T-Gradient Thermoblock，電泳儀及凝膠成像儀為BIO-RAD，恒溫金屬浴為Bioer CHB-202，冷凍離心機為Eppendorf 5417R。

將活體取出的鰓組織混合后剪碎并稱取0.05 g組織，參照組織DNA提取試劑盒說明書進行組織DNA提取。

檢測方法采用江蘇省水生動物疫病預防控制中心的對蝦白斑綜合病毒檢驗方法。槽式PCR引物分別為：槽式第一步引物：146F1:5'-ACT ACT AAC TTC AGC CTA TCT AG-3'146R1:5'-TAA TGC GGG TGT AATGTTCTT ACG A-3’擴增1 447 bp的片段，槽式第二步引物146F2:5'-GTA ACT GCCCCT TCC ATC TCC A-3’146R2:5'-TAC GGC AGC TGC TGC ACC TTG T-3'擴增上述片段中的941 bp片段，內參PCR引物：146F3:5'-TGC CTT ATC AGC TNT CGA TTG TAG-3'146R3:5'-TTC AGNTTT GCA ACC ATACTT CCC-3'擴增十足類動物DNA中848 bp片段。檢測反應體系統(tǒng)一為：Q2F（10 mM）1 uL，Q2R（10 mM）1 uL，模板 DNA 5 uL，PCR mix 25 uL，ddH2O 18 uL，總反應體積為25 uL。PCR反應條件為：94℃預變性4 min；94℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸2 min，進行30個循環(huán)；72℃充分延伸10 min，后4℃保存待檢測。

取PCR反應產物5 uL進行瓊脂糖凝膠電泳，瓊脂糖凝膠含量為1%（提前加入核酸染料 Gold View），電壓120 V，電泳時間為35 min，電泳結束后將凝膠置于紫外燈下觀察PCR擴增結果。

2 結果

不同時期不同養(yǎng)殖區(qū)的克氏原螯蝦WSSV檢出率見表1，金湖和泗洪兩地的在4、5、6三個月內均有WSSV檢出，并且在5月檢出率最高，泗洪達32%，金湖達24%，高淳及武進兩地檢出率較低，僅在5月有檢出，數(shù)據(jù)分別為4%及8%，且所采集養(yǎng)殖戶塘口小龍蝦并未發(fā)病。揚中克氏原螯蝦WSSV在采樣階段有持續(xù)檢出，但較蘇北地區(qū)檢出率低。

表1 不同時期克氏原螯蝦WSSV檢出率

3 討論

WSSV被世界動物衛(wèi)生組織（OIE）列為需向OIE申報的疾病，在對蝦中發(fā)生時病死率高，死亡快，克氏原螯蝦在感染W(wǎng)SSV后發(fā)病較對蝦慢，病死率也較對蝦低，因此曾作為病例研究的模式生物。近年來隨著克氏原螯蝦產業(yè)的迅猛發(fā)展，苗種與產品流通空間的擴展，使WSSV在克氏原螯蝦中傳播迅速，加之養(yǎng)殖戶許多不科學的養(yǎng)殖手段及部分養(yǎng)殖戶為克氏原螯蝦提供的生長環(huán)境較差，由白斑病引起的死亡造成損失較大。該次流行病學調查選取蘇南及蘇北各3個養(yǎng)殖區(qū)，采集時間覆蓋克氏原螯蝦生長及上市交易的主要時段，對江蘇省內的WSSV覆蓋及發(fā)生情況進行了初步了解。WSSV的傳播是受溫度影響的，這一點從檢測結果中得到印證，在5月，氣溫達到25℃以上，WSSV的檢出率明顯提高，并且開始發(fā)生死亡，4月溫度相對較低，檢出率也低，到6月時，溫度升高，最高溫度可達到30℃，同時池塘內龍蝦因前期售賣捕撈的原因，密度大大降低，控制WSSV的傳播與發(fā)生。就養(yǎng)殖區(qū)域看，蘇北地區(qū)克氏原螯蝦養(yǎng)殖面積廣，產量高，流通量大，因此在相應時段WSSV的檢出率要高于蘇南地區(qū)。溫度是影響病害發(fā)生的重要因素，因此在生產養(yǎng)殖中，做好高溫來臨前的防治工作十分必要，可以提前補充免疫增強劑，增強抗應激能力。高密度大范圍的養(yǎng)殖不可避免得會發(fā)生病害，因此控制養(yǎng)殖環(huán)境，做好苗種檢疫，不用發(fā)病塘口的親蝦及種蝦，加強親本及苗種的檢驗檢疫，建立SPF親本保護及苗種繁育基地，從源頭切斷WSSV的發(fā)生。