殷悅，徐宇，唐劉秀，陸全平，許志強

（江蘇省淡水水產(chǎn)研究所，江蘇 南京 210017）

中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）俗稱河蟹，是我國最重要的淡水養(yǎng)殖品種之一。性早熟是當前影響河蟹養(yǎng)殖效益的瓶頸問題之一，性早熟幼蟹在培育過程中性腺當年發(fā)育成熟，不能繼續(xù)順利蛻殼，體質(zhì)量增長緩慢甚至停滯，絕大多數(shù)在第2年4—5月期間死亡，不能再繼續(xù)飼養(yǎng)至2齡成蟹規(guī)格[1]。此外，由于性早熟一齡蟹的大量存在，在蟹種培育階段還導(dǎo)致了飼料的巨大浪費，嚴重影響了河蟹養(yǎng)殖效益。河蟹養(yǎng)殖過程中發(fā)現(xiàn)，即使在相同的外在環(huán)境條件下，也只有部分個體發(fā)生性早熟。這一現(xiàn)象表明，除了外部環(huán)境因素外，個體內(nèi)在的遺傳因素同樣會影響河蟹性早熟的發(fā)生[2-4]。甲殼動物眼柄內(nèi)的X-器官-竇腺復(fù)合體是其神經(jīng)內(nèi)分泌的主要調(diào)控中心，與蛻皮、生殖以及血糖代謝等生理功能密切相關(guān)[5]。目前，在河蟹以外的多種甲殼動物的X-器官-竇腺復(fù)合體中已分離和鑒定出了高血糖激素家族激素（主要有GIH、MIH、CHH和MOIH等）以及促色素細胞激素家族激素（主要有RPCH和PDH等）等多種神經(jīng)肽類激素，這些激素均以顆粒的形式在竇腺中儲存和釋放，調(diào)控著甲殼動物的蛻皮、生殖、血糖代謝及其對環(huán)境的適應(yīng)等生理功能。蛻皮抑制激素基因（MIH）是由眼柄的神經(jīng)內(nèi)分泌細胞分泌的一種多肽神經(jīng)激素，MIH不僅在協(xié)調(diào)蛻殼方面發(fā)揮了內(nèi)分泌調(diào)節(jié)器的作用，而且在卵黃生成過程中也發(fā)揮著重要的生物學(xué)功能[6-10]。

該研究以河蟹蛻皮抑制激素基因（MIH）編碼區(qū)序列上的SNPs為研究目標，采用PCR產(chǎn)物直接測序和PCR-RFLP技術(shù)相結(jié)合的方法對蟹種群體（正常群體及性早熟群體）進行基因分型，發(fā)現(xiàn)位于MIH基因內(nèi)含子區(qū)一個SNP位點（SNPg.2466 C＞T）與中華絨螯蟹的性早熟之間存在較具統(tǒng)計學(xué)意義的相關(guān)性（OR=0.459，95%CI 0.223～0.944，P=0.034），該研究可為后續(xù)選育低性早熟河蟹新品種提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象

蟹種培育在江蘇省淡水水產(chǎn)研究所江浦基地進行，每667 m2放養(yǎng)1.5 kg大眼幼體，采用江蘇地區(qū)常規(guī)養(yǎng)殖方式進行蟹種培育。翌年3月從同一養(yǎng)殖池塘內(nèi)隨機采集性早熟蟹和正常扣蟹樣本各100只以上（雌雄各半），樣品活體運輸至實驗室后取附肢肌肉于-20℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 基因分型

1.2.1 SNPs所在序列的PCR擴增 隨機挑選30只蟹種并提取每個樣本的基因組DNA，根據(jù)中華絨螯蟹MIH基因序列信息（AY310313）設(shè)計引物擴增外顯子區(qū)和內(nèi)含子區(qū)（3個外顯子及2個內(nèi)含子），采用PCR產(chǎn)物直接測序篩選區(qū)段的SNP位點（引物未列出）。根據(jù)得到的SNPs信息，分別設(shè)計引物擴增包含不同SNP位點的序列片段（表1）。PCR反應(yīng)體系為 25 μL（Vazyme Biotech Co.,Ltd），其中包括 2×Taq Master Mix 12.5 μL，dNTP（2.5 mM）1 μL，正反向引物（10μM）各1μL，ddH2O補足體積至25μL。PCR反應(yīng)共計30個循環(huán)，循環(huán)前94℃預(yù)變性5 min，每個循環(huán)包括94℃變性30 s，退火30 s，72℃延伸1 min，循環(huán)結(jié)束后于72℃延伸5 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后于-20℃保存，用于后續(xù)酶切反應(yīng)。

1.2.2 基因分型 內(nèi)含子區(qū)2的SNPs分布較為集中，采用PCR產(chǎn)物直接測序法對該區(qū)域內(nèi)的6個SNPs進行基因分型，采用PCR-RFLP對剩余SNPs進行基因分型。PCR產(chǎn)物酶切過夜后用3%瓊脂糖凝膠電泳進行分離以確定每個樣本的基因型，隨機挑選個體采用PCR產(chǎn)物直接測序法對基因分型結(jié)果作進一步驗證。

表1 中華絨螯蟹MIH基因編碼區(qū)SNPs基因分型所用引物及限制性內(nèi)切酶

1.3 統(tǒng)計分析

對性早熟和正常發(fā)育蟹種群體進行單個位點的性狀-基因型關(guān)聯(lián)分析（基于共顯性模型和相加模型的Logistic回歸分析），并計算相對應(yīng)的相應(yīng)P值及比值比（Odds Ratio,OR）及其95%可信區(qū)間（confidence interval,CI），篩查與中華絨螯蟹性早熟性狀具有統(tǒng)計學(xué)意義相關(guān)性的SNP位點。

2 結(jié)果與分析

對隨機選擇的30個正常蟹種的MIH基因（外顯子區(qū)及內(nèi)含子區(qū)）進行SNPs篩查，共鑒定出10個SNPs（表1）。其中，外顯子區(qū)共檢測到3個SNPs（SNP g.422 C＞T，SNP g.1714 A＞C，SNP g.2529 C＞T），內(nèi)含子區(qū)共檢測到7個SNPs（SNP g.2384 C＞A，SNP g.2387 A＞G，SNP g.2410 C＞A，SNP g.2415 T＞C，SNP g.2416 T＞C，SNP g.2430 T＞C，SNP g.2466 C＞T）。

對10個SNP位點在所有樣本中的基因型分布情況進行基因分型，各個SNP位點不同基因型個體的數(shù)量以及不同基因型個體間的差異統(tǒng)計學(xué)意義分析結(jié)果見表2。性狀-基因型關(guān)聯(lián)分析結(jié)果顯示：位于MIH基因內(nèi)含子2的一個SNP位點（SNP g.2466 C＞T）與河蟹性早熟之間存在著具統(tǒng)計學(xué)意義的相關(guān)性（OR=0.459,95%CI 0.223～0.944,P=0.034）。SNP g.2466 C＞T的PCR-RFLP基因分型圖譜以及PCR產(chǎn)物直接測序驗證圖譜見圖1。

3 討論

MIH作為甲殼動物高血糖激素（CHH）家族的一員，是一種由XO-SG中的神經(jīng)內(nèi)分泌細胞分泌的多肽神經(jīng)激素，它對甲殼動物的生長發(fā)育起著至關(guān)重要的作用。由于不正常的蛻皮現(xiàn)象在性早熟河蟹中廣泛存在，因此可以推測MIH基因變異可能與中華絨螯蟹的性早熟有關(guān)。之前的有關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，在多數(shù)甲殼動物中，MIH基因的變異被認為是影響生長和繁殖性能的主要內(nèi)在因素[11-12]。目前，已有研究者從一些甲殼動物如中華絨螯蟹（Eriocheir sinenis）、斑節(jié)對蝦（Penaeus monodon）和南美白對蝦（Litopenaeus vannamei）的MIH基因中鑒定篩選出SNPs位點[13-14]。該試驗室在中華絨螯蟹MIH基因中發(fā)現(xiàn)了一個與性早熟具統(tǒng)計學(xué)意義相關(guān)的SNP。Li等[15]在南美白對蝦MIH基因中發(fā)現(xiàn)了一個與生長性狀具統(tǒng)計學(xué)意義相關(guān)的SNPs A＞G 171。

表2 中華絨螯蟹MIH基因編碼區(qū)10個SNPs的基本信息及其在性早熟與正常河蟹群體中的分布情況

表3 SNPg.2466 C＞T與中華絨螯蟹性早熟的關(guān)聯(lián)性分析

圖1 SNPg.2466 C＞T PCR-RFLP基因分型及測序驗證注：（A）SNP C2466C 基因型模式（3%瓊脂糖凝膠電泳）：CT（泳道 2），CT（泳道 3），CC（泳道 4）和 TT（泳道 5）。（B）MIH SNP C2466C基因型的測序驗證結(jié)果。

近年來，已有許多國內(nèi)外學(xué)者開始關(guān)注SNP變異與水產(chǎn)動物重要經(jīng)濟性狀之間的相關(guān)性研究。Li X等從加州鱸（Micropterus salmoides）的IGF-Ⅱ基因中共鑒定出4個SNPs，發(fā)現(xiàn)特定的SNP單倍型（CTCC/CGCC和CTCC/TTTT））與加州鱸生長性狀之間存在著具統(tǒng)計學(xué)意義的相關(guān)性（P＜0.05）[16]。Wang GL.等從三角帆蚌（Hyriopsis cumingii）的 SOD3基因中鑒定出了18個SNPs，發(fā)現(xiàn)有2個SNP變異（g.7994C＞G和g.8087G＞C）與三角帆蚌對嗜水氣單胞菌的抗性性狀之間存在具統(tǒng)計學(xué)意義的相關(guān)性 （P＜0.05）[17]。Fu GH 等從亞洲鱸魚（Asian seabass）的LECT2基因上發(fā)現(xiàn)了3個SNPs，但是未發(fā)現(xiàn)這些SNPs與Big belly disease疾病抗性之間存在具統(tǒng)計學(xué)意義的相關(guān)性[18]。目前，與其他水產(chǎn)物種相比，國內(nèi)外關(guān)于河蟹遺傳變異與某些重要生物學(xué)性狀之間的相關(guān)性研究較少。該研究發(fā)現(xiàn)位于MIH基因內(nèi)含子區(qū)一個SNP位點（SNPg.2466 C＞T）與中華絨螯蟹的性早熟之間存在具統(tǒng)計學(xué)意義的相關(guān)性（OR=0.459,95%CI 0.223～0.944,P=0.034）。在以低性早熟為選育指標的河蟹遺傳育種研究過程中，通過對河蟹育種群體進行SNP g.2466 C＞T基因分型，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征分析，可以優(yōu)先選擇基因型為TT的個體作為育種親本，該研究對于后續(xù)選育大規(guī)格河蟹新品種具有重要的指導(dǎo)意義。