毛良浩 綜述，李大鵬，江 攀 審校

(江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院骨科，江蘇鎮(zhèn)江 212001)

骨肉瘤(osteosarcoma)是最常見的原發(fā)性惡性骨腫瘤，好發(fā)于生長活躍的股骨遠端和肱骨近端的干骺端[1]，耐藥、復(fù)發(fā)和高轉(zhuǎn)移率是治療骨肉瘤難點所在。 自從20世紀(jì)80年代早期引入全身化療方案以來，骨肉瘤的預(yù)后改善基本停滯，伴有遠處轉(zhuǎn)移尤其是肺轉(zhuǎn)移的骨肉瘤患者5年生存率無法進一步提高[2-3]。

研究發(fā)現(xiàn)，cGMP依賴性蛋白激酶Ⅱ(cGMP dependent protein kinase，PKGⅡ)與多種腫瘤關(guān)系密切，其可抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤、前列腺間質(zhì)癌、乳腺癌、胃癌及人結(jié)直腸癌細胞的增殖和遷移，促進腫瘤細胞凋亡[4-8]。體外研究發(fā)現(xiàn)，高表達PKGⅡ能夠明顯抑制MG-63人骨肉瘤細胞增殖，表現(xiàn)出抗腫瘤特性[9]。因此，PKGⅡ有望成為骨肉瘤等惡性腫瘤治療的潛在靶點，其中PKGⅡ通過表皮生長因子(EGF)/表皮生長因子受體(EGFR)通路在骨肉瘤發(fā)生、發(fā)展中的研究逐漸成為焦點，本文將綜述PKGⅡ阻斷EGF/EGFR通路在骨肉瘤中的研究現(xiàn)狀，為PKGⅡ靶向聯(lián)合治療骨肉瘤提供理論依據(jù)。

1 PKGⅡ

1.1結(jié)構(gòu)及表達 PKG屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶家族，已被發(fā)現(xiàn)將近50年，然而其調(diào)控細胞生長和凋亡方面功能近些年才被人們揭示。PKG擁有3種不同亞型，包括PKGⅠα、PKGⅠβ和PKGⅡ，廣泛分布于哺乳動物細胞中，其中PKGⅡ是一種在真核細胞中發(fā)現(xiàn)的膜結(jié)合酶，廣泛分布于腦、腎、軟骨和腸道中。研究發(fā)現(xiàn)，PKGⅡ在腫瘤中的表達水平明顯低于正常組織，表明PKGⅡ可能是一種潛在的抗癌因子[10]。

1.2活化與功能 PKGⅡ的活化依賴于環(huán)磷酸鳥嘌呤核苷激活，進而才能夠作用于特定的下游底物， 發(fā)揮在腸道分泌、骨骼生長、腎素分泌、學(xué)習(xí)記憶等方面的作用。 近來有研究表明， PKGⅡ激活劑8-pCPT-cGMP是通過高選擇性地與A位點具有更大的β5/β6口袋結(jié)構(gòu)的PKGⅡ結(jié)合進而發(fā)揮相應(yīng)功能[11]。此外，PKGⅡ可阻斷EGF/EGFR通路，從而抑制其下游絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)/細胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)和磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)介導(dǎo)的致癌作用。

2 EGFR

EGFR是由原癌基因表達的跨膜糖蛋白。家族包括EGFR、C-erB-2(HER-2)、C-erB-3(HER-3)、C-erB-4(HER-4)，均位于細胞膜上。研究發(fā)現(xiàn)，EGFR的過表達和突變與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切，而PKGⅡ?qū)GFR的活化表達具有抑制作用，發(fā)揮潛在抗癌作用[12]。

EGFR作為一種酪氨酸激酶，通過作用于下游相關(guān)信號通路，發(fā)揮調(diào)節(jié)細胞增殖遷移、侵襲和凋亡等功能[13]。野生型的EGFR通過與配體表皮生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子α等因子結(jié)合而被激活，誘導(dǎo)多種基因表達。EGFR參與腫瘤細胞增殖、黏附、血管形成、轉(zhuǎn)移等過程，在多種腫瘤如結(jié)腸癌、肺癌、乳腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤中高水平表達，目前已成為靶向抗腫瘤研究中最受關(guān)注的靶點之一。研究發(fā)現(xiàn)，骨肉瘤中EGFR的表達水平與其惡性程度有關(guān)，提示EGFR可能參與骨肉瘤的發(fā)病機制，可作為預(yù)后指標(biāo)[14]。

3 PKGⅡ阻斷EGF/EGFR通路在骨肉瘤中的生物學(xué)作用

3.1抑制骨肉瘤細胞的增殖、遷移 體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，骨肉瘤組織中EGFR陽性率與其生物學(xué)行為密切相關(guān)，提示 EGFR可能具有刺激介導(dǎo)腫瘤形成和進展的關(guān)鍵特性，它在腫瘤增殖和遷移中起重要作用[14]。其他研究發(fā)現(xiàn)EGFR及其配體參與激活PI3K/AKT通路及一種致癌轉(zhuǎn)化關(guān)鍵分子雷帕霉素靶蛋白(mTOR)，促進腫瘤細胞的生長和增殖，而增加PKGⅡ表達水平，可間接抑制EGFR，從而抑制骨肉瘤細胞的增殖[15-16]。體外實驗表明，EGFR可以刺激ERK、AKT磷酸化，促進MG-63細胞的增殖和遷移。 而經(jīng)過M8-pCPT-cGMP刺激活化的PKGⅡ能夠明顯抑制EGFR的活化和骨肉瘤細胞增殖、遷移及相關(guān)信號級聯(lián)反應(yīng)[9]。以上研究表明，PKGⅡ阻斷EGF/EGFR通路在抑制骨肉瘤細胞的增殖、遷移方面起重要作用。

3.2誘導(dǎo)骨肉瘤細胞的凋亡 EGFR可促進下游MAPK/ERK及PI3K/AKT/mTOR信號通路，刺激骨肉瘤細胞的增殖和分化，抑制凋亡[15]，而增加突變的EGFR或其配體，可以進一步促進EGFR自身的持續(xù)活化并促進腫瘤細胞增殖、分化。PKGⅡ發(fā)揮作用有賴于cGMP或cGMP類似物的激活。近來，有研究已經(jīng)證實了在真核細胞中存在環(huán)核苷酸cCMP和cUMP，它們可以激活PKGⅡ，使其以環(huán)核苷酸依賴性方式磷酸化特定的下游信號蛋白抑制腫瘤細胞的增殖、分化，誘導(dǎo)腫瘤細胞的凋亡[17-19]。另有研究發(fā)現(xiàn)，用PKGⅡcDNA感染的MG-63細胞，經(jīng)過8-pCPT-cGMP活化后的PKGⅡ，能夠明顯逆轉(zhuǎn)EGFR上述作用，從而誘導(dǎo)骨肉瘤細胞的凋亡[9]，這也進一步證明了PKGⅡ可以通過阻斷EGFR相關(guān)通路誘導(dǎo)骨肉瘤細胞的凋亡，有望發(fā)揮抗腫瘤作用。

3.3抑制EGF誘導(dǎo)的EGFR相關(guān)蛋白及其下游信號通路 研究發(fā)現(xiàn)，用PKGⅡ轉(zhuǎn)染MG-63人骨肉瘤細胞可以降低EGFR的表達[15]，進而抑制EGFR下游的PI3K/AKT和ERK途徑的激活[20]。KOUSTAS等[21]發(fā)現(xiàn)PI3K/AKT/mTOR途徑是EGFR的下游，其活化可促進腫瘤細胞生長并抑制凋亡。研究發(fā)現(xiàn)AKT作為EGFR下游和mTOR上游關(guān)鍵因子，參與調(diào)節(jié)癌細胞代謝和存活，PKGⅡ可通過阻斷EGF/EGFR觸發(fā)的PI3K/AKT和MAPK/ERK介導(dǎo)的途徑來抑制癌細胞的活化，提示PKGⅡ可能是一種潛在的抗癌因子，有可能成為新型潛在的EGFR抑制劑[22]。

然而，PKGⅡ究竟如何作用于EGFR，是通過直接磷酸化抑制 EGFR核轉(zhuǎn)位，還是通過某種中間通路尚不明確，其次EGFR的作用靶點及其下游介導(dǎo)的多種蛋白表達和功能仍有待進一步研究。

3.4抑制腫瘤血管的生成 骨肉瘤是富含血管的實體瘤，腫瘤血管的生成在其生長、侵襲和轉(zhuǎn)移過程中起到關(guān)鍵作用，因此，抑制腫瘤血管的生成具有相關(guān)治療前景[23]。研究發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)可促進血管內(nèi)皮細胞生成、刺激腫瘤血管形成、增加微血管通透性等功能，是腫瘤血管生成過程中最重要的傳導(dǎo)途徑之一[24]。CASCIO等[25]發(fā)現(xiàn)EGF與EGFR結(jié)合，通過EGF/ PI3K/STAT3信號傳導(dǎo)途徑上調(diào)兩種促血管生成因子VEGF和瘦素的表達， 從而促進腫瘤血管生成。MINDER等[26]發(fā)現(xiàn)EGFR可調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境并誘導(dǎo)VEGF和白細胞介素(IL)-8的持續(xù)生成，而IL-8介導(dǎo)的嗜中性粒細胞可以釋放基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-9，進一步促進VEGF的持續(xù)釋放及其介導(dǎo)的內(nèi)皮細胞形成血管效應(yīng)。最近，研究發(fā)現(xiàn)PKGⅡ與L-精氨酸(L-Arg)聯(lián)合可以通過阻斷EGFR相關(guān)通路的激活來抑制血管生成[27]。 因此，PKGⅡ可以通過阻斷EGF/EGFR下游相關(guān)通路，抑制腫瘤血管生成，但目前針對骨肉瘤的血管靶向治療效果并不理想，PKGⅡ/EGFR相關(guān)研究可能提供新的有效靶點，尚待進一步研究明確相關(guān)機制。

4 PKGⅡ/EGFR與腫瘤的相關(guān)研究

研究表明， PKGⅡ阻斷EGF-EGFR軸和下游MAPK、PI3K和PLC，逆轉(zhuǎn) EGF誘導(dǎo)的 FUBP1上調(diào)和MarvelD3的下調(diào)，在胃癌中發(fā)揮抗癌作用[28]。在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞研究中，cGMP激活的PKGⅡ可磷酸化SOX9、VASP并抑制AKT磷酸化，使得腫瘤細胞以cGMP依賴性方式停滯于G1期，從而對神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞增殖活動起到抑制作用[4]。此外，研究發(fā)現(xiàn)PKGⅡ可以通過MAPK/JNK通路促進乳腺癌細胞的凋亡[6]，發(fā)揮抗腫瘤作用。

大量研究表明，PKGⅡ/EGFR途徑與抗腫瘤作用密切相關(guān)，這使得針對PKGⅡ/EGFR的抗腫瘤研究非常重要。

5 PKGⅡ/EGFR作為靶點相關(guān)抗腫瘤研究

靶向性是腫瘤治療的關(guān)鍵所在，研究表明，舒林酸、硫化舒林酸能夠通過抑制5型磷酸二酯酶(PDE5)活性，增加細胞內(nèi)cGMP水平從而激活cGMP/PKG途徑抑制Wnt/β-catenin途徑，進而得以選擇性抑制結(jié)腸腫瘤細胞生長[29]。研究發(fā)現(xiàn)YC-1作為一種可溶性鳥苷酸環(huán)化酶(sGC)激活劑，可激活cGMP/PKG途徑，增加PKGⅡ表達水平，抑制EGFR和β-連環(huán)蛋白介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)途徑，而后兩者都與頭頸部鱗狀細胞癌(HNSCC)細胞存活和化療耐藥有關(guān)，增強順鉑在HNSCC細胞中的作用[30]。PhysakengoseG(PG)是從酸漿中分離出來的新型抗癌中藥活性成分，可通過EGFR/mTOR信號通路誘導(dǎo)細胞凋亡并抑制人骨肉瘤細胞中的自噬流，此外，PG還通過線粒體途徑誘導(dǎo)細胞凋亡并通過溶酶體功能障礙阻止自噬流，EGFR/AKT/mTOR也參與了這一過程[16]。EGFR靶向抑制劑主要是針對EGFR的單克隆抗體和酪氨酸激酶抑制劑，隨著腫瘤免疫治療研究變得越來越熱，嵌合抗原受體(CAR)T細胞即經(jīng)過遺傳修飾的T細胞，能夠消除表達突變EGFRvⅢ的腫瘤細胞，增加對腫瘤抗原的反應(yīng)性，已用于治療膠質(zhì)細胞瘤等腫瘤[31-32]。因此，PKGⅡ/EGFR有望成為抗骨肉瘤的潛在靶點，可進一步研究其在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用機制。

6 展 望

綜上所述，PKGⅡ能夠阻斷EGF/EGFR通路抑制骨肉瘤細胞的增殖、遷移，誘導(dǎo)凋亡，抑制骨肉瘤血管的生成，阻斷EGFR下游相關(guān)通路，發(fā)揮抗腫瘤作用，有助于進一步揭示骨肉瘤等惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展的分子機制。但目前仍有諸多問題待解決：(1)PKGⅡ抗癌機制尚不十分明確，PKGⅡ是否通過某種信號通路抑制EGFR發(fā)揮抗腫瘤作用，以及是否存在某種未知的PKGⅡ抗腫瘤新靶點；(2)EGFR目前雖在腫瘤中研究較多，并已應(yīng)用于臨床治療，但在骨肉瘤治療中是否有效，仍停留于細胞階段，暫無相關(guān)臨床治療應(yīng)用；(3)由于腫瘤發(fā)病機制十分復(fù)雜，單一靶點方式不足以有效抗腫瘤，因此可進一步研究骨肉瘤的作用機制，為PKGⅡ/EGFR等多靶點聯(lián)合治療的臨床轉(zhuǎn)化提供新的思路和理論依據(jù)。