周清元，王倩，葉桑，崔明圣，雷維，郜歡歡，趙愉風(fēng)，徐新福，唐章林，李加納，崔翠

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苯磺隆脅迫下油菜萌發(fā)期相關(guān)性狀的全基因組關(guān)聯(lián)分析

周清元，王倩，葉桑，崔明圣，雷維，郜歡歡，趙愉風(fēng)，徐新福，唐章林，李加納，崔翠

（西南大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物科技學(xué)院，重慶 400716）

【目的】研究苯磺隆殘留對油菜種子萌發(fā)的影響，運用全基因組關(guān)聯(lián)分析（genome-wide association analysis，GWAS）揭示苯磺隆脅迫下油菜萌發(fā)期相關(guān)性狀的遺傳因子和候選基因，探究油菜在苯磺隆逆境脅迫下的生理形態(tài)所反映的基因調(diào)控機制，為耐苯磺隆油菜品種的研究提供參考?！痉椒ā恳?41份甘藍型油菜品種（系）為材料、25 mg·L-1苯磺隆溶液為處理液、蒸餾水為對照進行發(fā)芽試驗。發(fā)芽7 d測定并計算相對發(fā)芽率、相對根長和相對鮮重。結(jié)合蕓薹屬60K SNP芯片分析群體基因型，通過STRUCTURE軟件和TASSEL軟件分別對該群體進行群體結(jié)構(gòu)分析以及親緣關(guān)系和LD衰減分析。為有效排除假關(guān)聯(lián)的影響，采用一般線性模型（GLM）和混合線性模型（MLM）中的6種模型進行比較，確定每個性狀GWAS分析的最優(yōu)模型。同時，利用TASSEL軟件在最優(yōu)模型下對241份材料的3個性狀分別進行全基因組關(guān)聯(lián)分析，根據(jù)關(guān)聯(lián)SNP位點的LD區(qū)間序列預(yù)測候選基因?！窘Y(jié)果】241份品種（系）群體可分為P1（94份材料）和P2（147份材料）2個亞群，其中約56.28%的材料之間的親緣關(guān)系值為0。全基因組關(guān)聯(lián)分析（K+PCA模型）共檢測到16個與性狀顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點，這些位點可解釋9.42%—13.14%的表型變異率。通過分析顯著SNP位點的LD區(qū)間與甘藍型油菜對應(yīng)的區(qū)間序列，篩選出25個候選基因可能與油菜耐苯磺隆有關(guān)，其中9個為細胞色素P450家族基因，5個參與谷胱甘肽合成或代謝過程，2個為多藥耐藥相關(guān)蛋白基因。同時發(fā)現(xiàn)與相對發(fā)芽率顯著相關(guān)的基因編碼谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶，參與毒素分解過程，在各種脅迫反應(yīng)中起重要作用。在相對根長和相對鮮重共同鑒定到的候選基因功能未知?！窘Y(jié)論】共檢測到16個SNP位點與耐苯磺隆性狀顯著關(guān)聯(lián)，篩選出25個候選基因可能與油菜耐苯磺隆有關(guān)。

油菜；萌發(fā)期；苯磺??；全基因組關(guān)聯(lián)分析

0 引言

【研究意義】苯磺隆作為一種磺酰脲類除草劑，可用于防除禾谷類和其他油料作物田中多種闊葉雜草[1-2]。雖然在推薦劑量下的使用較為安全[3]，但仍存在短期土壤殘留現(xiàn)象[4-5]，容易導(dǎo)致對除草劑敏感的作物死亡[6]。近年來，隨著油菜田闊葉雜草防除問題逐漸突出[7]，采用闊葉除草劑和抗耐性油菜品種相配合是解決雜草問題最為經(jīng)濟有效的方式[8]。種子萌發(fā)期是作物生長的關(guān)鍵階段，其發(fā)芽質(zhì)量的好壞直接影響作物的出苗率、作物的生長發(fā)育以及經(jīng)濟效益[9]。研究表明，不同品種（系）油菜萌發(fā)期對苯磺隆的耐性具有顯著性差異，利用苯磺隆對油菜種子的發(fā)芽性狀進行分析，篩選出萌發(fā)期對苯磺隆耐性極強的品種（系）是可行的[10]。因此，針對油菜萌發(fā)期耐苯磺隆進行相關(guān)遺傳因子研究和篩選耐性基因，對了解油菜苯磺隆響應(yīng)的分子機理、培育耐苯磺隆油菜品種具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】全基因組關(guān)聯(lián)分析（genome-wide association analysis，GWAS）是研究數(shù)量性狀的重要方法之一，在多種作物逆境脅迫下相關(guān)性狀遺傳機制的研究中有廣泛應(yīng)用[11-12]。隨著甘藍型油菜全基因組序列的公布及蕓薹屬60K SNP芯片的開發(fā)[13]，GWAS已成功地應(yīng)用于油菜復(fù)雜性狀的QTL檢測[14-19]。Chen等[14]對419個甘藍型油菜品種幼苗期進行GWAS分析，鑒定出32個與鎘積累性狀有關(guān)的候選基因。Wan等[15]在油菜種子苗期利用GWAS檢測到與4個耐鹽性狀相關(guān)的75個顯著SNP位點。Wei等[16]通過SNP性狀關(guān)聯(lián)和轉(zhuǎn)錄組測序分析，在347個油菜自交系的菌核病抗性中鑒定出24個基因。此外，研究者利用GWAS發(fā)現(xiàn)與油菜萌發(fā)活力[17]、含油量[18]、開花時間[19]等有關(guān)的顯著位點并預(yù)測候選基因。陳東亮等[20]從基因組水平分析油菜的草銨膦抗性，發(fā)現(xiàn)18個與草銨膦的滅生機制相關(guān)的候選基因。Zhang等[21]為研究苯達松和磺酰脲敏感性突變體BEL的遺傳性質(zhì)，使用生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建了水稻BEL位點的精細圖，并在限制區(qū)間內(nèi)發(fā)現(xiàn)5個基因。針對苯磺隆，近年來也相繼有報道。楊倩等[22]以對苯磺隆敏感和抗性的播娘蒿為試材，利用RNA-seq分析得到了35個與苯磺隆代謝相關(guān)的功能基因。同樣以播娘蒿為材料，Yang等[23]利用全局差異基因表達譜技術(shù)共鑒定出26個苯磺隆耐性差異表達的基因，并通過qRT-PCR驗證了其中8個基因。Gaines等[24]使用Illumina HiSeq進行RNA-seq發(fā)現(xiàn)4種基因（P450s、硝酸鹽單加氧酶、GST和GT）在黑燕麥代謝除草劑抗性方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。【本研究切入點】磺酰脲類除草劑苯磺隆一般用作苗床和芽后除草[25]，在油菜播前或移栽前使用將在土壤中造成殘留，這對油菜種子萌發(fā)存在著較大影響[10]，盡管前人通過資源篩選[26]、人工誘變[27]、轉(zhuǎn)基因育種[28]等方法篩選出耐苯磺隆油菜植株，但是關(guān)于油菜各生育時期，尤其是萌發(fā)期對苯磺隆耐性的遺傳機制和分子機理的研究較少?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究在前期篩選的適宜濃度的苯磺隆處理下，對遺傳來源不同的241份甘藍型油菜種質(zhì)進行發(fā)芽期耐苯磺隆特性鑒定，并借助覆蓋油菜全基因組的5.2萬個SNP標(biāo)記分別對相對根長、相對鮮重、相對發(fā)芽率進行全基因組關(guān)聯(lián)分析，以探究油菜在苯磺隆逆境脅迫下的生理形態(tài)所反應(yīng)的基因調(diào)控機制，為耐苯磺隆油菜品種的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗處理與性狀調(diào)查

241份甘藍型油菜品種由西南大學(xué)油菜中心收集并提供[10]，于室內(nèi)進行培養(yǎng)皿紙上發(fā)芽試驗。根據(jù)前期篩選的濃度，在鋪有2層濾紙的培養(yǎng)皿中加入3 mL濃度為25 mg·kg-1的苯磺隆溶液，蒸餾水作為對照，每皿均勻放置20粒已清洗的飽滿種子，3次重復(fù)。將培養(yǎng)皿置于溫度25℃、相對濕度為85%的人工培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，光照和黑暗時間為16 h/8 h。第7天統(tǒng)計種子發(fā)芽率，每皿隨機選取生長一致的10株幼苗分別測定根長和鮮重。參考王倩等[10]方法，分別計算每個品系的相對鮮重、相對根長和相對發(fā)芽率，并進行GWAS分析。采用Excel 2016軟件對表型數(shù)據(jù)進行初步整理，計算其平均數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)。

1.2 全基因組關(guān)聯(lián)分析

利用油菜基因組60 K Illumina Infinium SNP芯片對241份種質(zhì)基因型進行分析[14]，參照Xu等[19]方法篩選用于LD分析和關(guān)聯(lián)分析的SNP標(biāo)記。群體結(jié)構(gòu)由Structure 2.3.4軟件基于貝葉斯數(shù)學(xué)模型進行分析，并參照Wan等[15]確定最終亞群數(shù)目。親緣關(guān)系（relative kinship）K矩陣由Tassel 5.0軟件分析，其值為負時設(shè)為0[29]。利用軟件Tassel5.0估算群體內(nèi)連鎖不平衡（linkage disequilibrium，LD）的衰減[18]。使用一般線性模型（general linear model，GLM）和混合線性模型（mixed linear model，MLM）中6種模型進行關(guān)聯(lián)分析[19,30]。3個性狀的最優(yōu)模型根據(jù)Quantile- Quantile散點圖（QQ plot）在6種模型下的結(jié)果進行分析比較獲得，并在此基礎(chǔ)上繪制曼哈頓圖，顯示關(guān)聯(lián)分析檢測到的與目標(biāo)性狀顯著相關(guān)的標(biāo)記位點[31]。同時，負對數(shù)（1／N）作為顯著關(guān)聯(lián)SNP閾值，其中N是關(guān)聯(lián)分析中SNP的總數(shù)，本研究的閾值為4.5（-log10（1/32493））。

1.3 候選基因的預(yù)測

根據(jù)與性狀顯著關(guān)聯(lián)的SNP的位置左右延伸其所在染色體上2=0.2時的衰減距離，為候選基因的LD區(qū)間。利用法國公布的甘藍型油菜“Darmor-Bzh”的基因組注釋信息及TAIR網(wǎng)站對LD區(qū)間內(nèi)的候選基因進行功能注釋和分析[30]。

2 結(jié)果

2.1 表型統(tǒng)計分析

3個相對性狀均表現(xiàn)出廣泛的表型變異，其中（表1）相對根長變異幅度為0.050—0.588，平均值為0.136，變異系數(shù)為48.95%；相對鮮重變異幅度為0.411—2.357，平均值為0.980，變異系數(shù)為20.60%；相對發(fā)芽率變異幅度為0.333—1.000，平均值為0.942，變異系數(shù)為10.28%。結(jié)果（圖1）表明，3個性狀均呈連續(xù)性分布，符合數(shù)量性狀的特點，適合進行GWAS分析。

2.2 SNP標(biāo)記分析

將挑選出多態(tài)性和質(zhì)量較高的32 493個SNP標(biāo)記均勻分配到19條染色體，其中C04染色體上SNP標(biāo)記數(shù)目最多，為3 005個；而C09染色體上SNP標(biāo)記數(shù)目最少，為1 006個（表2）。這些SNP標(biāo)記涉及的堿基變化為A/T、T/C、A/G、A/C、T/G、T/A、C/G和G/C 8種類型，其中A/G和T/C類型最多，分別為11 691和10 864；而C/G和G/C類型最少，分別為109和114（圖2）。

表1 苯磺隆脅迫下相關(guān)性狀的表型統(tǒng)計

**表示在0.01水平差異顯著 **stand for significant at the 0.01 probability levels

圖1 3個相對性狀頻數(shù)分布圖

表2 SNP在染色體上的分布

圖2 32493個SNP堿基類型分布圖

2.3 群體結(jié)構(gòu)與親緣關(guān)系分析

選擇在染色體上均勻分布，且MAF大于0.3的10 655個SNP標(biāo)記分析群體材料間親緣關(guān)系和群體結(jié)構(gòu)。利用軟件Structure2.3.4對每個可能的K值模擬運算，當(dāng)K=2時，顯示△K有最大變化（圖3-A），這241份甘藍型油菜分為P1（94份材料）和P2（147份材料）2個亞群（圖3-B）。利用Tassel5.1.0軟件的Kinship模塊分析任意2個材料之間的親緣關(guān)系值（圖3-C），顯示約56.28%材料間的親緣關(guān)系值為0，約12.77%材料的親緣關(guān)系值在0—0.05，表明試驗群體材料間的親緣關(guān)系較遠，符合進行GWAS分析的要求。

2.4 連鎖不平衡在A、C基因組中的衰減

利用Tassel 5.1.0軟件分析已篩選的32 493個高密度SNP標(biāo)記來估算LD在甘藍型油菜A、C基因組中的衰減。從LD衰減散點圖（圖4）中可以看出A、C基因組的衰減距離各有不同，但2均隨著遺傳距離的增加而衰減。以決定系數(shù)（coefficient of determination）2=0.2作為閾值（表3），A基因組的平均衰減距離為170 kb，其中A08染色體的衰減速度最慢，衰減距離也是最大，約為550 kb；A02和A03衰減速度最快，衰減距離約為130 kb。C基因組的平均衰減距離為650 kb，其中C02的衰減距離約1 150 kb，明顯高于其他LD值，說明C02可能包含較多受人工進化選擇影響性狀的基因[32]；染色體C05的衰減距離最小約為270 kb。從中可看出甘藍型油菜A基因組衰退距離小于C基因組，說明A基因組可能發(fā)生了更多的重組，其遺傳變異更加豐富。

A：群體的?k值；B：群體結(jié)構(gòu)示意圖；C：親緣關(guān)系分布

表3 連鎖不平衡在A、C基因組中的衰減距離

A：A基因組的LD衰減距離；B：C基因組的LD衰減距離 A: LD decline A genome; B: LD decline C genome

2.5 苯磺隆脅迫下油菜萌發(fā)期相關(guān)性狀的6種模型比較

采用基于一般線性模塊的GLM、Q和PCA模型和混合線性模塊的K、Q+K和PCA+K共6種模型來進行關(guān)聯(lián)分析[19]。通過比較6種模型下Q-Q圖的分布發(fā)現(xiàn)（圖5），在3個性狀中，與GLM模型相比，MLM模型下的K、K+Q和K+PCA模型均能較好地控制假陽性，但K+PCA模型檢測到值更接近期望值，因此選用K+PCA作為3個相對性狀的最優(yōu)模型來尋找關(guān)聯(lián)位點。

2.6 全基因組關(guān)聯(lián)分析

全基因組關(guān)聯(lián)分析表明（表4），與相對根長顯著關(guān)聯(lián)的SNP標(biāo)記共檢測到6個，分布于染色體A03、A05、C02、C03和C06上，可解釋10.35%—12.22%的表型變異（圖6-A）。與相對鮮重顯著關(guān)聯(lián)的SNP標(biāo)記共檢測到6個，分別位于A01、C02、C03和C04染色體上，這些位點可解釋9.42%—11.66%的表型變異率（圖6-B）。與相對發(fā)芽率顯著關(guān)聯(lián)的SNP標(biāo)記共檢測到4個，分別位于A04、A07、C02和C09染色體上，這些位點可解釋10.95%—13.14%的表型變異率（圖6-C）。

2.7 候選基因預(yù)測

通過對甘藍型油菜3個相對性狀的全基因組關(guān)聯(lián)分析，利用已公布的甘藍型油菜基因組測序結(jié)果，將與各性狀顯著關(guān)聯(lián)的SNP標(biāo)記定位到油菜的基因組上，基于甘藍型油菜參考基因組序列，對LD區(qū)間的候選基因進行分析，篩選出了25個與苯磺隆耐性相關(guān)性狀有關(guān)的候選基因（表5）。

A：相對根長；B：相對鮮重；C：相對發(fā)芽率

A：相對根長；B：相對鮮重；C：相對發(fā)芽率

對相對根長的全基因組關(guān)聯(lián)分析，找到了8個與耐性機制有關(guān)的候選基因。在C02染色體上的基因、和分別與擬南芥基因、和同源，均為細胞色素P450基因家族成員。A03染色體上的基因和C06染色體上的基因分別與擬南芥基因和同源，前者是松柏醇葡糖基轉(zhuǎn)移酶，后者是谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶家族蛋白成員，均參與對有毒物質(zhì)的反應(yīng)。A05染色體上的基因與擬南芥基因同源，是一種bHLH轉(zhuǎn)錄因子。位于C02染色體上的基因的擬南芥同源基因，是糖基轉(zhuǎn)移酶家族蛋白成員。在C02染色體上的基因和分別與擬南芥基因和同源，均參與植物生長發(fā)育中非生物脅迫的調(diào)控。

掃描與相對鮮重顯著關(guān)聯(lián)SNP標(biāo)記的LD區(qū)域，找到了9個與抗性機制有關(guān)的候選基因。在A01染色體上的基因與擬南芥基因同源，為木瓜蛋白酶家族半胱氨酸蛋白酶。C02染色體上的基因和擬南芥基因同源，的擬南芥同源基因響應(yīng)于毒性物質(zhì)。位于C03染色體上的基因和擬南芥基因同源，參與防御反應(yīng)的負調(diào)控。C04染色體上的基因、和C03染色體上的基因分別與擬南芥基因、和同源，均為細胞色素P450家族成員。C03染色體上的基因和的擬南芥同源基因和分別參與編碼谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶和谷胱甘肽生物合成。

表4 苯磺隆脅迫下相關(guān)性狀的顯著關(guān)聯(lián)標(biāo)記

在與相對發(fā)芽率關(guān)聯(lián)的SNP位點的LD區(qū)域找到了8個與苯磺隆耐性機制有關(guān)的候選基因。在A07染色體上找到的基因和分別與擬南芥中的基因和同源，屬于ABC轉(zhuǎn)運蛋白的多藥抗性相關(guān)蛋白（MRP和ABCC）亞家族的基因。C09染色體上的基因、和C02染色體上的基因分別與擬南芥基因、和同源，均為細胞色素P450基因家族。C02染色體上的基因在擬南芥中的同源基因與UDP-葡糖基轉(zhuǎn)移酶有關(guān)。C02染色體上的基因和C09染色體上的基因分別與擬南芥基因和同源，參與谷胱甘肽代謝過程。

3 討論

3.1 苯磺隆脅迫下的萌發(fā)期鑒定

苯磺隆是中國麥田廣泛使用的闊葉除草劑之一，屬乙酰乳酸合成酶（acetolactate synthase，ALS）抑制劑類除草劑家族，具有殺草譜廣、活性高、選擇性強，對哺乳動物毒性低等優(yōu)點[1]，是世界上使用最多的一類除草劑[2]。油菜對苯磺隆較敏感，生產(chǎn)上油菜田直接利用苯磺隆化學(xué)除草較少，但是在耐廣譜除草劑草甘膦雜草日益增多[51]且胺苯磺隆等使用殘留藥害重的情況下[7]，苯磺隆與單子葉除草劑混合使用可以用于油菜播前苗床地或者大田移栽前除草[8]。因苯磺隆主要作用在雜草的莖葉，對未萌發(fā)的雜草影響較小，因此多數(shù)研究集中在作物苗期或者成株期[25,51]，很少關(guān)注苯磺隆殘留對后茬作物種子萌發(fā)的影響，尤其是對其敏感的闊葉型作物種子萌發(fā)的影響。王正貴[4]和杜慧平等[5]研究表明，苯磺隆在麥田土壤中的降解半衰期為10 d左右。Dowsett等[52]研究表明在低pH土壤中噴施苯磺隆28 d后種植飼料甜菜生長活力最好，在高pH土壤中即使試驗期長達56 d甜菜生長也較差。苯磺隆一方面可以作為油菜田潛在的闊葉型除草劑[8,26]并在播種或者移栽前進行除草[28]，另一方面也是油菜化學(xué)殺雄劑主要的組成成分[53]，篩選對苯磺隆耐性極好的種質(zhì)在生產(chǎn)和雜種配制等方面具有非常重要的意義。針對這種情況，根據(jù)苯磺隆田間用量及其在土壤中的衰減，設(shè)計濃度梯度進行脅迫濃度篩選，最后篩選了25 mg·kg-1（相當(dāng)于田間除草劑使用濃度的1/10）作為種子萌發(fā)期的脅迫濃度，并以該濃度處理241份油菜種子，篩選出3個苯磺隆耐性較強種質(zhì)，并認為綜合分析相對根長、相對鮮重、相對發(fā)芽率可評價油菜種質(zhì)資源萌發(fā)期耐性[10]。因此本文根據(jù)這三個指標(biāo)性狀進行苯磺隆殘留脅迫下油菜萌發(fā)期GWAS候選基因挖掘。雖然有研究[54-55]表明植物在非生物脅迫下幼苗期耐受性優(yōu)于萌發(fā)期，但是由于基因表達的時空特點，這些萌發(fā)期苯磺隆耐性較好的種質(zhì)是否在苗期或者成株期具有相同的表現(xiàn)，還有待于驗證。

表5 苯磺隆耐性相關(guān)性狀的候選基因

3.2 關(guān)聯(lián)分析與候選基因

不同的分析模型影響關(guān)聯(lián)分析的結(jié)果[11-14,30]。為確保關(guān)聯(lián)結(jié)果的準(zhǔn)確性，最大程度降低假陽性結(jié)果，GWAS前要對每個性狀進行最優(yōu)模型的選擇。Xu等[19]在油菜開花的全基因組關(guān)聯(lián)分析中發(fā)現(xiàn)，K+PCA模型能更好地降低假陽性的發(fā)生。本研究對每個性狀進行了6種模型的分析，發(fā)現(xiàn)包括K模型，PCA+K模型和Q+K模型在內(nèi)的MLM模型可顯著降低值，而K+PCA模型能更好地控制3個性狀的假陽性。

植物耐受苯磺隆除草劑主要與ALS基因突變和非靶標(biāo)酶代謝解毒能力有關(guān)，其中最常見的酶分別是谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶GSTs和UDP依賴性糖基轉(zhuǎn)移酶（UGTs）；最常見的代謝反應(yīng)包括P450s的氧化和羧化酯酶的水解，以及通過多藥耐藥相關(guān)蛋白（MRP）家族的載體的代謝反應(yīng)[51,56]。本研究所篩選到的25個候選基因大多與細胞色素P450酶系及谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶活性有關(guān)。雖然本研究沒有定位到ALS突變位點，但是不能簡單地認為241份材料沒有ALS突變基因，由于GWAS分析結(jié)果與基因表達引起的性狀效應(yīng)值大小有關(guān)，ALS基因如果在萌發(fā)期的相對鮮重、相對根長、相對發(fā)芽率3個指標(biāo)性狀中表達引起的表型值較小，那么在GWAS分析中就無法檢測。有研究表明播娘蒿抗性水平大小與ALS基因表達量多少無關(guān)[51]。Délye等[57]通過比較除草劑敏感性生物測定與基因分型，其結(jié)果顯示具有抗性的植物中約75%的植物是通過增加除草劑代謝而具有抗耐性，揭示了非靶位點抗性的重要性。本研究發(fā)現(xiàn)在A07染色體上2個標(biāo)記相距很近的和為多藥耐藥相關(guān)蛋白（MRP）家族，其作為ATP依賴的輸出泵可對谷胱甘肽結(jié)合物和葡萄糖醛酸化起作用[58]。前人研究表明大豆的[59]、菊芋的[60]、小麥的[61]以及煙草的和[62]均為可降解除草劑的植物P450酶系，證明了植物細胞色素P450酶系參與了對許多除草劑的代謝和解毒作用。本研究在C02、C03、C04、C09染色體上篩選的9個基因均為細胞色素P450基因家族成員，其中的擬南芥同源基因僅在根組織中顯著表達。Cummins等[63]研究發(fā)現(xiàn)使用除草劑安全劑處理可增強小麥中涉及農(nóng)藥解毒的葡糖基轉(zhuǎn)移酶和O-甲基轉(zhuǎn)移酶的表達活性，降低了作物對除草劑的敏感性。Riechers等[64]通過提高GST酶的活性來刺激除草劑在植物中的代謝反應(yīng)，表明GST蛋白在各種解毒過程中有重要作用。Cummins等[65]研究發(fā)現(xiàn)通過轉(zhuǎn)基因表達的擬南芥對一些除草劑具有一定的耐受性，其抗耐性的產(chǎn)生是由于谷胱甘肽、花青素和類黃酮的積累增加而產(chǎn)生。研究證明P450s和GSTs可由多種非生物刺激誘導(dǎo)，對于保護植物免受氧化損傷很重要[41,66]。本文篩選到C02染色體上的基因、C03染色體上的基因和C09染色體上的基因為谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶家族蛋白，編碼谷氨酸半胱氨酸連接酶，均參與谷胱甘肽的生物合成代謝過程并響應(yīng)多種逆境脅迫。有研究表明的擬南芥同源基因在擬南芥的耐鹽耐旱等脅迫中起著重要作用[47]，同時也有研究[67]表明該同源基因的表達被除草劑安全劑上調(diào)。此外，本研究在與3個性狀相關(guān)聯(lián)的SNP的LD區(qū)域找到5個擬南芥功能未知的的基因，其中在相對根長和相對鮮重中定位到C02染色體上相同基因位點，這些基因具有重要的挖掘價值，將成為下一步研究的重要內(nèi)容。

4 結(jié)論

掃描得到與相對根長顯著相關(guān)的SNP位點共6個，與相對鮮重相關(guān)的SNP位點共6個，與相對發(fā)芽率相關(guān)的SNP位點共監(jiān)測到4個，覆蓋了A、C基因組。共找到25個與苯磺隆耐性相關(guān)的候選基因，這些候選基因可能通過P450酶或者谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶活性的調(diào)控導(dǎo)致油菜對苯磺隆耐藥性的差異。

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ZHOU QingYuan, WANG Qian, YE Sang, CUI MinSheng, LEI Wei, GAO HuanHuan, ZHAO YuFeng, XU XinFu, TANG ZhangLin, LI JiaNa, CUI Cui

(College of Agronomy and Biotechnology, Southwest University, Chongqing 400716)

【Objective】To investigate the effect of residual tribenuron-methyl in soil on seed germination, genome-wide association analysis (GWAS) of 52157 SNPs with genome-wide coverage was used to identify the candidate genes for the germinating traits of rapeseed under tribenuron-methyl stress. The results of this study may provide a theoretical basis for tribenuron-methyl tolerance in oilseed rape.【Method】In the germination experiment, 241 rape varieties (lines) were treated with tribenuron-methyl solution of 25 mg·L-1, and distilled waterwas added to the control. At the 7th day of germination, the phenotypic data including relative germination rate, relative root length and relative fresh weight were measured and calculated. Using the TASSEL software, tribenuron-methyl tolerance related traits were explored inunder germination with a 60K Brassica Illumina?Infinium SNP array. Then, the structure of the population was analyzed by the software STRUCTURE, and the genetic relationship and LD attenuation were analyzed by the software TASSEL, respectively. In order to determine the optimal model for GWAS analysis of each trait, 6 models involved the general linear model and mixed linear model were used to analyze and compare the effects of group structure and relationship. The software TASSEL was employed to analyze the relative values of the 3 traits under the optimal model. Meanwhile, the candidate genes were predicted based on the LD interval sequence of the associated SNP locus. 【Result】The population structure analysis showed the population could be divided into two subgroups, P1 with 94 materials and P2 with 147 materials. Meanwhile, the result of genetic relationship analysis showed that about 56.28% of the materials had no kinship relationship. In the optimal GWAS model (K+PCA), we found that 16 SNP loci significantly associated with 3 traits including relative root length, relative fresh weight and relative germination rate, and each locus explained phenotypic variations ranging from 9.42% to 13.14%. By analyzing the LD interval of the significant SNP locus and the corresponding interval sequence of, twenty-five candidate genes related to tribenuron-methyl tolerance were screened out in the LD interval of these significant SNP loci, in which nine of them belonged to cytochrome P450 gene families, five were involved in glutathione synthesis or metabolic processes, and two were multidrug-tolerance associated protein. At the same time, it was revealed that the genesignificantly related to germination rate encodes glutathione transferase, which participates in the process of toxin decomposition and plays an important role in various stress responses. In addition,was identified at relative root length and relative fresh weight. However, its function was not clear. 【Conclusion】In this study, 16 SNP loci were detected to be significantly associated with tribenuron-methyl tolerance, and 25 candidate genes were screened out.

L.; germination; tribenuron-methyl tolerance; GWAS

10.3864/j.issn.0578-1752.2019.03.002

2018-09-17；

2018-11-17

國家重點研發(fā)計劃（2018YFD0100505）、現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-12）、重慶市社會事業(yè)與民生保障科技創(chuàng)新（cstc2015shmszx80026）

周清元，Tel：13883388890；E-mail：zhouqy2005@163.com。王倩，Tel：13251395292；E-mail：734747691@qq.com。周清元和王倩為同等貢獻作者。通信作者崔翠，Tel：13883787860；E-mail：cuigreeny@163.com

（責(zé)任編輯 李莉）